本发明涉及雪片莲水提物在调控成纤维细胞周期中的应用。
背景技术：
：在化妆品生产中，抗衰老的化妆品一直被人们所关注，这是因为针对抵御皮肤老化的问题是公众所关注的重点。保护皮肤、延缓皮肤衰老是很多人的梦想，因此抗衰老化妆品的开发和应用化妆品行业中的一个重要研究方向。皮肤表象的衰老反映在细胞水平即为细胞衰老。在老化的皮肤中，存在着因为成纤维细胞衰老而引起的细胞增殖减弱，胶原等细胞外基质成分合成不足甚至降解增加，导致真皮老化。因此，研究如何减缓成纤维细胞衰老进而延缓皮肤衰老具有深远的意义。雪片莲(leucojumvernum)是石蒜科雪花莲属，球根状草本植物，开有下垂的白色花朵。雪花莲具有鳞茎，叶线形，花茎直立，在花茎顶端著生有一朵花，钟形；花瓣六片，花瓣分为内外两层，内层与外层各有三片花瓣，外层的花瓣比内层的花瓣较长且较凸起。从休眠的雪花莲中提取的活性成分，植物休眠精华，具有类肉毒素的作用，抗皱平纹；通过促进超氧化物歧化酶(sod)的表达，提高皮肤自身抗氧化能力；适宜浓度的提取物能有效且长效地阻断肌肉-神经共培养体系中肌肉的收缩。对于雪片莲水提物的研究空间仍然很大。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中对雪片莲水提物在调控成纤维细胞周期方面的空白，提供了雪片莲水提物在调控成纤维细胞周期中应用。该雪片莲水提物使处于g1时期的成纤维细胞数量增长3.72％-31.44％。本发明提供了一种雪片莲水提物在调控成纤维细胞周期中的应用；所述的调控成纤维细胞周期为使成纤维细胞处于细胞周期g1周期的数量增长3.72％-31.44％。所述细胞周期g1周期是指细胞dna合成前期。一般说来，特定的成纤维细胞在一定的培养条件下处于细胞周期g1期的数量比例也是一定的。本发明通过对比使用及未使用雪片莲水提物的处于g1时期的成纤维细胞数量比例，说明了雪片莲水提物在调控成纤维细胞周期中的用途。且对于相同的成纤维细胞而言，雪片莲水提物的浓度越高，可使处于g1时期的成纤维细胞数量比例更高。本发明中，调控成纤维细胞周期一般均保证细胞活性正常。所述雪片莲水提物中的雪片莲优选夏雪片莲(leucojumaestivum)。所述雪片莲水提物是指雪片莲按照本领域常规的水提方法提取得到的提取物，本发明特别优选以下提取方法：将所述雪片莲(可为全株或鳞茎)，在水中粉碎，10℃～50℃(例如15℃～45℃)温度下提取40～60min(例如45min)，去除固体，稀释过滤即可；所述雪花莲在所述粉碎前进行清洗和/或剥皮。所述雪片莲可处于休眠期或非休眠期，进一步优选休眠期；休眠期是指植物体或其器官在发育的过程中，生长和代谢出现暂时停顿的时期，所述雪片莲的休眠期一般是冬季。所述粉碎可采用本领域的常规粉碎方法，优选采用粉碎机，粉碎机转速为25000～30000转/分钟，更佳的为29000转/分钟；所述粉碎时所述水或纯水的用量为所述雪片莲质量的5-7倍；所述粉碎时间由粉碎为匀浆状态确定。所述稀释时优选采用水和/或甘油作为溶剂。所述过滤优选采用0.2μm的过滤器进行过滤。在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用试剂和原料均市售可得。本发明的积极进步效果在于：(1)雪片莲水提物可调控成纤维细胞周期，使处于g1时期的成纤维细胞数量增多3.72％-31.44％；(2)雪片莲水提物在细胞中的浓度为3～0.5mg/ml，更佳为1.5mg/ml范围内没有细胞毒性；(3)雪片莲水提物细胞实验中，当恢复正常培养基培养后24h及48h后细胞活性正常，且可正常生长。附图说明图1为细胞周期试验中成纤维细胞样品在加样24h后细胞形态照片。图2为细胞周期试验中成纤维细胞样品在恢复正常培养24h后细胞形态照片。图3为细胞周期试验中成纤维细胞样品在恢复正常培养48h后细胞形态照片。具体实施方式下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明中，在成纤维细胞的培养过程中通过添加雪片莲水提取物，测定其细胞周期，再将雪片莲水提取物撤离正常培养，继续测定细胞周期和细胞活性，观察细胞是否受损。如果在保证细胞活性正常的情况下处于细胞周期g1时期的细胞数目增多，可有效反应雪片莲水提物调控成纤维细胞周期的作用。1、夏雪片莲水提物的制备清洗处于休眠期的夏雪片莲植株，并对其进行剥皮。在纯水(6倍的雪片莲质量)中粉碎鳞茎(粉碎机转速为29000转/min)，时间为3h，直到形成匀浆状态。在25℃的温度下，螺旋搅拌提取45min，通过倾析祛除粗固体。再进行细固体的祛除(100℃左右加热浆液，倾析液相提取物至新的清洁容器，通过流速5kg/min的盘式离心机离心获得。)。在水中稀释以获得10mg/l(即每升水中含有10mg的固体鳞茎)的质量，提取物使用0.2μm的过滤器过滤，最终的提取物的颜色为浅黄色。2、细胞培养及加样处理细胞培养：人成纤维细胞al15012lf-p2使用完全培养基(dmem，10％fcs，1％p/s)在37℃的5％co2细胞培养箱培养，至90％汇合时，消化种板。细胞毒性实验：al15012lf-p35000/孔96孔板在37℃的5％co2细胞培养箱中培养48小时细胞周期实验：al15012lf-p30.1m/瓶t25细胞培养瓶在37℃的5％co2细胞培养箱中培养48小时细胞活性恢复mtt测定实验：al15012lf-p33000/孔96孔板在37℃的5％co2细胞培养箱中培养48小时样品及浓度：*每毫升水中含有固体鳞茎的质量加样：样品储备液(同上述1中方法所得的浅黄色提取物的水溶液，区别在于浓度，存储液浓度见上表)用培养基稀释100倍加到孔中细胞培养：细胞在含有待测样品的培养基中培养24小时培养基：dmem，2％fcs，1％p/s3、细胞毒性实验细胞与待测样品共培养24小时后，移除培养基，加入mtt0.5mg/ml，3小时后小心吸去上清，加入dmso，于550nm下进行检测；以0.25％十二烷基硫酸钠(sds)作为参照，定义样品孔为t，未处理孔为nt，以t与nt的比值(t/nt)≥90％视为无细胞毒性，比值＜90％视为有细胞毒性，实验结果如下表1所示：表1fb细胞活性(％相对于未处理孔)与对照sds(0.25％)明显有细胞毒性相比，样品(sf)在终浓度3～0.5mg/ml范围内没有细胞毒性，可使用此区间浓度继续进行后续实验。4、细胞周期实验细胞加样前，用不含血清的培养基处理12h，之后加样，细胞与待测样品共培养24小时后，消化离心收集细胞然后用pbs洗一次，之后用预冷的70％乙醇固定细胞，4℃放置固定过夜待染色；染色前将细胞从4℃冰箱取出，离心pbs洗一次，之后每管加500ul染液(pi50ug/ml，rnase100ug/ml)，充分混匀避光30min，即可上流式。在加样24h后，恢复24h及恢复48h这3个时间点进行细胞周期测定。实验结果如下表2、表3、表4所示：(1)加入样品24h的细胞周期表2样品编号freq.g1freq.(s+g2)sf-394.44％6.48％sf-479.76％18.19％sf-574.52％22.38％nt71.85％24.37％如表2所示，加入雪片莲水提物样品24h后的细胞周期与未加入雪片莲水提物样品nt(71.85％)相比，sf-3～5的g1期的细胞数量范围为94.4％～74.52％，可知随着加入雪片莲水提取物的浓度不断提高，细胞进入g1期的比率加大，使处于休眠期的细胞数目增多。(2)加入样品24h后恢复正常培养基24h的细胞周期表3样品编号freq.g1freq.(s+g2)sf-385.65％7.06％sf-485.04％8.98％sf-585.36％7.64％nt85.45％13.88％(3)加入样品24h后恢复正常培养基48h的细胞周期表4样品编号freq.g1freq.(s+g2)sf-388.46％6.74％sf-488.54％5.04％sf-588.11％4.70％nt88.65％3.07％如表3、4所示，恢复正常培养基培养24h后的细胞周期为未处理孔nt以及sf3-sf5的g1均在85％附近，恢复正常培养基培养48h后的细胞周期为未处理孔nt以及sf3-sf5的g1均在88％附近，可知恢复正常培养后细胞的生长没有受到影响，可以正常生长，(见附图1-3，图1-3中a、b、c、d分别对应样品编号sf-3、sf-4、sf-5和nt。图片获得方式：倒置显微镜，显微镜型号olympusckx53，目镜x物镜＝10x10)。细胞的形态生长状况均正常，细胞仍具有正常增殖能力。由图1-3可以知，与nt相比，其他三个浓度处理过后细胞与nt的细胞一样生长状态均良好，均呈规则的梭型，没有不良状况，比如细胞皱缩，漂浮之类的现象，可知处理后无细胞毒性，细胞能正常生长。以上实验结果显示，从细胞周期上看，当加入雪片莲水提取物样品后，雪片莲水提物会干预细胞周期的分布，使成纤维细胞进入g1时期的比例增高，从而调控细胞的细胞周期。5、细胞活性恢复mtt实验细胞与雪片莲水提取物样品共培养24小时后，移除原培养基，加入正常的完全培养基培养，然后用mtt方法测恢复正常培养基培养后24h及48h的细胞活性，见表5、表6；(mtt方法参照细胞毒性)定义样品孔为t未处理孔为nt，以t与nt的比值(t/nt)≥90％视为细胞活性正常。表5恢复24h样品编号ntsf-3sf-4sf-5fb细胞活性(％)100106.8124.87118.54表6恢复48h样品编号ntsf-3sf-4sf-5fb细胞活性(％)100106.8124.87118.54当前第1页12