本发明涉及贯叶连翘提取物的制备方法。
背景技术：
贯叶连翘Hypericum perforatum L.，为藤黄科金丝桃属植物，又名贯叶金丝桃，广泛分布于欧洲、亚洲、澳洲等地，是为人类较早认识和利用的草药之一。在我国主要分布于河北、陕西、甘肃、山东等地，其干燥地上部分作为传统中草药，已被广泛应用于临床。据记载，贯叶连翘性味辛，寒，归肝经，具有疏肝解郁、清热利湿、消肿通乳等功效，用于肝气郁结，情志不畅，心胸郁闷，关节肿痛，乳痈，乳少；也可全草鲜品捣烂或干品研末敷患处，治创伤出血、痛疖肿毒和烧烫伤等。德国称其为圣约翰草，用它作抗抑郁症药已有100多年的历史；美国、加拿大也有大面积栽培，并已被德国、美国等国家收录于药典，广泛应用于临床。
随着提取精制技术的发展及药理研究的深入，贯叶连翘在抗病毒、抗抑郁、抗肿瘤等方面的作用越来越受到人类关注。贯叶连翘提取物所含成分非常复杂，主要分为三类：萘骈二蒽酮类化合物(naphthodianthrones)、间苯三酚类化合物(phiorogluCinol S)和黄酮类化合物(flavonoids)。其中，萘骈二蒽酮类化合物为贯叶连翘的特征成分，包括金丝桃素hypericin、伪金丝桃素(pseudohypericin)、原金丝桃素(ProtohyperiCin)、原伪金丝桃素(protopseudohypericin)等；间苯三酚类化合物主要包括贯叶金丝桃素(hypefonn)和加贯叶金丝桃素(adhyperforin)等，黄酮类化合物包括槲皮素(quercetin)、槲皮苷(quercitrin)、异槲皮苷(iso-quercitrin)、芦丁(rutin)、木樨草素(1uteolin)、金丝桃苷(hyperin／hyperoside)等。
早期研究认为金丝桃素是贯叶连翘的主要成分，因此开发了各种从贯叶连翘中提取金丝桃素的方法，例如CN10508224A公开了一种从贯叶连翘中提取金丝桃素的方法，包括浸泡、水煮、酶解、去油、碱提、柱层析和干燥的步骤，最终得到金丝桃素含量为5-6%的终产物。但随着对贯叶连翘提取物抗抑郁作用及机理的深入研究，认为包括金丝桃素、贯叶金丝桃素、黄酮类成分在内的多种成分共同构成了其抗抑郁的活性成分。因此，提供具有丰富活性成分的贯叶连翘提取物成为目前的研究热点，而不是局限于单一成分。
现有的贯叶连翘提取物的制备方法有醇提酸沉结晶法、大孔树脂吸附法、醇提萃取层析法、CTAB反胶束萃取法、超声提取大孔树脂吸附法等。如CN1181855A公开了一种贯叶连翘提取物的方法，包括乙醇提取、吸附柱分离、溶剂萃取的方法，得到含有0.6%以上金丝桃素和50-70%黄酮的贯叶连翘提取物；CN1880328A公开了运用反胶束萃取法、树脂分离提取贯叶连翘金丝桃苷和金丝桃素的制备方法。为了能获得含更多有效成分的贯叶连翘提取物，本发明人在之前的研究成果“一种从贯叶连翘中提取金丝桃素的方法”的基础上继续研究，继而获得本发明。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种贯叶连翘提取物的制备方法及其制得的贯叶连翘提取物。
本发明的贯叶连翘提取物的制备方法具体包括如下步骤：
（1）取贯叶连翘干燥全草（包括花朵及果实），粉碎，过40目筛；加入原料重量20-40%的水，调节pH至4.0-6.0，并按原料重量0.5-3%的比例加入酶制剂，避光密闭搅拌处理1-3h，结束前加热升温至60-80℃，持续5-15min，降至室温，分离弃去液体，得处理后的原料；
（2）取处理后的原料，以碱液为提取溶剂在提取罐中进行提取，提取罐中按原料重量0.1-1%加入稳定剂，得提取液A；
（3）将提取液A的pH值调至酸性，离心分离得上清液C；
（4）将上清液C经过模拟移动床色谱进行分离纯化，得到洗脱液D；
（5）将洗脱液D浓缩，再经冷冻干燥得到贯叶连翘提取物，提取物含金丝桃素含量。
其中，步骤（1）中的酶制剂可以是木聚糖酶、果胶酶或其混合物，优选木聚糖酶与果胶酶的混合物，特别是木聚糖酶与果胶酶3:1的混合酶；步骤（1）中酶制剂的加入量优选1-2重量%，更优选1.5重量%；结束处理前的升温优选达到80℃，持续5min。
其中，步骤（2）的碱液为1%的氢氧化钠溶液，每千克原料使用20-25L提取溶剂，40-60℃浸提2-3h；稳定剂可以是丁基羟基茴香醚或二丁基羟基甲苯。
其中，步骤（3）中，使用10%的盐酸溶液调节pH至3-4；离心机转速为4000转/min，离心时间为10min。
其中，步骤（4）中，模拟移动床色谱填充的吸附剂为非极性大孔吸附树脂,优选D101非极性树脂或HPD100非极性树脂，水洗区为纯水，解吸剂为60%乙醇，树脂吸附再生溶剂为95%乙醇或2-4%氢氧化钠水溶液，吸附区流速1-2BV/h，水洗区流速1-3 BV/h，解吸区流速1-3 BV/h，再生区流速2-3 BV/h，切换时间600-800s，温度控制在40-60℃，压力控制在0.1-0.5Mpa。
其中，步骤（5）中，将洗脱液D浓缩至固形物质量百分含量为30-40%，再经冷冻干燥得到贯叶连翘提取物。
本发明还提供了有上述方法制得的贯叶连翘提取物，该提取物中包含大于6.0重量%的金丝桃素、大于2.0重量%的贯叶金丝桃素、大于75重量%的黄酮类成分。
本发明人基于之前的研究成果，即利用模拟移动床吸附色谱技术，但不仅仅以金丝桃素为目标成分，将贯叶金丝桃素、黄酮类成分等均列为考虑目标后，广泛查阅了现有文件，从中选择了可能的手段，并通过大量劳动，选择了最适宜贯叶连翘的手段进行组合，并意外地发现本发明的这种方法获得了极佳的效果，主要在于：
（1）采用酶制剂处理原料，本领域技术人员公知，经特定的酶制剂处理可以很好地除去植物材料所具有油脂类成分，但是，本发明人发现，采用常规的酶解法虽然能实现除杂的目的，但由于贯叶连翘所含成分均为较不稳定的成分，酶解的过程也将引发多种活性成分的损失，例如黄酮类成分的氧化、贯叶金丝桃素的转化等，不利于本发明的发明目的。因此，发明人尝试了加入稳定剂、抗氧化剂、避光密闭等技术手段，效果均不明显，经多番尝试后，发明人发现在避光密闭的条件下进行酶解既能实现与加入稳定剂和抗氧化剂类似的结果，而且还减少了杂质的引入，更为适宜；随后，发明人非常意外地发现在避光密闭条件下的酶解末尾阶段进行一个短时间的升温，不仅获得了很好地除杂效果，在最后的整个方法结束后，还能获得包含更多目标成分的提取物。这似乎与贯叶连翘成分的热不稳定性相违背，发明人猜测可能与植物内部的成分间的相互转化有关，有待进一步研究确认。
（2）本发明人进一步调整了整个方法的相关参数，使得除了酶解步骤的短时高温外，其余所有步骤均控制在不高于60℃的环境下进行，进一步减少了有效成分的损失。本发明人在上述意外发现的基础上，也曾尝试在各个阶段进行瞬时升温的步骤，结果并不令人满意，无论是提取部分还是分离部分的升温都将明显导致有效成分含量的降低。
（3）本发明的方法各步骤相互协助，构成一个整体的方法，最终获得了包含大于6.0重量%的金丝桃素、大于2.0重量%的贯叶金丝桃素、大于75重量%的黄酮类成分的三大类活性成分的贯叶连翘提取物，活性成分总含量≥80%。且本发明的方法步骤简单、收率高，非常便于工业化大生产。
本申请的发明人为了获得本发明的技术方案，进行了大量试验，下文提供的实验结果仅用于表明本发明的制备方法相对于其他方法的优异性，原料均选取100g贯叶连翘进行试验。
1、提取物活性成分对比试验
本发明方法：按照实施例1的方法。
对照方法1：本发明人在前发明的实施例1的方法。
对照方法2：CN1181855A实施例1的方法。
对照方法3：CN11198097A实施例2的方法。
对照方法4：CN105085224A实施例1的方法。
对照方法5：CN1392129A实施例1的方法。
实验结果见下表，数值表示该类成分占所得提取物的重量百分比。
2、本发明所得提取物的抗抑郁活性试验
试验方法：采用大鼠强迫性游泳的实验模型，验证贯叶连翘提取物的抗抑郁活性。试验用药物为上述成分对比试验所获得的提取物，剂量为50mg/kg，临用前用0.3%CMCNa配置。统计数据用x±SD表示。结果见下表。
可以见，本发明方法所得提取物可以明显缩短大鼠游泳不动时间。
具体实施方式
下面结合以下具体实施方式对本发明作更为详细地说明。
实施例1
取贯叶连翘干燥全草（包括花朵及果实）1kg，粉碎，过40目筛；加入原料重量0.4L水，调节pH至4.5，并按原料重量1.5%的比例加入木聚糖酶与果胶酶3:1的混合酶，避光密闭搅拌处理2h，结束前加热升温至80℃，持续5min，降至室温，分离弃去液体，得处理后的原料；加入20L的1%氢氧化钠水溶液在提取罐中进行提取，提取罐中按原料重量0.5%加入稳定剂BHA，得提取液A；用10%的盐酸溶液将提取液A的pH值调至3.5，离心分离得上清液C；上清液C进入模拟移动床吸附分离，吸附剂为D101非极性大孔吸附树脂,水洗区为纯水，解吸剂为60%乙醇，树脂吸附再生溶剂为3%氢氧化钠水溶液，吸附区流速1.5BV/h，水洗区流速2 BV/h，解吸区流速3 BV/h，再生区流速3 BV/h，切换时间800s，温度控制在45℃，压力控制在0.3Mpa，得到洗脱液D；浓缩汁固形物质量百分含量为30%，再经冷冻干燥得到贯叶连翘提取物。经测定，提取物中含6.3重量%金丝桃素、3.1重量%贯叶金丝桃素、81.2重量%黄酮类成分。
实施例2
取贯叶连翘干燥全草（包括花朵及果实）1kg，粉碎，过40目筛；加入原料重量0.4L水，调节pH至4.0，并按原料重量1.5%的比例加入木聚糖酶与果胶酶3:1的混合酶，避光密闭搅拌处理2h，结束前加热升温至80℃，持续5min，降至室温，分离弃去液体，得处理后的原料；加入20L的1%氢氧化钠水溶液在提取罐中进行提取，提取罐中按原料重量0.5%加入稳定剂BHA，得提取液A；用10%的盐酸溶液将提取液A的pH值调至3.5，离心分离得上清液C；上清液C进入模拟移动床吸附分离，吸附剂为D101非极性大孔吸附树脂,水洗区为纯水，解吸剂为60%乙醇，树脂吸附再生溶剂为3%氢氧化钠水溶液，吸附区流速1.5BV/h，水洗区流速2 BV/h，解吸区流速3 BV/h，再生区流速3 BV/h，切换时间800s，温度控制在45℃，压力控制在0.3Mpa，得到洗脱液D；浓缩汁固形物质量百分含量为30%，再经冷冻干燥得到贯叶连翘提取物。经测定，提取物中含6.0重量%金丝桃素、2.8重量%贯叶金丝桃素、79.5重量%黄酮类成分。