两色金鸡菊提取物在制备治疗血栓形成性疾病药物中的应用的制作方法

本发明属于医药领域，具体涉及两色金鸡菊提取物在制备治疗血栓形成性疾病药物中的应用。

背景技术：

金鸡菊（coreopsistinctorianuff.）又名雪菊，系菊科（compositae）金鸡菊属（coreopsis）的干燥头状花序，单瓣、重瓣或半重瓣，舌状花黄色或金黄色，花期6～9月。大花金鸡菊属于北温带植物，原产于北美，弗罗里达州及墨西哥州，我国1936年作为观赏植物引种子至庐山、南岳等地栽培，目前各地除供观赏外，还用全草入药，而且从花中提取的食用色素，具有清热解毒和降压之功效。新疆金鸡菊广泛分布于和田地区海拔高3000米左右的昆仑山区，有较丰富的野生资源，在民间经常将其干花用来泡茶。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种两色金鸡菊提取物在制备治疗血栓形成性疾病药物中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

两色金鸡菊提取物在制备治疗血栓形成性疾病药物中的应用，所述两色金鸡菊提取物为两色金鸡菊的乙醇提取物。所述治疗血栓形成性疾病药物为抗凝血药物。所述两色金鸡菊提取物可通过抑制血栓素b2（txb2）生成、促进6酮-前列腺素f1α（6-keto-pg）生成、抑制二磷酸腺苷（adp）诱导的血小板聚集达到抗凝血功能。

优选地，所述的乙醇提取物通过包括如下步骤的方法得到：两色金鸡菊先用浓度为50～80vt%的乙醇溶液浸渍5～15h，再于50～80℃回流提取，提取液浓缩、干燥。

优选地，回流提取的料液比为1:10～20。

两色金鸡菊提取物在制备治疗血栓形成性疾病药物中的应用，所述治疗血栓形成性疾病药物为抗凝血药物，通过抑制血栓素b2生成、促进6酮-前列腺素f1α生成、抑制由二磷酸腺苷诱导的血小板聚集、抑制由胶原蛋白（col）诱导的血小板聚集达到抗凝血功能，所述两色金鸡菊提取物通过如下方法得到：

（1）两色金鸡菊的乙醇提取物过大孔树脂柱，依次用水、乙醇溶液洗脱，收到乙醇洗脱液；

（2）步骤（1）的乙醇洗脱液过聚酰胺柱，用乙醇溶液洗脱，得到的洗脱液浓缩、干燥。

优选地，步骤（1）洗脱所用的乙醇溶液浓度为50～80vt%，步骤（2）洗脱所用的乙醇溶液浓度为10～70vt%。

本文中，以ete表示两色金鸡菊的乙醇提取物，以etep表示ete进一步经过上述大孔树脂和聚酰胺处理后得到的部位。

药效学实验

两色金鸡菊乙醇提取物（ete）对大鼠急性血栓模型的影响

材料与仪器

分组及给药

将72只spraguedawley大鼠按体重随机分成6组，每组12只雌雄各半，即空白组、急性血栓模型组、阿司匹林组（拜阿司匹林10mg/kg）、高剂量组（ete1.2g/kg）、中剂量组（ete0.6g/kg）、低剂量组（ete0.3g/kg），灌胃给药，空白组和模型组大鼠灌胃给予等体积的空白溶剂。给药21天，每天一次，灌胃量10ml/kg。

急性血栓模型的建立

末次给药1h后，腹腔注射4%戊巴比妥钠（40mg/kg）麻醉，分离左侧颈总动脉。将吸有20%三氯化铁的1cm×1cm的滤包裹分离出的颈总动脉，计时20min后取下。空白组用生理盐水浸泡滤纸，结扎纸小片两侧血管取下血栓称重并做病理切片；腹主动脉取血，edta抗凝血测定血浆txb2及血浆6-keto-pg；3.8%枸橼酸钠抗凝血（枸橼酸钠：全血为1:9，v/v）用于aptt、pt、tt和fib含量的测定。

统计学方法

采用spss17.0软件包对数据进行处理。结果以表示，数据先进行正态性检验，符合正态分布组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，p＜0.05为具有统计学意义。

实验结果

凝血四项及平均栓重结果

凝血四项及平均栓重结果见表1。

表1各组凝血四项及平均栓重的结果（n=12）

注：*与空白组比较p＜0.05，**与空白组比较p＜0.01

#与模型组比较p＜0.05，##与模型组比较p＜0.01

pt结果显示：与空白组相比，模型组的pt明显缩短，且差异具有统计学意义；与空白组相比，高、中剂量组的明显pt延长，且差异具有统计学意义；与空白组相比，低剂量组和阿司匹林组的pt没有明显延长；与模型组相比，高、中、低剂量组及阿司匹林组的pt均明显延长，且差异具有统计学意义，给予ete干预后，对pt的延长程度显示出剂量依赖性，低剂量延长pt的作用与阿司匹林相当，中剂量和高剂量延长pt的作用优于阿司匹林。

tt结果显示：与空白组相比，模型组的tt缩短，且差异具有统计学意义；与空白组相比，高、中、低剂量组tt均有不同程度的缩短，且差异具有统计学意义；与空白组相比，阿司匹林组的tt没有明显缩短；与模型组相比，阿司匹林组的tt明显延长，且差异具有统计学意义。

aptt结果显示：与空白组相比，模型组和低剂量组的aptt缩短，且差异具有统计学意义；与空白组相比，高剂量组的aptt延长，且差异具有统计学意义；与模型组相比，高、中剂量组和阿司匹林组的aptt均明显延长，且差异具有统计学意义，给予ete干预后，对aptt延长程度显示出剂量依赖性，高剂量延长aptt的作用优于阿司匹林。

fib结果显示：本实验的干预对fib的含量没有明显影响。

平均栓重结果显示：与空白组相比，模型组的平均栓重明显增加，且差异具有统计学意义；与空白组相比，高、中、低剂量组和阿司匹林组的平均栓重均有不同程度增加，且差异具有统计学意义；与模型组相比，高、中、低剂量组和阿司匹林组的平均栓重均明显减轻，差异且具有统计学意义，给予ete干预后，对平均栓重减轻程度显示出剂量依赖性，中剂量减轻平均栓重的作用与阿司匹林相当，高剂量减轻平均栓重的作用优于阿司匹林。

血浆txb2含量及血浆6-keto-pg含量结果

血浆txb2含量及血浆6-keto-pg含量结果见表2。

表2各组血浆txb2及血浆6-keto-pg结果（n=12）

注：*与空白组比较p＜0.05，**与空白组比较p＜0.01

#与模型组比较p＜0.05，##与模型组比较p＜0.01

6-keto-pg含量结果显示：与空白组相比，模型组、低剂量组和阿司匹林组血浆中6-keto-pg的含量均下降，且差异具有统计学意义；与空白组相比，高、中剂量组血浆中6-keto-pg的含量均上升，差异且具有统计学意义；与模型组相比，高、中、低剂量组和阿司匹林组血浆中6-keto-pg的含量均上升，且差异具有统计学意义，给予ete干预后，血浆中6-keto-pg的含量增加程度显示出剂量依赖性，低剂量增加血浆中6-keto-pg的含量的作用与阿司匹林相当，高剂量、中剂量增加血浆中6-keto-pg的含量的作用优于阿司匹林。

txb2含量结果显示：与空白组相比，模型组血浆txb2含量增加，且差异具有统计学意义；与空白组相比，高、中、低剂量组和阿司匹林组血浆txb2含量均减少，差异且具有统计学意义；与模型组相比，高、中、低剂量组和阿司匹林组血浆txb2含量均减少，且差异具有统计学意义，给予ete干预后，血浆中的txb2含量减少程度显示出剂量依赖性。

血管组织的病理形态学改变的分析报告

一、各组血管改变的常规病理变化如图1-6所示

二、结果：

光镜下（100×、400×）观察血管组织形态，结果显示：

生理盐水组（图1共9例）：血管管壁结构完整，层次清晰。内膜内皮细胞完好，均无增生、肿胀等病理形态，弹力纤维排列整齐，环层平滑肌细胞排列完好，外膜为较薄的纤维结缔组织。

模型组（图2共12例）：血管内膜完整性缺失，内皮细胞破坏，弹力纤维断裂。管壁扩张、变薄、纤维化改变。内见混合性血栓形成。

ete高剂量组（图3共11例）：血管内膜完整性缺失，内皮细胞破坏，弹力纤维断裂。管壁扩张、变薄、纤维化改变。内见血栓溶解。与m组比较改善明显。

ete中剂量组（图4共12例）：血管内膜完整性缺失，内皮细胞破坏，弹力纤维断裂。管壁扩张、变薄、纤维化改变。内见血栓溶解。与m组比较改善明显。

ete低剂量组（图5共10例）：血管内膜完整性缺失，内皮细胞破坏，弹力纤维断裂。管壁扩张、变薄、纤维化改变。内见血栓部分溶解。与m组比较有改善。

阿司匹林组（图6共12例）：血管内膜完整性缺失，内皮细胞破坏，弹力纤维断裂。管壁扩张、变薄、纤维化改变。内见血栓溶解。与m组比较改善明显。

三、结论

1、模型组与生理盐水组比较，其病理变化符合血栓形成病理改变，模型造模成功；

2、各组血栓病理变化改善情况比较：ete高剂量组＞ete中剂量组≈阿司匹林组＞ete低剂量组，各组与模型组比较病理变化都有改善，其中ete高剂量组、中剂量组、阿司匹林组与模型组比较病理变化改善明显。

两色金鸡菊提取物抗凝血作用研究

1.1两色金鸡菊醇提物对小鼠出、凝血时间的影响

将km小鼠按体重随机分组，每组10只雌雄各半。分组及给药情况：蒸馏水组，阿司匹林组（asp0.05g/kg），醇提物组（ete1.28g/kg），灌胃给药，连续7天。末次给药30min后，用断尾法测定出血时间，玻璃片法测定凝血时间。

1.2两色金鸡菊提取物（ete、etep）对健康志愿者血小板聚集的影响

1.2.1血浆样品的制备

采集健康志愿者静脉血，血液以3.8%枸橼酸钠抗凝（9：1）。血浆先以1200r/min离心10min，吸取上层富血小板血浆（prp），剩余血液3000r/min，离心15min，吸取上清液为贫血小板血浆（ppp）。用ppp调整prp中的血小板个数为2～3×10¹¹个/l。

1.2.2体外对adp诱导的健康志愿者血小板聚集的影响

用490-4d血小板凝聚仪测定血小板聚集率。按照born比浊法，在比色杯中分别加入ppp和250μl调整好血小板数的prp，在比色杯中同时加入30μl供试液，在37℃下孵育5min，用ppp调零，在加入10μladp测定血小板聚集率，记录5min内最大聚集率。血小板抑制率=（对照组最大抑制率-药物组最大抑制率）/对照组最大抑制率×100%。

1.2.3体外对col诱导的健康志愿者血小板聚集的影响

用490-4d血小板凝聚仪测定血小板聚集率。按照born比浊法，在比色杯中分别加入ppp和250μl调整好血小板数的prp，在比色杯中同时加入30μl供试液，在37℃下孵育5min，用ppp调零，在加入30μlcol测定血小板聚集率，记录5min内最大聚集率。血小板抑制率=（对照组最大抑制率-药物组最大抑制率）/对照组最大抑制率×100%。

1.3统计方法

数据以表示，采用spss17.0软件包进行统计学处理，组间比较采用单因素方差分析（one-wayanova）。

2.结果

2.1两色金鸡菊醇提物对小鼠出、凝血时间的影响

与对照组相比，两色金鸡菊醇提物组能显著延长小鼠出、凝血时间（p＜0.01），且与阿司匹林组相比，两色金鸡菊醇提物组出血时间显著延长（p＜0.01）（表3）。

表3两色金鸡菊醇提物对小鼠出、凝血时间的影响（n=10）

与对照组比较：*p＜0.01

与阿司匹林组比较：#p＜0.01

2.2两色金鸡菊提取物体外对adp诱导的健康志愿者血小板聚集的影响

与对照组相比，ete组：300μg/ml能明显抑制adp诱导的健康志愿者血小板聚集（p＜0.05），900μg/ml抑制作用显著（p＜0.01）；etep组：450μg/ml对adp诱导的健康志愿者血小板聚集抑制作用显著（p＜0.01）（表4）。

表4两色金鸡菊提取物体外对adp诱导的健康志愿者血小板聚集的影响（n=6）

与对照组比较：*p＜0.05,**p＜0.01

2.3两色金鸡菊提取物体外对col诱导的健康志愿者血小板聚集的影响

与对照组相比，ete各浓度对col诱导的健康志愿者血小板聚集无明显抑制作用；etep150μg/ml抑制作用显著（p＜0.05）（表5）。

表5两色金鸡菊提取物体外对col诱导的健康志愿者血小板聚集的影响（n=6）

3.讨论

本实验研究结果表明，两色金鸡菊醇提物可显著延长小鼠出血时间和凝血时间，且延长小鼠出血时间效果要优于阿司匹林，因此可初步说明两色金鸡菊醇提物具有一定的抗凝血活性。

与空白对照组相比，ete中剂量（300μg/ml）组能明显抑制adp引起健康志愿者血小板聚集（p＜0.05），高剂量（900μg/ml）组抑制作用显著（p＜0.01）；etep高剂量（450μg/ml）组也同样表现出显著的抑制作用（p＜0.01），呈现剂量依赖关系。对col引起的健康志愿者血小板聚集，ete各浓度组均不能起到抑制作用，etep中剂量组（150μg/ml）能明显抑制血小板聚集（p＜0.05）。本研究通过在体和体外两部分实验证明两色金鸡菊提取物可以不同程度的抑制adp、col引起的健康志愿者血小板聚集，具有抗凝血的药理作用。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是生理盐水组的血管组织形态；

图2是模型组的血管组织形态；

图3是ete高剂量组的血管组织形态；

图4是ete中剂量组的血管组织形态；

图5是ete低剂量组的血管组织形态；

图6是阿司匹林组的血管组织形态。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

取两色金鸡菊(1000g)置多功能提取罐中，于浓度为50vt%的乙醇溶液中浸渍5h（料液比1:10g:ml），回流提取2.5h（温度50℃），所得提取液滤过。药渣再用浓度为50vt%的乙醇溶液回流提取2.5h（料液比1:10g:ml，温度50℃），滤过。合并滤液，至浓缩罐中减压浓缩（物料温度49℃，真空度0.08mpa），得浓缩液4l。浓缩液置于旋转蒸发仪中旋转蒸发置1000ml。得到的浓缩液置于真空干燥箱中干燥（50～80℃，真空度0.09mpa），得棕黄色粉末（ete）。

实施例2

取两色金鸡菊(1000g)置多功能提取罐中，于浓度为80vt%的乙醇溶液中浸渍15h（料液比1:20g:ml），回流提取2.5h（温度80℃），所得提取液滤过。药渣再用浓度为80vt%的乙醇溶液回流提取2.5h（料液比1:20g:ml，温度80℃），滤过。合并滤液，至浓缩罐中减压浓缩（物料温度49℃，真空度0.08mpa），得浓缩液4l。浓缩液置于旋转蒸发仪中旋转蒸发置1000ml。得到的浓缩液置于真空干燥箱中干燥（50～80℃，真空度0.09mpa），得棕黄色粉末（ete）。

实施例3

hpd-100大孔树脂，湿法装柱，将浓度为10mg/ml的两色金鸡菊提取物（将实施例1的ete用乙醇溶解得到）上样，吸附12h后，以5bv的蒸馏水淋洗脱至流出液无色澄清，无醇味为止，再用5bv浓度为50vt%的乙醇溶液使进行洗脱，收集醇洗脱液。将收集的醇洗脱液上聚酰胺柱，以聚酰胺填料吸附0.5h后，用1bv浓度为10vt%的乙醇溶液洗脱，得到的洗脱液置于旋转蒸发仪中于50～80℃旋蒸至浸膏状，将浸膏移至真空干燥箱内，于50～80℃减压干燥得到棕黄色粉末（etep）。

实施例4

hpd-100大孔树脂，湿法装柱，将浓度为30mg/ml的两色金鸡菊提取物（将实施例2的ete用乙醇溶解得到）上样，吸附12h后，以10bv的蒸馏水淋洗脱至流出液无色澄清，无醇味为止，再用10bv浓度为80vt%的乙醇溶液使进行洗脱，收集醇洗脱液。将收集的醇洗脱液上聚酰胺柱，以聚酰胺填料吸附3h后，用10bv浓度为70vt%的乙醇溶液洗脱，得到的洗脱液置于旋转蒸发仪中于50～80℃旋蒸至浸膏状，将浸膏移至真空干燥箱内，于50～80℃减压干燥得到棕黄色粉末（etep）。

本发明所述的乙醇溶液为乙醇的水溶液。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。