抗肝纤维化的中成药的制作方法

本发明涉及中成药物技术领域，尤其是一种抗肝纤维化的中成药。

背景技术：

肝纤维化是由于各种原因引起肝细胞损伤,激活肝星状细胞，使其转变成为肌纤维母细胞，炎症因素、毒素等刺激损伤及再生的肝细胞、Kupffer细胞、窦内皮细胞、自然杀伤 (NK)细胞产生免疫介质和细胞因子,并且以自分泌或旁分泌的方式作用于靶细胞受体, 使肌纤维母细胞增殖,合成大量的细胞外基质（ECM），细胞外基质增生与降解失衡，纤维结缔组织在肝脏内部的出现过多沉积，肝脏的正常的组织结构出现紊乱，从而肝脏的正常的功能也出现异常，肝纤维化是各种慢性肝脏疾病的共同病理过程。肝纤维化是可逆的，这促使广大中医学工作者对肝纤维化阶段进行了各种研究和尝试，尽可能在此阶段或者肝硬化早期进行肝纤维化的逆转，防止向肝硬化晚期及肝癌的发展。磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激(PI3K/Akt)信号通路与肝纤维化发生、发展过程中的肝星状细胞活化及增殖、凋亡及迁移，还有细胞外基质的分泌紧密相关。PI3K/Akt信号通路参与肝纤维化的发生与发展：被激活的PI3K/Akt信号通路，可通过调节HSC增殖和迁移以及增加Ⅰ型、II型胶原的表达水平来促使肝纤维化形成；相反，阻断PI3K/Akt信号通路的激活，则可诱导HSC凋亡，促进ECM 的降解，进而延缓了肝纤维化发生发展的进程。肝病患者病情不断向前进展的主要因素是炎症的不断发生，并进一步使损失的肝脏在肝纤维化不断发展的基础上向着肝硬化进展，故通过PI3K/Akt信号通路来调节肝星状细胞的活化、肝脏细胞外基质的产生和降解及肝窦毛细血管化，以达到减少肝脏内炎症反应的作用，从而发挥抗肝纤维化作用，进而延缓肝病患者病情发展，在一定程度上也可控制甚至逆转肝硬化的病情发展。中国传统的中医中药对肝纤维化有一定疗效，但因肝病疗程长、中药汤剂服用不便，病人难以坚持。进十几年来，市面上出现了各种各样用于治疗肝病的中成药，如中国专利“乙肝转阴散”，公开号为CN 1194849，该转阴散主要针对乙肝病毒控制环节，兼具抗肝纤维化功效，随着西药在抗病毒上发挥的主导作用，“乙肝转阴散”作为一个众多药物组成的制剂，在抗病毒治疗上的优势上已逐渐下降。

技术实现要素：

本发明所要解决的问题是提供一种具有温阳利湿、化瘀散结作用，从而发挥抗肝纤维化作用的中成药。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：它由以下重量份的组分制备而成：熟地黄60份～100份、山茱萸20份～60份、山药20份～50份、泽泻20份～50份、茯苓20份～60份、丹皮20份～50份、肉桂5份～20份、附子5份～25份、车前子10份～40份、牛膝10份～50份、鳖甲12份～40份、三七2份～5份。

上述技术方案中，更具体的方案还可以是：所述各组分的重量份如下：

熟地黄85份、山茱萸35份、山药35份、泽泻35份、茯苓35份、丹皮35份、肉桂15份、附子15份、车前子25份、牛膝25份、鳖甲30份、三七5份。

进一步的：所述各组分的重量份如下：

熟地黄80份、山茱萸40份、山药40份、泽泻30份、茯苓30份、丹皮30份、肉桂10份、附子10份、车前子20份、牛膝20份、鳖甲25份、三七3份。

进一步的：所述各组分的重量份如下：

熟地黄60份、山茱萸20份、山药20份、泽泻20份、茯苓20份、丹皮20份、肉桂5份、附子5份、车前子10份、牛膝10份、鳖甲12份、三七2份。

进一步的：所述各组分的重量份如下：

熟地黄100份、山茱萸60份、山药50份、泽泻50份、茯苓60份、丹皮50份、肉桂20份、附子25份、车前子40份、牛膝50份、鳖甲40份、三七5份。

进一步的：该中成药的剂型为散剂、丹剂、蜜丸、胶囊或水丸。

药理分析：

调节免疫：①地黄水提物中分离得到的地黄低聚糖可明显增强荷瘤小鼠淋巴细胞的增殖反应及ConA诱导的增殖反应。另外有报道地黄多糖可明显拮抗衰老模型小鼠胸腺及脾脏的萎缩,甚至使其免疫器官有关指标如胸腺皮质厚度及细胞数、脾小结及淋巴细胞数超过正常水平,显示有较好的免疫兴奋作用。②山茱萸水煎剂腹腔注射使小白鼠胸腺明显萎缩。③连续7天腹腔注射山药水煎液,结果表明山药可显著增加小鼠的脾脏重量。④茯苓多糖灌胃增强小鼠巨噬细胞吞噬功能，增加ANAE阳性淋巴细胞数,还能使小鼠脾脏抗体分泌细胞数明显增多。表明茯苓多糖具有抗胸腺萎缩及抗脾脏增大和抑瘤生长的功能。⑤泽泻水煎剂能显著抑制小鼠碳粒廓清速度，还有降血糖、抗脂肪肝、抑制血液凝固、降血脂等作用。⑥附子注射液可提高小鼠体液免疫功能及豚鼠血清补体含量，但对小鼠血清溶菌酶活性无明显影响；以玫瑰花结形及细胞转化实验研究了机体细胞免疫的影响，发现附子注射液可使T细胞和玫瑰花结形的形成细胞明显上升。⑦用体内、外的方法，发现牛膝多糖在体外可以提高老年小鼠T淋巴细胞的增殖能力和IL-2的分泌；体内能显著提高老年大鼠T淋巴细胞和血清中TNF-β或INF-a及NO的产生和NOS的活性,降低其SIL-2R的产生。

抗炎保肝：①实验研究证明牡丹皮总甙对卡介苗与脂多糖联合诱导小鼠产生的免疫性肝损伤有保肝作用。②怀牛膝水提物对CCL4引起的小鼠SGPT升高有明显降低作用，能促进正常小鼠肝糖元生成。③桂皮油不仅能促进唾液及胃液分泌,增强消化功能,并能解除内脏平滑肌痉挛、缓解肠道痉挛性疼痛。应用小鼠压尾刺激或腹腔注射醋酸的扭体运动的方法证明桂皮醛有镇痛的作用，此外，还有抗菌、抗溃疡、抗肿瘤等药理作用。④车前子煎液能明显降低皮肤及腹腔毛细血管的通透性,降低红细胞膜的通透性,表明车前子具有一定的抗炎作用。⑤现代药理研究发现其主要成分有三七总皂苷（PNS）、三七素（三七氨酸）、黄酮、挥发油、氨基酸、糖类及各种微量元素等。相关研究表明，三七还具有抗肝损伤作用。PNS对CCl4肝损伤小鼠可显著降低血清谷丙转氨酶，也能明显改善酒精引起的肝组织的脂肪变和炎症程度，减轻肝组织损伤，其具有抗肝纤维化的作用，可使二甲基亚硝胺中毒大鼠肝细胞变性坏死减少，肝细胞间胶原纤维减少。⑥现代研究发现，鳖甲及其复方制剂广泛应用于治疗慢性肝病预防肝硬化。文献报道，鳖甲煎煮液能有效地预防和治疗大鼠肝纤维化，其作用机制可能是通过抗脂质过氧化改善肝组织病理改善肝功能调控细胞因子水平等而发挥抑制HSC激活增殖及ECM合成分泌促进ECM降解吸收等综合作用，阻断和治疗肝纤维化。

本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：

本抗肝纤维的中成药是根据肝病多具有发于外感湿热疫毒、内伤气血阴阳，久则必夹瘀夹痰夹湿的病因病机的特点，而肝病患者在其既往的慢性疾病基础，其病机已是正气亏虚，故而表现多为寒热虚实错杂之阳虚夹瘀的病机特点，确定了以温阳化瘀为法的抗肝纤维化的中成药的药物组成，使得该抗肝纤维化中成药具有温阳利湿、化瘀散结的作用。

本抗肝纤维的中成药以小剂温阳药置于十倍之滋阴利水剂之中，恰似坎卦一阳爻藏于两阴爻之中，取象于火涵水中，藏而不露。又以山药厚其土以藏之，山茱萸敛其气以秘之，泽泻、丹皮、茯苓引亢火以归之，车前子、牛膝以消阴翳。如此则肾复其封蛰之职，水中之火，不亢不衰，缓缓蒸腾，温养五脏六腑，而不蓄水。充分体现了水火既济之象，在温补肾阳的同时兼起到化湿之功效。同时加入鳖甲以平旰熄风、软坚散结及小剂量三七活血化瘀、血行气行。以上药物制成中成药，具有温阳利湿、化瘀散结之功效，从而发挥抗肝纤维化作用。

附图说明

图1是本发明各组大鼠肝组织HE染色镜下表现（HE染色×200）图（空白对照组）。

图2是本发明各组大鼠肝组织HE染色镜下表现（HE染色×200）图（模型组）。

图3是本发明各组大鼠肝组织HE染色镜下表现（HE染色×200）图（抗肝纤维化的中成药低剂量组）。

图4是本发明各组大鼠肝组织HE染色镜下表现（HE染色×200）图（抗肝纤维化的中成药高剂量组）。

图5是各组大鼠肝组织中Akt1表达情况（免疫组化×400）图（空白组Akt）。

图6是各组大鼠肝组织中Akt1表达情况（免疫组化×400）图（模型组Akt1）。

图7是各组大鼠肝组织中Akt1表达情况（免疫组化×400）图（抗肝纤维化的中成药低剂量组Akt1）。

图8是各组大鼠肝组织中Akt1表达情况（免疫组化×400）图（抗肝纤维化的中成药高剂量组Akt1）。

图9是各组大鼠肝组织中Akt1表达情况（免疫组化×400）图（空白组p-Akt1）。

图10是各组大鼠肝组织中Akt1表达情况（免疫组化×400）图（模型组p-Akt1）。

图11是各组大鼠肝组织中Akt1表达情况（免疫组化×400）图（抗肝纤维化的中成药低剂量组p-Akt1）。

图12是各组大鼠肝组织中Akt1表达情况（免疫组化×400）图（抗肝纤维化的中成药高剂量组p-Akt1）。

图13是各组大鼠肝组织中HSC凋亡情况（TUNEL法×400）图（空白对照组）。

图14是各组大鼠肝组织中HSC凋亡情况（TUNEL法×400）图（模型对照组）。

图15是各组大鼠肝组织中HSC凋亡情况（TUNEL法×400）图（抗肝纤维化的中成药低剂量组Akt1）。

图16是各组大鼠肝组织中HSC凋亡情况（TUNEL法×400）图（抗肝纤维化的中成药高剂量组Akt1）。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详述，但本发明的技术范围不受这些实施例限定。以下所有配比量都以重量百分比计算。

一、具体实施例部分

实施例1：

本实施例的中成药采用如下质量的组分制成：熟地黄80g、山茱萸40g、山药40g、泽泻30g、茯苓30g、丹皮30g、肉桂10g、附子10g、车前子20g、牛膝20g、鳖甲25g，三七3g。

制作方法为：将以上组分的药物加水煎煮，收集提取液，将提取液过滤、浓缩，得到浓缩液，将该浓缩液进行喷雾干燥，得到干浸膏，再把干浸膏粉碎，得到浸膏粉，再添加一些常用辅料制粒。

实施例2：

本实施例的中成药采用如下质量的组分制成：熟地黄85g、山茱萸35g、山药35g、泽泻35g、茯苓35g、丹皮35g、肉桂15g、附子15g、车前子25g、牛膝25g、鳖甲30g、三七5g。

其制作方法与实施例1相同。

实施例3：

本实施例的中成药采用如下质量的组分制成：

熟地黄60g、山茱萸20g、山药20g、泽泻20g、茯苓20g、丹皮20g、肉桂5g、附子5g、车前子10g、牛膝10g、鳖甲12g、三七2g。

其制作方法与实施例1相同。

实施例4：

本实施例的中成药采用如下质量的组分制成：

熟地黄100g、山茱萸60g、山药50g、泽泻50g、茯苓60g、丹皮50g、肉桂20g、附子25g、车前子40g、牛膝50g、鳖甲40g、三七5g；

其制作方法与实施例1相同。

二、实验部分：

1、动物实验的设计与实验结果

1.1实验材料

SD雌性大鼠50只，体重(250±50)g，由广西医科大学实验动物中心提供。在有通风条件的动物饲养房饲养，分笼喂养，室内湿度维持在(60土10)%，室温维持在(25.0±1.0)℃，以普通大颗粒饲料为食物和自来水为饮用水，每周2次更换鼠笼内垫料，每日加食1次，换水1次。实验正式开始前，适应性饲养大鼠1周。

1.2药物制备

抗肝纤维化的中成药药液的配制：高剂量的配制：取实施例1所得颗粒，加纯净水溶解，配成0.254g/mL的药液，即大鼠给药量0.508ml/100g。低剂量的配制：取实施例1所得颗粒，加纯净水稀释成0.06g/mL的药液，即大鼠给药量0.12ml/100g。配置好的中药液体，放在4℃储存备用，灌胃前提前取出药液，加热至常温后使用。

1.3主要试剂

四氯化碳(CCL4)分析纯，由汕头光华试剂厂生产。花生油，为金龙鱼牌食用花生油。按照花生油与四氯化碳容积比6:4配制成40%的CCL4花生油混合液备用。总胆红素（TBIL）、白蛋白（ALB）、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)检测试剂盒、透明质酸（HA）、层粘连蛋白（LN）、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C) 、Ⅲ型前胶原( PCⅢ)酶联试剂盒由北京北方生物技术研究所提供；兔抗大鼠多克隆Akt1及p-Akt1抗体购自美国Santa Cruz公司；免疫组织化学SABC试剂盒、DAB显色剂及TUNEL检测试剂盒均购自武汉博士德公司；丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸钠、过硫酸铵、甘氨酸均购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；PVDF膜及ECL化学发光试剂盒购自美国Millipore公司。

1.4实验方法

1.4.1实验动物造模

第一步：将50只雌性SD大鼠适应性饲养大鼠1周后，随机分为两组，即空白组与模型组：模型组40只大鼠，首次剂量以剂量为0.5mL/100g体质量，腹腔注射40%CCL4花生油溶液诱导肝纤维化模型，以后剂量为0.3mL/100g体质量, 每隔3d腹腔注射1次；空白组10只大鼠，予腹腔注射等量花生油溶液。所有大鼠均以普通饲料喂养及自由饮水，共造模6周。第二步：在造模的过程中，模型组共死亡1只大鼠。造模第4周末开始，每周随机从由CCL4花生油溶液诱导而成的肝纤维化模型大鼠中处死1只，于光镜下观察肝脏的病理学改变，第6周证实肝纤维化大鼠模型造模成功，第7周开始对各组实验动物灌胃给药。

1.4.2 实验动物分组与给药方法

除了空白组10只外，剩余的36只大鼠，随机分为3组，模型对照组12只，抗肝纤维化的中成药高剂量组12只，抗肝纤维化的中成药低剂量组12只。造模后空白对照组与模型组、抗肝纤维化的中成药高剂量组、抗肝纤维化的中成药低剂量组均予标准大鼠基础饲料喂养。按《动物与人体的每公斤体重剂量折算系数表》计算出大鼠模型实验所需用药剂量：空白对照组和模型对照组灌服纯净水；中药高剂量组灌服抗肝纤维化的中成药0.508ml /100g；中药低剂量组灌服抗肝纤维化的中成药0.12ml /100g。各组于造模成功后第7周开始灌胃给药，每天1次，至12周末结束。为了防止肝脏自然修复对实验结果的影响，除空白组外，其他3组于造模结束后仍每周1次腹腔注射40%CCL4花生油溶液，剂量为0.3mL/100g体质量。

1.4.3 标本提取

实验动物在第12周末末次给药后禁食过夜，次日称重后各组大鼠以10%水合氯醛，按0.4~0.5ml/100g的剂量腹腔注射进行麻醉，由腹正中线切皮，进入腹腔，分离腹主动脉，经腹主动脉采血，静置半小时后以3000r/min离心10min，收集血清，置于-80℃冰箱储存待测。在充分暴露游离肝脏后，迅速剪取同一部位适量的肝组织以预冷的生理盐水灌洗后放入4%多聚甲醛中固定，48h后，转移到0.1mol/L PBS溶液中保存，余下肝脏迅速分装入冻存管，于-80℃冰箱保存备用。

1.5实验指标检测

1.5.1 血清学指标

全自动生化分析仪检测血清谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、白蛋白（ALB）及放射免疫法检测血清透明质酸（HA）、 型前胶原（PC-）、型胶原（-C）和层粘连蛋白（LN），严格按照说明书进行操作。

1.5.2肝组织HE染色

HE染色步骤如下：切取部分肝脏姐织，将组织块切成约2mm的厚度，放入4%中性多聚甲醛溶液中固定，放在4℃冰箱过夜，进行脱水、透明，石蜡包埋。切成约5um的常规厚度，用二甲苯脱蜡，经各级酒精逐级脱水，二甲苯5min×2次，逐层酒精复水：100%酒精2min→95%酒精2min→80%酒精2min→75%酒精2min→50%酒精1min→30%酒精1min。用蒸馏水冲洗约1min，苏木素染色5min，自来水冲洗约1min，盐酸酒精分化30s，自来水浸泡5min，放于伊红液中约2min。最后常规脱水、透明，用中性树胶封片，置于显微镜下观察。

1.5.3肝组织免疫组织化学检测

切片常规脱蜡水化，3%H2O2封闭内源性过氧化物酶，微波修复抗原，加封闭液后，滴加兔抗大鼠Akt1及p-Akt1多克隆抗体(工作浓度为1:100)，4℃过夜。次日加生物素化羊抗兔IgG，在37℃孵育30min，加SABC工作液，DAB显色，苏木素复染。阴性对照以PBS缓冲液代替一抗。随机抽取5个高倍镜下视野，观察Akt1及p-Akt1阳性表达细胞数占细胞总数的百分比。

1.5.4Western blot检测肝组织中Akt1及p-Akt1表达情况

提取肝组织总蛋白，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质后，采用半干电转移将蛋白质分子转移到PVDF膜上，电转移结束后PVDF膜置于封闭缓冲液中室温下封闭1h。封闭完成后洗膜缓冲液洗膜3次，然后将PVDF膜与一抗稀释液(1:500)4℃封闭过夜。次日早上用洗膜缓冲液洗膜3次后，PVDF膜与二抗稀释液(1：1000)在室温下孵育1h，洗膜缓冲液洗膜3次后加入增强化学发光试剂A、B液各0.5mL，室温反应1min后暗室中将PVDF膜迅速封入保鲜膜中，Kodak X-ray film压片，放射自显影1min。然后进行显影、定影，清水冲洗晾干。

1.5.5TUNEL法检测细胞凋亡

胞质棕黄色的细胞为HSC，凋亡的HSC为胞质、胞核均呈棕黄色的梭型细胞。随机取5个不同高倍视野观察，计数胞质为棕黄色的HSC的数量和胞质、胞核均呈棕黄色的梭型凋亡细胞的数量，并计算凋亡细胞百分比，取5个视野的平均数作为凋亡指数，即：凋亡指数=凋亡细胞数/HSC数。

1.6统计学处理

采用SPSS18.0软件统计分析，实验数据以平均数±标准差表示，组间治疗前后比较用独立样本T检验进行分析，不同组间数据进行单因素方差分析，以P＜0.05具有统计学意义。

1.7实验研究结果

1.7.1大鼠一般情况

造模期间，空白对照组的大鼠进食饮水正常，体重稍有增加，毛发光泽，活动自如及反应灵敏。相比之下，模型组大鼠造模三天后便逐渐出现精神萎靡，活动及摄食均较前减少，表现为嗜睡或情绪易怒，毛发变黄，色泽暗淡，体重增长缓慢。造模过程中，有1只模型组大鼠死亡，原因考虑为CCl4腹腔注射的部位不当或注射角度过深导致腹腔组织的溃破诱发感染。在确认造模成功后，开始分组实验。在实验过程中，有6只大鼠死亡，分别为模型对照组2只大鼠因腹水死亡，抗肝纤维化的中成药低剂量组死亡2只，抗肝纤维化的中成药高剂量组死亡2只，其余大鼠未出现死亡。原因考虑为灌胃不当而损伤气管或肝损伤出现急性进展等原因。在灌胃治疗3周后，上述症状有所减轻，抗肝纤维化的中成药高剂量组及抗肝纤维化的中成药低剂量组的纳差、嗜睡、易怒等表现有所好转。模型组大鼠的上述症状并未减轻。而在灌胃治疗6周后，抗肝纤维化的中成药高剂量组大鼠的状态明显优于其它各组。

1.7.2肉眼观察大鼠肝脏变化

实验结束后，将大鼠解剖，肉眼观察其肝脏形态发现：空白对照组大鼠肝脏呈深红色，肝脏表面光滑无斑点，全肝边缘锐圆，质地柔软；模型对照组大鼠的肝脏呈现暗红，体积较大，全肝边缘钝圆，肝脏表面有黄色斑点隆起的现象，质地稍实；抗肝纤维化的中成药高剂量组和抗肝纤维化的中成药低剂量组大鼠肝脏色泽深红，肝脏体积较空白对照组稍大，有一小部分大鼠肝脏表面有斑点隆起，全肝边缘纯圆，但模型组表现较明显。

1.7.3HE染色

(1)空白对照组：肝小叶结构完整，肝细胞排列整齐并且围绕中央静脉，呈条索状向四周放射排列，肝细胞多为单核且未见脂肪变性、坏死，肝细胞正常且无炎细胞浸润。

(2)模型对照组：肝小叶正常的结构被破坏甚至消失，肝细胞肿胀变性，不再表现为条索状排列，取而代之为排列紊乱，表现为点状或灶状坏死。部分小叶内的坏死灶融合成一片或者发生桥接坏死，炎性细胞或成纤维细胞可出现在坏死灶内。肝小叶结构被破坏，汇管区纤维结缔组织明显增生，此时将肝小叶包绕成为大小不等的肝细胞团而形成假小叶。

(3)抗肝纤维化的中成药高剂量组：肝小叶结构破坏较模型组明显减轻，肝窦虽有轻度扩张，但结构较正常，肝细胞的脂肪变性坏死、汇管区纤维结缔组织增生及炎性细胞浸润较模型组明显减少，假小叶形成也明显减少。

(4) 抗肝纤维化的中成药低剂量组：肝脏的病理变化介于模型组与抗肝纤维化的中成药高剂量组之间。

各组大鼠肝组织HE染色镜下表现（HE染色×200），如图1-图4所示。

1.7.4血清学指标

1.7.4.1抗肝纤维化的中成药对肝纤维化大鼠血清ALB、ALT、AST的影响，见表1。

表1： 抗肝纤维化的中成药对肝纤维化大鼠血清ALB、ALT、AST的影响

注：模型组与空白组比较，有统计学意义（★P＜0.05）；抗肝纤维化的中成药高剂量组、抗肝纤维化的中成药低剂量组分别与模型组比较，有统计学意义（△P＜0.05）；抗肝纤维化的中成药高剂量组与抗肝纤维化的中成药低剂量组比较，有统计学意义（▲P＜0.05）。

1.7.4.2抗肝纤维化的中成药对肝纤维化大鼠血清HA、PC-、-C、LN的影响，见表2。

表2 ：抗肝纤维化的中成药对肝纤维化大鼠血清HA、PC-、-C、LN的影响

注：模型组与空白组比较，有统计学意义（★P＜0.05）；抗肝纤维化的中成药高剂量组、抗肝纤维化的中成药低剂量组分别与模型组比较，有统计学意义（△P＜0.05）；抗肝纤维化的中成药高剂量组与抗肝纤维化的中成药低剂量组比较，有统计学意义（▲P＜0.05）。

1.7.5免疫组织化学检测各组大鼠肝组织中Akt1、磷酸化Akt1(p-Akt1)蛋白表达情况，见表3。

表3：免疫组织化学检测各组大鼠肝组织中Akt1、p-Akt1蛋白表达情况

注：模型组与空白组比较，有统计学意义（★P＜0.05）；抗肝纤维化的中成药低剂量组与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；抗肝纤维化的中成药高剂量组分别与模型组、抗肝纤维化的中成药低剂量组比较，有统计学意义（△P＜0.05）。

各组大鼠肝组织中Akt1、p-Akt1表达情况（免疫组化×400），如图图5-图12所示。

1.7.6Western blot检测各组大鼠肝组织中Akt1、磷酸化Akt1(p-Akt1)蛋白表达情况 ，见表4。

表4： Western blot检测各组大鼠肝组织中Akt1、p-Akt1蛋白表达情况

注：模型组与空白组比较，有统计学意义（★P＜0.05）；抗肝纤维化的中成药低剂量组与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；抗肝纤维化的中成药高剂量组分别与模型组、抗肝纤维化的中成药低剂量组比较，有统计学意义（△P＜0.05）。

1.7.7TUNEL法检测各组大鼠肝组织中肝星状细胞(HSC)凋亡情况，见表5。

表5：TUNEL法检测各组大鼠肝组织中HSC凋亡情况

注：模型组与空白组比较，无统计学意义（P＞0.05）；抗肝纤维化的中成药高剂量组、抗肝纤维化的中成药低剂量组分别与模型组比较，有统计学意义（△P＜0.05）；抗肝纤维化的中成药高剂量组与抗肝纤维化的中成药低剂量组比较，有统计学意义（▲P＜0.05）。

各组大鼠肝组织中HSC凋亡情况（TUNEL法×400），如图13-图16所示。

1.8实验研究结果

本实验研究利用CCL4花生油溶液诱导而成的肝纤维化模型大鼠来观察抗肝纤维化的中成药的抗纤维化机制，主要通过观察大鼠的血清学改变、PI3K/AKT信号通路下游的Akt1及p-Akt1蛋白表达情况及HSC细胞凋亡情况这几种方式来实现。研究结果表明：经过抗肝纤维化的中成药灌胃干预的肝纤维化大鼠在肝功能、肝纤四项的恢复、抑制PI3K/Akt信号通路的激活来降低HSC的增殖及加速HSC的凋亡等方面均较模型组显著，差异具有统计学意义（P＜0.05）。通过实验研究来观察抗肝纤维化的中成药对肝纤维大鼠PI3K/Akt信号通路的影响，揭示了抗肝纤维化的中成药的抗纤维化机制所在，为指导临床运用提供了理论依据。

、临床病例观察

病例1：“韦×，男，56岁，广西柳城县人，乙肝病史10年，症状胁部胀满不适3年，腹部稍胀满不适，口苦，咽干，大便干结难解，3-5天1行，舌红，苔黄腻，当地医院门诊间断就诊，3年前规律口服“恩替卡韦分散片”0.5mg qd，1年前腹部B超检查提示：肝弥漫性病变，考虑早期肝硬化。其后在原有“恩替卡韦分散片”治疗基础上加服该“抗肝纤维化的中成药”治疗，治疗3个月，上述症状逐渐好转，1年后复查腹部B超提示肝胆脾胰未见明显异常。

病例2：“黄×，女，26岁，广西桂林人，病历4年，症状胁部胀痛不适，伴胃脘部灼热感，口干口苦，舌红，苔黄厚。当地医院门诊间断就诊，1年前到我院门诊就诊，查肝功能正常，乙肝五项提示小三阳，HBV-DNA 2.95E3copy/ml，腹部B超无异常。暂不予抗病毒药物治疗，予该“抗肝纤维化的中成药”治疗，规律服用1个月后患者症状逐渐减轻，服用6个月后上述不适症状基本消失，复查肝功能正常，乙肝五项提示小三阳，HBV-DNA＜1.0E2copy/ml，腹部B超无异常。

病例3：“高×，男，38岁，广西三江县人，病历10年，症状右胁部胀痛不适10年，伴胃脘部胀满不适，口苦，咽干，大便干结难解，2天1行，舌红，苔黄腻，当地医院间断就诊（具体用药不详），症状未见缓解。2年前到我院门诊就诊，查肝功能：ALT 60U/L，AST 50U/L；乙肝五项提示小三阳，HBV-DNA 3.95E2copy/ml，肝纤四项：HA 104.90ng/ml，LN 108.20ng/ml，PC-III 20.87ug/ml，IV-C 60.27ng/ml。腹部B超提示肝脏表面实质光点增粗。遂后于门诊规律服用该“抗肝纤维化的中成药”治疗，治疗3个月后上述不适症状逐渐好转，6个月后基本消失，复查肝功能、肝纤四项均无明显异常，乙肝五项提示小三阳，HBV-DNA ＜1.0E2copy/ml，腹部B超肝胆脾胰未见明显异常。

病例4：“陈×，男，56岁，广西融水人，病历20年，15年前因乙肝肝硬化开始服用拉米夫定片抗病毒治疗，1年前查腹部B超提示肝硬化声像，脾脏稍大，胆胰未见异常。肝脏弹性测定示肝脏弹性值23.5，遂后开始规律服用该“抗肝纤维化的中成药”治疗，1年后复查腹部B超提示肝硬化声像，胆脾胰未见异常。肝脏瞬时弹性成像硬度值16.5KPa。