一种显著激发内质网应激和氧化应激的单体化合物及其用途的制作方法

本发明涉及一种单体化合物，特别涉及一种可以显著激发人肝癌细胞(HepG2)内质网应激和氧化应激的中药补骨脂中获得的单体化合物补骨脂二氢黄酮。

背景技术：

在真核细胞中，内质网是蛋白质折叠、转运及分泌的重要场所,高质量的蛋白质折叠是保证细胞功能和细胞生存的基本前提。在内质网中存在各种控制机制来确保蛋白的正确折叠、修饰使其正确表达，当外界因素的刺激或内环境紊乱会导致细胞中的蛋白质发生错误折叠，这些错误折叠或未折叠的蛋白质的大量累积即称为内质网应激(ER stress)，并同时激活未折叠蛋白反应(UPR)来使细胞恢复稳态。短暂的内质网应激能增强蛋白质折叠和修饰的能力，而持续的内质网应激则会激活凋亡程序使细胞走向死亡。因此，内质网应激和未折叠蛋白反应的激活决定着细胞的命运和功能，并且是人类许多疾病如代谢性疾病、癌症、肝脏疾病等重要的病源因素。除此之外，氧化应激也是导致脏器损伤的重要因素，主要机理为线粒体膜电位消失、形态变化、功能失常以及线粒体膜通透性转换孔(mPTP)的开放，并导致线粒体产生大量活性氧ROS，进而激活一系列毒性反应从而启动凋亡信号通路。内质网应激和氧化应激是机体重要的毒性通路，本发明的目的在于公开一种可以显著激发内质网应激和氧化应激的中药单体化合物。

补骨脂(PsoraleaeFructus)是豆科植物补骨脂Psoraleacorylifolia L.的干燥成熟果实，具有温肾助阳，纳气平喘，温脾止泻的作用，外用消风祛斑。用于肾阳不足，阳痿遗精，遗尿尿频等。随着对补骨脂的临床应用和对中药安全性研究日渐深入，国内外关于补骨脂导致肝损伤的报道逐年增多，表现为肝细胞损伤、胆汁淤积，严重者可导致感染性休克、脑水肿、消化道出血以及肝肾综合征等。有临床调查显示，在595例中药导致肝损伤的患者中，补骨脂占40例。另有研究报道，补骨脂水提物可引起大鼠肝损害，表现为肝脏增大、肝脏系数显著增高。此外补骨脂中所含的补骨脂乙素、补骨脂素均可诱导HepG2细胞凋亡。研究补骨脂中发挥毒性作用的单体成分及其毒性作用机制对于临床安全合理应用补骨脂中药材以及含有补骨脂的中成药具有重要的指导意义。

补骨脂中药材主要包括三大类化合物，香豆素、萜酚和黄酮类。通过对补骨脂中所含的主要单体成分进行毒性筛选发现补骨脂黄酮类化合物中的补骨脂二氢黄酮(又称补骨脂甲素，Bavachin)可显著激发肝细胞内质网应激反应和氧化应激反应，短暂的应激可使细胞存活，若持续存在便使细胞走向凋亡，从而导致肝脏脏器的损伤。补骨脂二氢黄酮是补骨脂中黄酮类化合物的主要有效成分，含量占补骨脂中药材的0.0341～0.248％(1.159±0.029mg/g)，目前还未见关于补骨脂二氢黄酮可产生细胞毒性反应的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于公开一种可显著激发人肝癌细胞内质网应激和氧化应激的中药单体化合物补骨脂二氢黄酮及其抗肝癌新用途。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种抗肝癌的药物，该药物含有1-99％的补骨脂二氢黄酮或该药物含有中药材补骨脂10-40重量份或相当该生药材量的提取物；补骨脂二氢黄酮在制备治疗肝癌的药物中的应用；补骨脂或相当其生药材量的提取物在制备治疗肝癌的药物中的应用。

附图说明：

图1：补骨脂二氢黄酮对HepG2细胞存活率的影响

图2：补骨脂二氢黄酮对内质网应激标志分子ATF4的影响

图3-1：高内涵分析补骨脂二氢黄酮处理后线粒体中ROS的产生

图3-2：流式细胞术检测补骨脂二氢黄酮处理后全细胞中ROS的产生

图3-3：补骨脂二氢黄酮处理后对线粒体形态及功能的影响

图4：补骨脂二氢黄酮对内质网应激标志分子mRNA水平的影响

图5：补骨脂二氢黄酮对内质网应激标志分子蛋白水平的影响

具体实施方式：

1.材料与方法

1.1细胞培养与细胞系

人肝癌细胞HepG2，购自北京协和细胞库，培养于含10％胎牛血清、1％双抗的DMEM培养基中，置37℃、5％CO₂的孵箱中进行培养。

1.2仪器

细胞培养箱(Thermo Forma，美国)；超净工作台(北京长城空气净化设备公司，SW-CJ-1F型)；倒置显微镜(日本Nikon120型)；IN CELL ANALYZER 2000HCA分析仪(GE，美国)；精密电子天平(德国Sartorius，BS110S)；酶标仪(美国Perkin Elmer，PE Victor X5型)；PCR仪(Gene Amp 2400)；StepOnePlus^TM Real Time PCR(美国Applied Biosystems，StepOnePlus^TM272006169)

1.3试剂

补骨脂二氢黄酮Bavachin购自上海一飞生物科技有限公司(批号：E031951)；DMEM培养基、PBS(Gibco美国)；血清(FBS四季青)；胰酶(Sigma)；MTS试剂盒(Promega)；BSA(Sigma)；荧光染料Hoechst33342，MitoTrackerRedCMXRos、MitoSOX red以及荧光二抗Aexa Fluor 488donkey anti-mouse IgG抗体和Aexa Fluor 488donkey anti-rabbit IgG抗体(Life technology)；ATF4兔单克隆抗体、CHOP鼠单克隆抗体、BIP兔单克隆抗体、GAPDH兔单克隆抗体(Cell Signaling美国)；RIPA lysis buffer裂解液、蛋白酶抑制剂、TBST(10×)(北京康为世纪公司)

1.4MTS法检测HepG2细胞活力

取对数生长期的HepG2细胞以2×10⁴接种于96孔板，设置无细胞孔为空白对照，37℃、5％CO₂培养24h后对细胞进行给药处理，设置空白组、正常对照组及给药组(浓度依次为0,2.5,5,10,20,40,80,160,200μM)，每组设置4个复孔，分别培养24h和48h后，将含药培养基弃去，每孔加入100μl基础培养基，再分别加入20μl/孔MTS溶液，置于37℃培养箱中继续孵育1h，用酶标仪测定在490nm处的吸光度值(OD)，按以下公式计算细胞存活率。并用Graphpad软件拟合IC₅₀值

细胞存活率(IC)％＝(实验组OD值-空白组OD值)/(正常对照组OD值-空白组OD值)×100％

1.5高内涵筛选(HCA)补骨脂二氢黄酮的内质网应激和氧化应激

1.5.1分组与处理

在预铺细胞粘附剂或胶原的黑色底透的96孔板(Corning，美国)上，以1×10⁴个/孔/100μl种板，培养24h后，进行给药处理，根据MTS筛选出的Bavachin的IC₅₀值并在其附近设置低、中、高三个浓度，同时设立正常对照组和阳性对照组衣霉素(Tunicamycin)，各给药组均设置4个复孔以保证结果的准确性。以上给药组的DMSO含量均小于0.1％。

1.5.2内质网应激检测实验方法

根据前期工作，选取12h为给药时间节点，药物处理后，加50μl/孔的活细胞染料溶液，包括核染料Hochest33342和线粒体膜电位染料MitoTrackerRedCMXRos，37℃孵育30min。弃液，加入100μl/孔预温到37℃的固定液，室温避光放置20min。100μl/孔的PBS洗1次，再加入100μl/孔的透膜缓冲液，室温避光放置10min。100μl/孔的PBS洗2次，加100μl/孔的BSA封闭液，37℃孵育30min。弃液，加40μl/孔的一抗ATF4/CHOP，室温避光孵育2h，100μl/孔封闭液洗3次，加上50μl/孔二抗，室温避光孵育1h，200μl/孔的PBS洗3次加入200μl/孔PBS上机检测。检测指标为线粒体膜电位(MMP)，ATF4、CHOP。

1.5.3氧化应激实验方法

在给药处理12h后，用预热至37℃的1×Hank’s balance sodium solution(HBSS)配置含有细胞核染料Hoechst33342和线粒体活性氧染料MitoSOX red的混合活细胞染料，各染料的终浓度分别为1、100和5μM。将96孔板中的含药培养基弃去，用200μl/孔含钙的HBSS小心洗涤细胞一次，加入50μl/孔混合细胞染料，于37℃避光染色40min，染色后将染料弃去，用200μl/孔HBSS小心洗涤细胞一次，加入200μl/孔HBSS上机检测线粒体ROS的释放情况。

1.6利用RT-PCR方法对高内涵筛选结果进行验证

在对HepG2细胞给药处理12h后，用预冷的Trizol裂解液将其裂解，提取mRNA后使用超微量分光光度计检测其浓度及纯度，所得A260/A280值均在1.8-2.0之间，表明纯度合格。将提取的mRNA尽快反转录成cDNA，之后进行RT-qPCR反应。检测指标为ATF4、ATF6、XBP1s、CHOP。

1.7利用WesternBlot方法对高内涵筛选结果进行验证。

在对HepG2细胞给药处理12h后提取蛋白，使用SDS-PAGE凝胶制备试剂盒制备的8％的分离胶和5％的浓缩胶进行电泳分析，约1.5h后使用0.45μm的硝酸纤维素膜进行转膜1h，之后用5％的脱脂奶粉室温封闭3h。用抗体稀释液按1:1000稀释兔抗人单克隆抗体GRP78(BIP)和ATF4兔抗人单克隆抗体室温孵育2h后4℃过夜，用TBST洗膜三次后用抗体稀释液稀释山羊抗兔二抗，室温孵育1h。按1:1配置发光液，滴加到膜上后放入凝胶成像系统中进行拍照。实验数据使用SPSS 20.0软件进行统计处理，采用单因素方差分析，P<0.05为具有统计学差异。

2.实验结果

2.1Bavachin对HepG2细胞活力的影响

采用MTS法检测了不同浓度的Bavachin处理细胞24h和48h对HepG2细胞增殖的抑制活性，如图1所示，Bavachin在1-200μM的范围内，呈剂量依赖的抑制HepG2细胞活力，其IC50值在24h和48h分别为24.44μM和11.9μM。

2.2高内涵筛选Bavachin的内质网应激反应(Endoplasmic Reticulum Stress，ERS)

如图2所示Bavachin作用于HepG2细胞12h，10μM、20μM和40μM的Bavachin可激发ATF4蛋白的核转位，并在细胞核中高表达，这是内质网应激反应的标志，同时可使线粒体膜电位MMP显著降低，正常的线粒体膜电位是维持线粒体进行氧化磷酸化、产生ATP的前提，是维持线粒体功能所必需，而凋亡过程中一个重要的变化即是线粒体膜电位的崩溃。表明在Bavachin处理12h可显著激发HepG2内质网应激反应和线粒体应激反应。

2.3高内涵筛选Bavachin的氧化应激反应(Oxidative Stress)。

如图3-1和图3-2所示，在Bavachin给药处理12h和24h可使线粒体释放大量活性氧ROS，导致线粒体和全细胞中ROS的升高，ROS的大量释放直接造成线粒体严重损伤，一方面可导致线粒体膜电位降低甚至消失，另一方面使线粒体形态出现明显皱缩，如图3-3所示。表明Bavachin可激发HepG2细胞显著的氧化应激反应。

2.4RT-PCR对HCA筛选结果验证

从mRNA水平检验Bavachin对内质网应激标志分子ATF4、ATF6、XBP1s、CHOP的影响。结果如图4所示。在给药12h后，细胞中内质网应激的三条通路的标志分子ATF4、ATF6、XBP1s表达均明显升高，与空白对照组相比均有显著性差异，内质网应激的持续激发会启动凋亡信号通路CHOP的高表达，进而对细胞造成损伤。

2.5WesternBlot方法对HCA筛选结果验证。

为了进一步确证本发明数据的可靠性，采用WesternBlot技术对Bavachin对HepG2细胞给药处理后对内质网应激标志蛋白ATF4和GRP78(BIP)的表达进行检测。结果如图5所示，在给药12h时，ATF4和BIP的表达呈现浓度依赖性增加，与高内涵筛选结果一致。

实施例1

一种抗肝癌的胶囊，该药物含有70-80％补骨脂二氢黄酮。

实施例2

一种抗肝癌的胶囊，该药物含有补骨脂20g或相当该生药材量的提取物。

实施例3

一种抗肝癌的片剂，该药物含有20-40％补骨脂二氢黄酮。

实施例4

一种抗肝癌的片剂，该药物含有补骨脂30g或相当该生药材量的提取物。

实施例5

一种抗肝癌的颗粒剂，该药物含有50-60％补骨脂二氢黄酮。

实施例4

一种抗肝癌的颗粒剂，该药物含有补骨脂10g或相当该生药材量的提取物。

实施例6

一种抗肝癌的胶囊，该药物含有骨脂二氢黄酮0.0496g。

实施例7

一种抗肝癌的胶囊，该药物含有补骨脂15g或相当该生药材量的提取物。

实施例3

一种抗肝癌的片剂，该药物含有补骨脂二氢黄酮0.0744g。

实施例4

一种抗肝癌的片剂，该药物含有补骨脂30g或相当该生药材量的提取物。实施例3

一种抗肝癌的颗粒剂，该药物含有补骨脂二氢黄酮0.0248g。