含有圆叶茑萝提取物的糖尿病治疗用药物组合物的制作方法

本申请是申请日为2011年2月21日、中国专利申请号为201180014267.0(国际申请号为pct/kr2011/001128)、发明名称为“含有圆叶茑萝提取物的糖尿病治疗用药物组合物”的发明专利申请的分案申请。

本发明涉及一种含有圆叶茑萝提取物的用于治疗糖尿病及其并发症的药物组合物，更具体地说，涉及一种圆叶茑萝提取物和含有该圆叶茑萝提取物的用于预防或治疗糖尿病及其并发症的药物组合物、用于预防或延迟老化的药物组合物以及用于预防或治疗癌症的组合物。

背景技术：

糖尿病(diabetes)是指由多种病因引起的代谢紊乱，临床特征为因胰岛素分泌缺陷或胰岛素作用缺陷所导致的慢性高血糖症(hyperglycemia)，当血液中的葡萄糖浓度长期持续异常高的状态时，由于慢性代谢紊乱和因其引发的慢性血管损伤，导致各种并发症。

糖尿病为典型的成人代谢性疾病，全世界人口中约5％患此疾病，由此导致的生命和经济损失巨大。大部分糖尿病患者服用口服药治疗制剂，但目前的现状是，尚未开发出安全的治疗药物。虽然胰岛素抵抗性(insulinresistance)被视为最重要的原因，但准确的机制尚不明确，只知道由于遗传因素和环境的复合原因所导致。

糖尿病是世界第三大疾病，预计到2010年会有约2亿5千万的糖尿病患者，预计韩国国内的患病率也会持续上升。在韩国国内的死亡原因中，糖尿病死因排名第7。占糖尿病患者总人数的90％以上的非胰岛素依赖型糖尿病(non-insulindependentdiabetes，niddm)，主要发生在四十岁以上的中年人身上，因此，称为成人型糖尿病，是患者无法充分生成胰岛素或不能适当利用胰岛素而引起的代谢紊乱。非胰岛素依赖型糖尿病(niddm)的发病原因尚未明确，但是，西洋化的饮食生活和生活方式等环境因素、以及肥胖和缺乏运动等遗传因素都认为是其原因。通常，首先以饮食疗法和运动疗法治疗非胰岛素依赖型糖尿病(niddm)，若此疗法效果不佳时，通常采用药物治疗，大多数情况下都使用胰岛素。

胰岛素适用于通过饮食疗法和口服降糖药无法调节血糖的患者，但是，由于胰岛素是蛋白质，会在消化道被水解成非活性化，因此，存在着不能口服吸取，只能通过静脉注射或皮下注射来吸取的缺点。

口服降糖药能够提高细胞的胰岛素受体的敏感度，并刺激胰腺而促进胰岛素的分泌，因此，用于调节非胰岛素依赖型糖尿病(niddm)患者的血糖。

但是，用于治疗非胰岛素依赖型糖尿病(niddm)的口服疗法有可能导致低血糖症、恶心、呕吐、腹泻、皮疹等，特别是，会导致致命的乳酸酸中毒等严重的副作用。此外，长期使用口服降糖药会引起心血管系统障碍或胃肠及肝的障碍，因此，建议不要长期使用。

因上述缺陷和副作用，在目前的治疗剂中，还几乎没有既具有令人满意的效果，而且安全性高并在副作用方面也令人放心从而适用于所有糖尿病患者的药物，因此，迫切需要开发出治疗糖尿病、特别是对非胰岛素依赖型糖尿病(niddm)有更显著效果的药物。

通常，患糖尿病10年后，体内大部分器官均受到损伤而并引发并发症。在这些并发症中，作为急性并发症，有低血糖症、酮症酸中毒、高渗性非酮症高血糖、高血糖性昏迷、糖尿病酸中毒、低血糖症等；作为慢性并发症，有糖尿病性视网膜病变、糖尿病性白内障、糖尿病肾病、糖尿病性神经障碍、心血管系统并发症、病毒感染等。慢性糖尿病肾病是血液透析治疗和末期肾功能衰竭的最重要原因，而糖尿病性白内障会导致失明，最终导致死亡。

引发上述糖尿病并发症的机制，大体分为蛋白质的非酶糖化反应(nonenzymaticglycationofproein)和多元醇代谢通路(polyolpathway)等。

蛋白质的非酶糖化反应(nonenzymaticglycationofprotein)是指，蛋白质的赖氨酸残基等氨基酸基团与还原糖在没有酶的作用下发生的缩合反应即美拉德反应，作为该反应的结果，产生糖化终产物。蛋白质的非酶糖化反应分为以下两个阶段：(1)蛋白质的赖氨酸残基等氨基酸基团和还原糖的醛基或酮基在没有酶的作用下发生亲核加成反应而形成初产物即锡夫氏碱(schiffbase)，该锡夫氏碱与相邻的酮胺加成物(ketoamineadduct)相互缩合而生成可逆性阿马多里(amadori)型初期糖基化产物；(2)由于持续高血糖状态，从而可逆性阿马多里(amadori)初期糖基化产物不发生分解而被重排(rearrangement)并与蛋白质发生交联(cross-linking)，由此生成非可逆性的糖化终产物。

不同于可逆性的阿马多里型初期糖基化产物，糖化终产物是非可逆性的反应产物，一旦被生成，即使血糖恢复正常也不会被分解，并在蛋白质的生存期间蓄积在组织内，从而使组织结构和功能发生异常变化，在组织各处引起并发症。

例如，由葡萄糖和各种蛋白质反应而生成的糖化终产物之一的糖化白蛋白，是引起慢性糖尿性肾病的重要因素。与未糖化的正常白蛋白相比，糖化白蛋白更容易导入到肾小球细胞内，而高浓度的葡萄糖将刺激肾小球系膜细胞，从而加大细胞外基质(extracellularmatrix)的合成。因过度导入的糖化白蛋白和增加的细胞外基质，引起肾小球的纤维化。由于上述原因，肾小球持续受到破损，最终只能采用血液透析或器官移植等极端方法。另外，有报告称，由于慢性糖尿，糖化终产物在动脉壁与胶原蛋白相结合，而在肾小球与基底膜蛋白相结合，从而堆积在组织中。

如上所述，由于蛋白质非酶糖化反应，在基底膜、血浆白蛋白、水晶体蛋白质、纤维蛋白、胶原蛋白等蛋白质中发生糖化，生成的糖化终产物使组织结构和功能发生异常变化，从而引发糖尿病视网膜病变(diabeticretinopathy)、糖尿病白内障(diabeticcataract)、糖尿肾病(diabeticnephropath)、糖尿病神经病变(diabeticneuropathy)等慢性糖尿病并发症。因此，为了延迟、预防或治疗糖尿病并发症的发病，抑制糖化终产物的形成是非常重要的。

另外，糖化终产物导致血管内皮细胞生长因子vegfmrna和蛋白质的过度表达，从而引发非增殖性或增殖性的糖尿病视网膜病变。非正常的新生血管形成或病理性(pathogenic)新生血管的生长与多数状态有关。此状态包括糖尿病视网膜病变、牛皮癣、渗出型或湿型(wet)老年黄斑变性(armd)、风湿关节炎和其他炎症疾病以及大部分癌症。在患有与此类状态有关的疾病的组织或肿瘤中，vegf表达为异常高的水平，提高了血管新生或血管透过性。特别是，armd在临床上是重要的血管新生疾病。此疾病的特征在于，在老年人的一只或两只眼睛的脉络膜形成新生血管，在产业化国家中成为失明的主要因素。在各种治疗疗法中使用的抗-新生血管形成制剂只能引导vegf或vegf受体的化学量的减少，此类制剂的效果根据在患疾组织中以异常高的浓度形成的vegf减弱。

为此，本发明人等为了寻求用于治疗糖尿病及其并发症且副作用小的天然生药材进行了悉心的研究，结果发现：圆叶茑萝(quamoclitangulata)提取物可在人视网膜色素上皮细胞株中抑制vegf，而且在胰腺β细胞株中起到促进胰岛素分泌的作用，当向小鼠高脂肪饮食群和糖尿小鼠模型提供圆叶茑萝提取物时，能够减小糖尿指标，从而完成了本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供一种用于治疗糖尿病及其并发症的天然生药材即原叶茑萝提取物。

本发明的另一目的在于，提供一种用于预防或治疗糖尿病及其并发症的药物组合物，该药物组合物含有上述原叶茑萝提取物。

本发明的又一目的在于，提供一种用于预防或延迟老化的药物组合物，该药物组合物含有上述圆叶茑萝提取物。

本发明的又一目的在于，提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，该药物组合物含有上述圆叶茑萝提取物。

本发明的又一目的在于，提供一种上述圆叶茑萝提取物的制造方法。

为了达成上述目的，本发明提供一种用于预防或治疗糖尿病及其并发症的药物组合物，该药物组合物含有原叶茑萝提取物。

本发明还提供一种用于预防糖尿病及其并发症的保健功能食品，该保健功能食品含有圆叶茑萝提取物。

本发明还提供一种用于预防或延迟老化的药物组合物，该药物组合物含有圆叶茑萝提取物。

本发明还提供一种用于预防或延迟老化的保健功能食品，该保健功能食品含有圆叶茑萝提取物。

本发明还提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，该药物组合物含有圆叶茑萝提取物。

本发明还提供一种圆叶茑萝提取物的制造方法，包括：

(a)切碎圆叶茑萝的全草后，通过由水、醇(alcohol)、有机溶剂以及它们的混合物所组成的组中选出的溶剂进行提取，从而获得提取液的步骤；以及

(b)过滤上述提取液，并进行减压浓缩而获得圆叶茑萝提取物的步骤。

本发明的特征在于，还包括：

(c)利用活性炭，对由上述(b)步骤得到的圆叶茑萝提取物进行分离提纯，然后进行减压浓缩而获得圆叶茑萝提取物的步骤。

本发明还提供一种圆叶茑萝提取物，该圆叶茑萝提取物是通过上述方法制造，并具有抑制vegf效果、促进胰岛素分泌效果、降低血糖效果、减少尿蛋白效果和降低水晶体混浊度的效果。

本发明还提供一种预防或治疗糖尿病及其并发症的方法，包括：对有需要的对象给予上述圆叶茑萝提取物的步骤。

本发明还提供一种预防或延迟老化的方法，包括：对有需要的对象给予上述圆叶茑萝提取物的步骤。

本发明还提供一种预防或治疗癌症的方法，包括：对有需要的对象给予上述圆叶茑萝提取物的步骤。

本发明还提供上述圆叶茑萝提取物的治疗或预防糖尿病及其并发症的用途。

本发明还提供上述圆叶茑萝提取物的预防或延迟老化的用途。

本发明还提供上述圆叶茑萝提取物的预防或治疗癌症的用途。

通过以下的详细说明和权利要求书，能够更明确本发明的其它特征和实施方式。

附图说明

图1是确认本发明的圆叶茑萝提取物在人视网膜色素上皮细胞株中抑制vegf(vascularendothelialgrowthfactor)表达的图。

图2是表示本发明的圆叶茑萝提取物在人视网膜色素上皮细胞株中阻碍vegf蛋白合成的图。

图3是表示本发明的圆叶茑萝提取物在小鼠的胰腺β细胞株中促进胰岛素蛋白合成的图表。

图4是表示本发明的圆叶茑萝提取物对高脂肪饮食群小鼠体重的影响的图。

图5是表示本发明的圆叶茑萝提取物对高脂肪饮食群的糖尿并发症模型动物血糖的抑制效果的图。

图6是表示本发明的圆叶茑萝提取物减少高脂肪饮食群的糖尿并发症模型动物尿中的尿蛋白效果的图。

图7是表示本发明的圆叶茑萝提取物对糖尿模型动物血糖的抑制效果的图。

图8是表示本发明的圆叶茑萝提取物对糖尿模型动物的糖化血红蛋白的抑制效果的图。

图9是表示本发明的圆叶茑萝提取物减少糖尿模型动物尿中的尿蛋白效果的图。

图10是表示本发明的圆叶茑萝提取物降低小鼠水晶体浑浊度效果的图。

具体实施方式

除非另有定义，本说明书中使用的所有技术用语和科学用语具有与本领域技术人员的通常理解相同的意义。本说明书中使用的命名法和以下所述的实验方法是在该技术领域中广为人知而且通常使用的方法。

下面，更详细地说明本发明。

本发明的一实施方式涉及一种用于预防或治疗糖尿病及其并发症的药物组合物和保健功能食品，该药物组合物和保健功能食品含有圆叶茑萝提取物。

本发明中涉及的圆叶茑萝(quamoclitangulata)为管花目旋花科属的一年生草质缠绕藤本，又称圆叶留红草。其原产地为热带美洲，主要作为观赏植物来栽培，其特征是，藤的生长类似于牵牛花并向左缠绕。全草的长度为3m左右。叶互生，叶柄长，并呈心形的圆状。而且，叶顶端突然变尖，叶底部分的两侧端部呈尖角。通常，是在8～9月开花，花颜色是带黄的红色，在长长的花茎顶端生3～5朵花。其花朵模样类似于缩小版的牵牛花，花萼和雄蕊各5个，雌蕊1个。其果实为蒴果近球形，且在9月成熟，保留花萼。与留红草相似，但叶子没有裂。

本发明的圆叶茑萝提取物可通过公知的方法来制造。例如，可将水、醇、有机溶剂或它们的混合物作为溶剂来提取，优选通过水或醇提取，另外，还可以利用活性炭进行分离提纯。

在本发明的一实施方式中，圆叶茑萝提取物是按如下所述的方法获得：对破碎的圆叶茑萝51g，利用溶剂并在常温下，使用超声波提取器每2小时提取15分钟并持续进行2-3天，其中，所述溶剂是由水、醇、醇水溶液、有机溶剂和它们的混合溶液所组成的组中选择的溶剂。然后，在常温下，利用真空旋转浓缩机对上述获得的提取物进行减压浓缩，用冷冻干燥机对所提取的残留物进行干燥后，用水溶解，从而获得圆叶茑萝提取物。

另外，使上述得到的圆叶茑萝提取物通过填充有活性炭的柱子，从而吸附圆叶茑萝的有效成分，再用蒸馏水清洗填充有活性炭的柱子而去除非吸附成分。对如上所述的去除了非吸附成分并填充有活性炭的柱子，以连续或阶段性地、并以提高浓度的方式供给10～50％(v/v)乙醇等有机溶剂，从而洗脱附着在活性炭的圆叶茑萝有效成分并进行分离提纯，得到圆叶茑萝提取物。对如此提纯过的圆叶茑萝提取物，利用真空旋转浓缩机，在常温下进行减压浓缩，再对该浓缩的提取物进行真空冷冻干燥后，用水溶解，得到溶解于水中的圆叶茑萝提取物。

在本发明的一实施例中，作为糖尿的指标，确认了体重，血糖和蛋白尿。对由于高脂肪饮食而诱发了肥胖的小鼠，给予4周圆叶茑萝提取物的结果，确认了具有降血糖活性，且通过尿蛋白减少，确认了能够减少作为糖尿病肾病的早期症状的蛋白尿，由此，确认了本发明的圆叶茑萝提取物能够预防糖尿病。

在本发明的另一实施例中，将圆叶茑萝提取物给予糖尿病小鼠(malec57bl/ksdb/dbmouse)12周的结果，确认了显示降血糖活性，并确认了糖化血红蛋白数值的降低。并且，通过尿蛋白的减少，确认了作为糖尿病肾病的早期症状的蛋白尿的减少，由此，确认了本发明的圆叶茑萝提取物能够治疗糖尿病。

除此之外，通过小鼠肝毒性检查，确认了本发明的圆叶茑萝提取物没有引发肝中毒，因此，通过以适当的方式给予哺乳动物，能够在无毒性的情况下以显著性水平(significancelevel)改善、治疗和预防糖尿病及其并发症。

在此，上述“预防或治疗”是指，治疗糖尿病及其并发症、提前预防糖尿病及其并发症、以及改善因糖尿病及其并发症导致的健康状态或使其好转的所有情形。

另外，圆叶茑萝提取物不仅预防或治疗糖尿病，而且对由糖尿病引发的并发症也有预防和治疗的作用。作为上述并发症，由慢性高血糖症、动脉粥样固化症，微细血管病变，肾病，心脏病，糖尿病视网膜病变和除此以外的一个以上眼科疾病的组合所组成的组中选出。在本发明的另一实施例中，通过培养小鼠晶状体，确认了本发明的圆叶茑萝提取物对糖尿病并发症之一的白内障有抑制作用。

在此，糖尿病包括：i型糖尿病、ii型糖尿病、年轻人中发病的成人型糖尿病、隐匿性自身免疫性糖尿病、胰腺糖尿病等所有种类的糖尿病，而且，除糖尿病之外，还包括作为与糖尿病有关联的疾病即并发症在上面所提及的高血糖症(hyperglycemia)，高胰岛素血症(hyperinsulinemia)，内糖耐量异常(ompairedglucosetolerance)，空腹血糖受损(impairedfastingglucose)，血脂障碍(dyslipidemia)，高甘油三酯血症(hypertriglyceridemia)或抗胰岛素性(insulinresistance)等。

在此，眼科疾病除了糖尿病性视网膜病以外，还包括白内障，黄斑变性，外眼筋麻痹，虹膜睫状体炎，视神经炎，青光眼，视网膜衰退，眼底出血，异常折射，结膜下出血，玻璃体积血等因糖尿病引发的所有眼科疾病。

本发明的药物组合物以圆叶茑萝提取物作为必要成分，可仅包含该圆叶茑萝提取物，也可以包含一种以上的药物学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂而作为药物组合物提供。也可以与已知的糖尿病及其并发症的治疗药物加以混合而提供。本发明圆叶茑萝提取物的使用量因患者的年龄、性别和体重不同而不同，但通常一天的使用量为0.01～200mg/kg，优选为0.1～40mg/kg，可一次性给药，也可以分几次给药。另外，也可根据糖尿病及其并发症的种类、严重程度、患者的年龄、体重、健康状况、性别、给药途径以及治疗期间等，以药物学上的有效量包含在药物组合物中。

上述“药物学上可接受”是指，生理上被允许，并向人体提供时，通常不会引起胃肠障碍、眩晕症等过敏反应或类似的反应的组合物。作为药物学上可接受的载体，例如，可以举出乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸等口服给药用载体；以及水、适宜的油、食盐水、葡萄糖溶液和乙二醇等非口服给药用载体。还可以包括稳定剂、保存剂、填充剂、抗凝剂、润滑剂、湿润剂、香料、乳化剂和防腐剂等。作为优选的稳定剂，可举出亚硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸等的抗氧化剂。作为优选的保存剂，可举出苯扎氯铵、羟苯甲酯或羟苯丙酯以及氯丁醇等。作为除此之外的药物学上可接受的载体，可参考下述文献中记载的内容(remington'spharmaceuticalsciences,19thed.,mackpublishingcompany,easton,pa,1995)。

另外，可通过本领域公知的方法将本发明的药物组合物制成剂型，以向哺乳动物给药后，实现活性成分的迅速、持续或延迟释放。剂型可以为粉末、颗粒、片剂、乳剂、糖浆、气雾剂、软膏或明胶硬胶囊、灭菌注射液、灭菌粉末的形态。

本发明的药物组合物可通过各种途径给予小鼠、大鼠、家畜、人等哺乳动物。给药途径可采用通常的所有方式，例如，可采用口服给药、组织给药、直肠给药，或可通过静脉注射、肌肉注射、皮下注射、子宫内膜或脑血管内注射来给药。另外，本发明的药物组合物可与具有治疗或预防糖尿病效果的公知的化合物并行地给药。

因此，本发明涉及治疗或预防糖尿病及其并发症的方法，该方法包括将上述含有圆叶茑萝提取物的药物组合物以治疗学上的有效量给予哺乳动物的步骤。

另外，本发明的圆叶茑萝提取物还可以制成食品形态，以用于预防或改善糖尿病及其并发症。因此，本发明还涉及作为有效成分含有本发明的圆叶茑萝提取物的食品组合物即保健功能食品。

本发明的保健功能食品是食品组合物，包括功能性食品(functionalfood)、营养补剂(nutritionalsupplement)、健康食品(healthfood)以及食品添加剂(foodadditives)等的所有形态。上述类型的保健功能食品可通过本领域的公知方法制成各种各样的形态。例如，作为保健食品，可将本发明的圆叶茑萝提取物本身制成茶、果汁以及饮料的形态来饮用，或者对其进行颗粒化、胶囊化和粉末化而摄取。另外，作为功能性食品，可将本发明的圆叶茑萝提取物添加于以下食品等中而制造，所述食品是：饮料(包括酒精饮料)、果实及其加工食品(例如水果罐头、瓶装食品、果酱、果冻等)，鱼类、肉类及其加工食品(例如火腿、香肠、咸牛肉等)，面包和面类(例如切面(乌冬面)，荞麦面、拉面、意大利面、通心粉等)，果汁、各种饮料、曲奇饼、饴糖、乳制品(例如奶油、干酪等)，食用植物油脂、人造奶油、植物蛋白质、蒸煮袋食品、冷冻食品、各种调味料(例如，酱、酱油、沙司等)等。

本发明的另一实施方式涉及用于防止或迟延老化的药物组合物和保健功能食品，其含有圆叶茑萝提取物。

在与糖尿病及其并发症有关的研究中，已报道过糖尿病与氧化应激(oxidativestress，os)有密切的关联。糖尿病中出现的慢性高血糖通过葡萄糖的自动氧化、蛋白质糖化等各种途径加大游离基的生成，并因反应性高的这些物质，提高了氧化应激。本发明的圆叶茑萝提取物通过抑制糖化终产物(advancedglycationendproduct,age)的生成，减少因上述异物质引发的氧化应激，从而能够得到防止或延迟老化的效果。

如此的药物组合物，可通过包含在上面提到的药物学上可接受的载体、赋形剂等而制成，也可以与以往所公知的延迟或防止老化的物质相混合而制成。另外，根据老化程度、所需效果的程度，圆叶茑萝提取物的给予量可不同，也根据患者的年龄、性别、体重、给予期间等而不同，还可利用公知的技术制成各种形态的剂型，并可通过各种给药途径给予。因此，本发明涉及防止或延迟老化的方法，包括对有需要的对象给予本发明的上述圆叶茑萝提取物的步骤。另外，作为上述保健功能食品即食品组合物，包括功能性食品、营养补剂、保健食品、食品添加剂等的各种形态。可通过本领域公知的方法，制成各种形态，例如，如上所述地，可将圆叶茑萝提取物本身制成茶、果汁、饮料的形态，或者对其进行颗粒化、胶囊化、粉末化，或者将上述提取物添加于饮料、果实和加工食品，鱼类、肉类及其加工食品，面包类、面类、调味料等各种食品中来进行制造。

本发明的又一实施方式，涉及用于预防或治疗癌症的药物组合物，其含有圆叶茑萝提取物。

本发明的圆叶茑萝提取物通过抑制糖化终产物的生成，抑制因异物质引发的癌症，从而能够得到防止和/或治疗癌症的效果。已有报道称糖化终产物会诱发老化和致癌物质(carcinogenesis)(tokuda,h.,etal.,bookofabstractof53rdgacongressjointwithsif,p076,2005)，由于圆叶茑萝提取物阻碍vege的生成，由此能够得到预防或治疗癌症的效果。

在本发明中，上述癌症是与由vegf(vascularendothelialgrowthfactor)引发的新生血管形成有关的疾患之一，作为癌症的种类，例如包括：肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等已知的所有种类的癌症。另外，“预防或治疗癌症”是指通过阻碍vegf的生成，能够同时阻挡癌的增殖和转移，进而能够预防癌症。

如此的药物组合物，可通过包含在上面提到的药物学上可接受的载体、赋形剂等而制成，也可以与以往所公知的预防、治疗癌症的物质相混合而制成。另外，根据癌症种类、癌症的进展状况，圆叶茑萝提取物的给予量可不同，也可根据患者的年龄、性别、体重、给予期间等而不同，还可利用公知的技术制成各种形态的剂型，并可通过各种给药途径给予。因此，本发明涉及治疗和预防癌症的方法，包括对有需要的对象给予本发明的上述圆叶茑萝提取物的步骤。

本发明的又一实施方式涉及一种圆叶茑萝提取物的制造方法，包括：

(a)切碎圆叶茑萝的全草后，通过由水、醇(alcohol)、有机溶剂以及它们的混合物所组成的组中选出的溶剂进行提取，从而获得提取液的步骤；以及

(b)过滤上述提取液，并进行减压浓缩而获得圆叶茑萝提取物的步骤。

对上述(a)步骤中使用的有机溶剂而言，可使用公知的有机溶剂中的任一种，例如，可以使用己烷、醚、苯、乙酸乙酯、三氯甲烷、乙腈等。虽然在本发明的实施例中使用了水和醇，但并不限定于这些。

本发明的上述圆叶茑萝提取物的制造方法，其特征在于，还包括：

(c)利用活性炭，对由上述(b)步骤得到的圆叶茑萝提取物进行分离提纯，然后进行减压浓缩而获得圆叶茑萝提取物的步骤。

本发明的上述(c)步骤，是利用活性炭对圆叶茑萝的有效成分进行回收、过滤后加以减压浓缩的步骤，这种利用活性炭的方法，可采用将上述在(b)步骤中进行减压浓缩而获得的浓缩液悬浮于水中，并通过填充有活性炭的柱色谱法、以50％乙醇作为流动相进行洗脱并分离纯化的方法。

另外，本发明还涉及一种圆叶茑萝提取物，该圆叶茑萝提取物是通过上述方法制造，并具有抑制vegf效果、降低血糖效果、促进胰岛素表达效果和减少尿蛋白效果。

实施例

下面，通过实施例更详细地说明本发明。但只要是本领域技术人员，应该明白以下实施例仅用于例示本发明，本发明的范围并不局限于下述的实施例。

实施例1:圆叶茑萝提取物的制造

圆叶茑萝是在济州南郡安德面西光里采集，在室温下，对51g圆叶茑萝，通过100％乙醇、并利用超声波提取器每2小时提取15分钟持续2～3天。提取后，对提取物用真空旋转浓缩机在常温下进行减压浓缩后，对所提取的残留物用真空冷冻干燥机进行干燥，并将干燥后的7g圆叶茑萝提取物，以0.075mg/ml的浓度溶解于水中。

实施例2:利用活性炭的圆叶茑萝提取物的制造

将从济州南郡安德面西光里采集的50g圆叶茑萝切碎，对上述切碎的圆叶茑萝以水为溶剂在室温下用超声波提取器每2个小时提取15分钟并持续2～3天。过滤上述提取的提取液后，减压浓缩得到浓缩液。将上述浓缩液悬浮于水中，并通过填充有活性炭的柱色谱法、以50％乙醇为流动相进行洗脱并分离纯化，对上述分离纯化的圆叶茑萝提取物进行减压浓缩后，在5g浓缩的圆叶茑萝提取物中加水溶解至圆叶茑萝提取物的浓度达到20mg/ml。

实验例1:确认圆叶茑萝全草提取物对vegf的抑制能力

在通过由实施例1和实施例2制造的圆叶茑萝提取物处理过的人视网膜色素上皮细胞株即arpe19细胞株上，确认了对引发糖尿病视网膜病变等糖尿病并发症的血管内皮细胞生长因子(vegf)的抑制能力。

arpe19细胞株(atcc,usa)是在dmem；f12media中添加10％fbs(fetalbovineserum)而培养。为了在arpe19细胞株中诱导vegfmrna和蛋白质的表达，在60φ的板(plate)上以1×10⁵cell/板的浓度涂布细胞，并在dmemlowglucosemedia中添加10％fbs无血清而培养24小时后，替换为在dmemlowglucosemedia中添加了25mm和30mm葡萄糖(glucose)的培养液，并以最终浓度达到0.2μg/ml的方式添加实施例1和实施例2的圆叶茑萝提取物后，为了确认对vegf的mrna表达的抑制能力，培养了24小时，并为了确认vegf蛋白质生成，培养了72小时。此时，作为对照群，以通过5.5mm葡萄糖(glucose)进行处理而vegf未表达的细胞本身作为基准，确认通过25mm和30mm葡萄糖(glucose)进行处理时的vegf表达程度，比较圆叶茑萝提取物对vegf表达的抑制能力。实验中使用的25mm及30mm葡萄糖(glucose)浓度，是在各实验中使诱发vegf的表达达到最佳的条件的浓度。

(1)对vegfmrna表达的抑制效果

为了在通过上述方法培养的arpe19细胞中分离总(total)rna，在去除培养基后，使用trizolreagent(总rna抽提试剂、invitrogen，usa)进行分离，并利用序列号为1～2的引物，实行rt-pcr(逆转录-聚合酶链反应，reversetranscriptase-polymerasechainreaction)，确认了vegfmrna的表达。

其结果，如图1表示,确认了在通过用实施例1中制造的圆叶茑萝提取物处理过的试验群中，抑制了vegfmrna的表达。

序列号1:ttgccttgctgctctacctc

序列号2:aaatgctttctccgctctga

(2)对vegf分泌蛋白质表达的阻碍功效

获取通过上述方法培养的arpe19细胞的培养液,并利用vegfelisa试剂盒(r&d,uk)，测定所分泌的vegf量。

结果,如图2表示,确认了在通过由实施例1和实施例2制造的圆叶茑萝提取物处理过的试验群中，减少了vegf表达。

实验例2:确认圆叶茑萝提取物对胰岛素分泌的促进效果

在通过由实施例1和实施例2制造的圆叶茑萝提取物处理的小鼠胰腺β-细胞株即min6细胞株中，确认是否促进胰岛素分泌。

min6(atcc,usa)是在hdmemmedia中添加15％fbs(fetalbovineserum)而培养。为了在min6细胞株中诱导胰岛素表达，在96孔(well)板上以1×10⁴cell/板浓度涂布细胞，并在dmemhighglucosemedia中添加15％fbs无血清培养72小时后，用pbs缓冲溶液洗涤，并在hbss缓冲溶液中培养2小时后，换成添加了25mm葡萄糖(glucose)的hbss缓冲溶液，并以最终浓度达到0.2μg/ml的方式添加圆叶茑萝提取物后，为了确认是否促进了胰岛素表达，培养了2个小时。此时，作为对照群，以通过5.5mm葡萄糖(glucose)进行处理从而胰岛素未表达的细胞本身的胰岛素作为基准点，确认通过25mm葡萄糖(glucose)进行处理时胰岛素表达的程度，比较分析圆叶茑萝提取物对胰岛素表达的促进。获取通过如上所述的方法培养的min6细胞的培养液，利用胰岛素elisa试剂盒(r&d,uk)，测定所分泌的胰岛素的量。其结果，如图3所示，能够确认胰岛素表达的增加，特别是，当为实施例2的利用活性炭制造的圆叶茑萝提取物的情况下，显示出更高的胰岛素分泌能力。

实验例3:测定用圆叶茑萝提取物处理的小鼠糖尿指标变化

在正常的小鼠身上处理实施例1中制造的圆叶茑萝提取物，并作为糖尿指标，观察体重、血糖和尿蛋白的变化。

购买5周龄的小鼠(malec57bl/6j,19g,coretechcorp.,平泽)，在规定的温度(25℃)和湿度(50％)下适应1周后用于实验。小鼠按各群组4只分组，作为对照群，分为喂普通饲料的普通饮食群和喂高脂肪饲料的高脂肪饮食群，并作为饮用水提供普通水；作为试验群，喂高脂肪饲料，并作为饮用水，提供将由实施例1制造的圆叶茑萝提取物以0.075mg/ml浓度稀释的水。分别将对照群和试验群饲养4周。每周测定体重和血糖的变化，另外，采取给药4周后的尿样，测定尿蛋白浓度。

其结果，如图4表示，摄取了圆叶茑萝提取物的试验群的体重与高脂肪饮食群相比，有了显著的减少。

在血糖变化方面，高脂肪饮食群的血糖高于普通饮食群，但在高脂肪饮食中提供了以0.075mg/ml浓度稀释圆叶茑萝提取物的饮用水的群组中，显示出了显著的降血糖效果(图5)。

糖尿病患者中出现肾脏和心脏并发症的情况常见。蛋白尿(proteinuria)的减少说明肾脏功能已恢复。用于观察圆叶茑萝提取物对肾脏影响的尿蛋白分析，是采取给予圆叶茑萝提取物4周后的小鼠尿样，并利用elisa试剂盒(exocell,america)来测定。

其结果,如图6所示，高脂肪饮食群的尿蛋白相对于普通饮食群高，但在高脂肪饮食中提供了以0.075mg/ml浓度稀释圆叶茑萝提取物的饮用水的群组中，尿蛋白有显著的减少。这说明：改善了特别是因高脂肪饮食而在糖尿病小鼠中出现的肾功能，从而减少了尿蛋白浓度。

实验例4:通过圆叶茑萝提取物处理的糖尿病小鼠的糖尿病指标观察试验

对正常小鼠和实际糖尿病小鼠给予实施例2中制造的圆叶茑萝提取物,确认作为糖尿指标的血糖，糖化血红蛋白(血色素)及尿蛋白的变化。

购买6周龄的小鼠(malec57bl/6jmouse,，20g，中央实验动物,首尔)和6周龄的糖尿病小鼠(malec57bl/ksdb/dbmouse，20g，中央实验动物,首尔)，并在规定温度(25℃)和湿度(50％)下适应1周后，用于试验中。

小鼠按各群组5只分组，分为普通小鼠对照群、糖尿病小鼠对照群、对糖尿病小鼠提供以0.1mg/ml浓度稀释由实施例2制造的圆叶茑萝活性炭提取物的水的群组，并饲养12周。每2周测定血糖的变化，另外，每6周采取尿样测定尿蛋白浓度，饲养12周后采取血液测定糖化血红蛋白浓度。

其结果，在血糖变化方面，如图7表示，糖尿病小鼠对照群的血糖相对于普通小鼠对照群高，但在对糖尿病小鼠提供以0.1mg/ml浓度稀释圆叶茑萝活性炭提取物的水的群组中，显示出明显的降血糖效果。

为了减少糖尿病患者身上引发的并发症，最为重要的是维持适当的血糖值。由于在某个时间点测定的血糖值有可能因各种因素产生变化，因此，为了掌握长期的血糖控制趋势，最广泛使用的检查为糖化血红蛋白(hba1c)。糖化血红蛋白是红细胞中正常存在的血红蛋白与糖结合的形态，当血糖保持高水平时，糖化血红蛋白值也升高。因糖化血红蛋白反映2～4个月期间的平均血糖值，所以对掌握长期的血糖控制程度方面有用。

为了确认圆叶茑萝活性炭提取物对糖化血红蛋白的影响，对普通小鼠对照群、糖尿病小鼠对照群、以及对糖尿病小鼠提供以0.1mg/ml浓度稀释由实施例2制造的圆叶茑萝提取物的水的群，每6周采取一次血液，并利用elisa试剂盒(cusabiobiotech,japan)进行测定。

其结果，如图8中所示，在糖化血红蛋白值方面，糖尿病小鼠对照群相对普通小鼠对照群，血糖显示出异常高的数值，但在对糖尿病小鼠提供以0.1mg/ml浓度稀释圆叶茑萝提取物的水的群中，与普通小鼠对照群类似地，显示出明显的降血糖功效。

糖尿病患者中出现肾脏和心脏并发症的情况常见。蛋白尿(proteinuria)的减少说明肾脏功能已恢复。为了观察圆叶茑萝提取物对肾脏的影响，实施尿蛋白分析实验。采取给予实施例2制造的圆叶茑萝提取物12周的小鼠的尿样，并利用elisa试剂盒(exocell,america)进行测定。

其结果，如图9所显示，糖尿病小鼠对照群的尿蛋白高于普通小鼠对照群的尿蛋白，但在对糖尿病小鼠提供以0.1mg/ml浓度稀释圆叶茑萝提取物的水的群中，显示出尿蛋白数值明显减少的效果。

实验例5:糖尿病小鼠的肝毒性检查

购买6周龄的小鼠和6周龄的糖尿病小鼠，并在规定温度(25℃)和湿度(50％)下适应1周后，用于肝毒性检查。

小鼠按每群组5只分组，分为普通小鼠对照群、糖尿病小鼠对照群、对糖尿病小鼠提供以0.1mg/ml浓度稀释实施例2制造的圆叶茑萝提取物的水的群组，并饲养12周。饲养12周以后，采取血液，测定丙氨酸转氨酶浓度。

丙氨酸转氨酶为氨基酸的代谢酶，用作诊断及观察过程的代表性检查项目。保持丙氨酸转氨酶的浓度，说明没有肝损伤。

为了确认圆叶茑萝提取物对肝的影响，饲养12周后，采取普通小鼠对照群、糖尿病小鼠对照群、对糖尿病小鼠提供以0.1mg/ml浓度稀释实施例2制造的圆叶茑萝提取物的水的群组的血液，并利用elisa试剂盒(cusabiobiotech,japan)，测定丙氨酸转氨酶浓度的变化。

其结果，如下表1中所显示，对糖尿病小鼠提供以0.1mg/ml浓度稀释实施例2制造的圆叶茑萝提取物的水的群，显示出与普通小鼠对照群类似的数值，因此，确认该提取物对肝没有毒性。

表1对糖尿病小鼠给药12周后的肝毒性测定结果

(单位:iu/l)

实验例6:小鼠的肝毒性检查

购买6周龄的小鼠(malec57bl/6jmouse，20g，中央实验动物，首尔)，并在规定温度(25℃)和湿度(50％)下适应1周后，用于肝毒性检查。

小鼠按每群组5只分组，分为对照群、给予实施例2中制造的圆叶茑萝提取物的群，并以1000mg/kg浓度给药3次后，采取血液，测定丙氨酸转氨酶浓度。

丙氨酸转氨酶为氨基酸的代谢酶，用作诊断及观察过程的代表性检查项目。保持丙氨酸转氨酶的浓度，说明没有肝损伤。为了确认圆叶茑萝提取物对肝的影响，采取对照群、给予圆叶茑萝提取物的群的血液，并利用elisa试剂盒(cusabiobiotech,japan)进行测定。

其结果，如下表2中所示，给予圆叶茑萝提取物的群组，显示出与对照群类似的数值，由此确认该提取物对肝没有毒性。

表2小鼠毒性测定结果

实验例7:小鼠的晶状体培养实验

在糖尿病患者身上，早期就出现白内障，且恶化速度迅速，导致视力急剧下降。患糖尿病会促进水晶体不透明现象。因此，通过晶状体培养实验，调查对糖尿病白内障生成的抑制功效。

摘取小鼠的眼球并放在碘溶液中消毒后只摘取晶状。放在m199培养基中，并在细胞培养器里进行培养。在培养基中添加20mmxylose(木糖)培养时，可以引发水晶体的浑浊度，利用ccd摄像机，测定水晶体的浑浊度。

其结果，如图10表示，确认了：与通过称之为抑制白内障诱发的物质的槲皮素(quercetin)处理的阳性对照群相比，给予实施例2中制造的圆叶茑萝活性炭提取物的群中抑制水晶体浑浊度的效果更优异。

以上，详细叙述了本发明的特征部分，但对本领域技术人员来讲，这种具体的记述仅仅是优选的实施方式而已，本发明的范围并不限定于此。因此，本发明的实质范围，是依照权利要求书及其等价物来定义。

工业实用性

本发明的组合物显示出优秀的降血糖效果、促进胰岛素分泌效果、尿蛋白阻碍作用及减少水晶体混浊效果，因此，对预防或治疗糖尿病及其并发症有显著的功效。

序列表freetext

已附上电子文件。

序列表

<110>韩国生命工学研究院

<120>含有圆叶茑萝提取物的糖尿病治疗用药物组合物

<130>pf-b1137

<140>pct/kr2011/001128

<141>2011-02-21

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