肺炎链球菌疫苗的制作方法

本发明涉及生物医药领域。具体地，本发明涉及肺炎链球菌疫苗。更具体地，本发明涉及肺炎链球菌疫苗、制备抗体的方法、抗体、人工抗体、制剂在制备药物中的用途及试剂在制备试剂盒中的用途。

背景技术：

肺炎链球菌是当今国际范围内引起人类肺炎、脑膜炎和败血症等传染性疾病的重要病原体，两岁以下婴幼儿对该细菌尤其敏感。

然而，目前肺炎链球菌疫苗仍有待开发。

技术实现要素：

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的问题至少之一。为此，本发明提出了肺炎链球菌疫苗、制备抗体的方法、抗体、人工抗体、制剂在制备药物中的用途及试剂在制备试剂盒中的用途。本发明的肺炎链球菌疫苗能够激活机体免疫系统，产生抗体，吞噬、杀伤肺炎链球菌，从而起到较好的治疗/预防肺炎链球菌相关疾病的效果。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

目前抗肺炎链球菌感染的疫苗大多以该菌的多糖荚膜作为免疫抗原。现已鉴定出肺炎链球菌有近100种化学结构及抗原性不同的荚膜类型，但是目前使用的疫苗最多只能覆盖23种荚膜类型。另外，近年来发现肺炎链球菌菌株能够通过自然转化获得新的荚膜基因，由此转变为非疫苗覆盖的荚膜型，导致疫苗丧失保护效力。

有鉴于此，发明人发现，肺炎链球菌蛋白分子Pbp2b蛋白、SP148蛋白和ScpB蛋白作为抗原能够引发对抗强毒力肺炎链球菌感染的免疫反应，具有疫苗保护特性。此外，生物信息学分析表明Pbp2b、SP148和ScpB蛋白在不同荚膜类型的肺炎链球菌菌株中具有高度保守性，具有较强的广谱性。

为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种肺炎链球菌疫苗。所述肺炎链球菌疫苗含有选自下列的至少之一：(1)选自Pbp2b蛋白、SP148蛋白和ScpB蛋白的至少之一；(2)编码(1)的核酸；(3)(2)的互补核酸；以及(4)与(2)和(3)的至少之一具有至少80％同源性的核酸。发明人发现，肺炎链球菌蛋白分子Pbp2b蛋白、SP148蛋白和ScpB蛋白作为抗原能够激活机体免疫系统，产生抗体，吞噬、杀伤肺炎链球菌，从而起到较好的治疗或预防肺炎链球菌相关疾病的效果。此外，生物信息学分析表明Pbp2b、SP148和ScpB蛋白在不同荚膜类型的肺炎链球菌菌株中具有高度保守性，具有较强的广谱性。

在本发明的另一方面，本发明提出了一种制备抗体的方法，所述抗体针对肺炎链球菌。根据本发明的实施例，所述方法包括：(a)使动物接触选自下列的至少之一：(1)选自Pbp2b蛋白、SP148蛋白和ScpB蛋白的至少之一；(2)编码(1)的核酸；(3)(2)的互补核酸；以及(4)与(2)和(3)的至少之一具有至少80％同源性的核酸，(b)从所述动物的血液中分离所述抗体。发明人发现，肺炎链球菌蛋白分子Pbp2b蛋白、SP148蛋白和ScpB蛋白作为抗原能够激活机体免疫系统，产生抗体，吞噬、杀伤肺炎链球菌，从而起到较好的治疗或预防效果。进而，通过使动物接触Pbp2b蛋白、SP148蛋白和/或ScpB蛋白、编码上述蛋白的核酸和/或其互补核酸，和/或与其具有至少80％同源性的核酸，能够激活动物机体的免疫系统，从而产生抗体。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种抗体。根据本发明的实施例，所述抗体是通过前面所描述的制备抗体的方法制备的。发明人发现，肺炎链球菌蛋白分子Pbp2b蛋白、SP148蛋白和ScpB蛋白能够激活动物体的免疫系统，从而获得抗体。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种人工抗体。根据本发明的实施例，所述人工抗体与前面所描述的抗体具有相同的抗原决定簇。

在本发明的又一方面，本发明提出了制剂在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗或者预防肺炎链球菌相关疾病，所述制剂包括下列的至少之一：(1)选自Pbp2b蛋白、SP148蛋白和ScpB蛋白的至少之一；(2)编码(1)的核酸；(3)(2)的互补核酸；(4)与(2)和(3)的至少之一具有至少80％同源性的核酸；(5)前面所述的抗体；以及(6)前面所述的人工抗体。发明人发现，上述制剂能够激活机体的免疫系统，产生抗体，吞噬、杀伤肺炎链球菌，从而能够有效地治疗或者预防肺炎链球菌相关疾病。

在本发明的又一方面，本发明提出了试剂在制备试剂盒中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂盒用于诊断肺炎链球菌相关疾病，所述试剂特异性检测选自下列的至少之一：(1)选自Pbp2b蛋白、SP148蛋白和ScpB蛋白的至少之一；(2)编码(1)的核酸；(3)(2)的互补核酸；以及(4)与(2)和(3)的至少之一具有至少80％同源性的核酸。发明人发现，肺炎链球菌蛋白分子Pbp2b蛋白、SP148蛋白和ScpB蛋白作为抗原能够激活机体免疫系统。进而，能够特异性检测Pbp2b蛋白、SP148蛋白和/或ScpB蛋白、编码上述蛋白的核酸和/或其互补核酸、和/或与核酸具有至少80％同源性的核酸的试剂，同样能够诊断肺炎链球菌相关疾病。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的调理吞噬杀菌试验结果分析示意图；

图2显示了根据本发明一个实施例的免疫后小鼠血清中的抗体含量示意图；

图3显示了根据本发明一个实施例的呼吸道感染试验结果分析示意图；以及

图4显示了根据本发明一个实施例的全身系统感染试验结果分析示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明提出了肺炎链球菌疫苗、制备抗体的方法、抗体、人工抗体、制剂在制备药物中的用途及试剂在制备试剂盒中的用途。下面将分别对其进行详细描述。

肺炎链球菌疫苗

为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种肺炎链球菌疫苗。肺炎链球菌疫苗含有选自下列的至少之一：(1)选自Pbp2b蛋白、SP148蛋白和ScpB蛋白的至少之一；(2)编码(1)的核酸；(3)(2)的互补核酸；以及(4)与(2)和(3)的至少之一具有至少80％同源性的核酸。发明人发现，肺炎链球菌蛋白分子Pbp2b蛋白、SP148蛋白和ScpB蛋白作为抗原能够激活机体免疫系统，产生抗体，吞噬、杀伤肺炎链球菌，从而起到较好的治疗或预防肺炎链球菌相关疾病的效果。此外，生物信息学分析表明Pbp2b、SP148和ScpB在不同荚膜类型的肺炎链球菌菌株中具有高度保守性，具有较强的广谱性。

根据本发明的实施例，疫苗含有Pbp2b蛋白、SP148蛋白和ScpB蛋白的至少之一。由此，肺炎链球菌蛋白分子Pbp2b蛋白、SP148蛋白和ScpB蛋白作为抗原能够引发对抗强毒力肺炎链球菌感染的免疫反应，具有疫苗保护特性。此外，生物信息学分析表明Pbp2b、SP148和ScpB在不同荚膜类型的肺炎链球菌菌株中具有高度保守性，具有较强的广谱性。

根据本发明的实施例，肺炎链球菌疫苗进一步含有其他肺炎链球菌疫苗，根据本发明的具体实施例，其他肺炎链球菌疫苗包括荚膜多糖疫苗。由此，以进一步提高疫苗对于不同荚膜类型菌株的覆盖面，以提高治疗或预防效果。

制备抗体的方法

在本发明的另一方面，本发明提出了一种制备抗体的方法，抗体针对肺炎链球菌。根据本发明的实施例，方法包括：(a)使动物接触选自下列的至少之一：(1)选自Pbp2b蛋白、SP148蛋白和ScpB蛋白的至少之一；(2)编码(1)的核酸；(3)(2)的互补核酸；以及(4)与(2)和(3)的至少之一具有至少80％同源性的核酸，(b)从动物的血液中分离抗体。发明人发现，肺炎链球菌蛋白分子Pbp2b蛋白、SP148蛋白和ScpB蛋白作为抗原能够激活机体免疫系统，产生抗体，吞噬、杀伤肺炎链球菌，从而起到较好的治疗或预防效果。进而，通过使动物接触Pbp2b蛋白、SP148蛋白和/或ScpB蛋白、编码上述蛋白的核酸和/或其互补核酸，和/或与其具有至少80％同源性的核酸，能够激活动物机体的免疫系统，从而产生抗体。

根据本发明的实施例，动物为鼠、狗、猴、羊、猪、兔、骆驼的至少之一。由此，能够获得大量抗体。

抗体

在本发明的又一方面，本发明提出了一种抗体。根据本发明的实施例，抗体是通过前面所描述的制备抗体的方法制备的。发明人发现，肺炎链球菌蛋白分子Pbp2b蛋白、SP148蛋白和ScpB蛋白能够激活动物体的免疫系统，从而获得抗体。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对制备抗体的方法所描述的特征和优点，同样适用于该抗体，在此不再赘述。

人工抗体

在本发明的又一方面，本发明提出了一种人工抗体。根据本发明的实施例，人工抗体与前面所描述的抗体具有相同的抗原决定簇。

需要说明的是，本发明对于人工抗体的种类不作严格限定，可以为单克隆抗体、多克隆抗体或者基因工程抗体，可以根据实际情况采用所需方式获得。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对抗体所描述的特征和优点，同样适用于该人工抗体，在此不再赘述。

制剂在制备药物中的用途

在本发明的又一方面，本发明提出了制剂在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，药物用于治疗或者预防肺炎链球菌相关疾病，制剂包括下列的至少之一：(1)选自Pbp2b蛋白、SP148蛋白和ScpB蛋白的至少之一；(2)编码(1)的核酸；(3)(2)的互补核酸；(4)与(2)和(3)的至少之一具有至少80％同源性的核酸；(5)前面所描述的抗体；以及(6)前面所描述的人工抗体。发明人发现，上述制剂能够激活机体的免疫系统，产生抗体，吞噬、杀伤肺炎链球菌，从而能够有效地治疗或者预防肺炎链球菌相关疾病。

本发明所使用的术语“肺炎链球菌相关疾病”主要是指感染肺炎链球菌而引发的疾病。例如肺炎、脑膜炎和败血症等。

需要说明的是，本发明所使用的术语“治疗”用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病(例如预防肺炎链球菌相关疾病病)或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文制剂的药物给予有需要的个体。

本发明的制剂的给药频率和剂量可以通过多个相关因素被确定，该因素包括要被治疗的疾病类型，给药途径，病人年龄，性别，体重和疾病的严重程度以及作为活性成分的药物类型。根据本发明的一些实施例，日剂量可分为适宜形式的1剂、2剂或多剂，以在整个时间段内以1次、2次或多次给药，只要达到治疗有效量即可。

术语“治疗有效量”是指化合物足以显著改善某些与疾病或病症相关的症状的量，也即为给定病症和给药方案提供治疗效果的量。例如，在肺炎链球菌相关疾病治疗中，减少、预防、延缓、抑制或阻滞疾病或病症的任何症状的药物或化合物应当是治疗有效的。治疗有效量的药物或化合物不需要治愈疾病或病症，但将为疾病或病症提供治疗，使得个体的疾病或病症的发作被延缓、阻止或预防，或者疾病或病症的症状得以缓解，或者疾病或病症的期限被改变，或者例如疾病或病症变得不严重，或者加速康复。根据本发明的具体实施例，肺炎链球菌蛋白分子Pbp2b蛋白、SP148蛋白和ScpB蛋白各自独立地作为疫苗的有效剂量在小鼠实验中为每次5μg(对应体重约200μg/kg)，共免疫三次，每次间隔14天。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对抗体和人工抗体所描述的特征和优点，同样适用于该制剂在制备药物中的用途，在此不再赘述。

试剂在制备试剂盒中的用途

在本发明的又一方面，本发明提出了试剂在制备试剂盒中的用途。根据本发明的实施例，试剂盒用于诊断肺炎链球菌相关疾病，试剂特异性检测选自下列的至少之一：(1)选自Pbp2b蛋白、SP148蛋白和ScpB蛋白的至少之一；(2)编码(1)的核酸；(3)(2)的互补核酸；以及(4)与(2)和(3)的至少之一具有至少80％同源性的核酸。发明人发现，肺炎链球菌蛋白分子Pbp2b蛋白、SP148蛋白和ScpB蛋白作为抗原能够激活机体免疫系统。进而，能够特异性检测Pbp2b蛋白、SP148蛋白和/或ScpB蛋白、编码上述蛋白的核酸和/或其互补核酸、和/或与核酸具有至少80％同源性的核酸的试剂，同样能够检测肺炎链球菌相关疾病。

根据本发明的实施例，试剂包括前面所描述的抗体或人工抗体。由于前面所描述的抗体或人工抗体能够与Pbp2b蛋白、SP148蛋白和/或ScpB蛋白发生特异性结合，那么若机体感染肺炎链球菌相关疾病，则肺炎链球菌会与抗体或人工抗体发生特异性结合，产生可检测信号，从而实现对肺炎链球菌相关疾病的诊断。

需要说明的是，本发明对于肺炎链球菌相关疾病不作严格限定，例如可以为感染肺炎链球菌引发的肺炎、脑膜炎和败血症等。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对抗体和人工抗体所描述的特征和优点，同样适用于该试剂在制备试剂盒中的用途，在此不再赘述。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1调理吞噬杀菌试验

调理吞噬杀菌试验参考了已经发表的标准实验方法，主要步骤如下：将经过热灭活的血清样品进行稀释并与细菌混合，室温振荡孵育30分钟后加入经过诱导分化的中性粒细胞及补体，混合物在37℃振荡孵育45分钟后冰上放置10分钟终止反应，然后将混合物进行梯度稀释和涂布平板，37℃过夜培养后通过对存活细菌计数推算吞噬杀伤比例。

在调理吞噬杀菌试验中，与免疫前血清相比，使用分别经过Pbp2b、SP148和ScpB蛋白免疫的兔血清可以显著增强中性粒细胞对肺炎链球菌的杀伤能力，达到50％吞噬杀伤效果时对应的血清稀释度在36倍以上(详见图1，虚线表示吞噬杀伤效果为50％)。该结果证明用Pbp2b、SP148和ScpB进行免疫可以刺激动物体内产生有效促进免疫系统吞噬杀伤肺炎链球菌的抗体。

实施例2蛋白的免疫抗原性检测

动物试验使用了成年雌性Balb/c小鼠。分别将纯化的Pbp2b蛋白、SP148蛋白和ScpB蛋白用PBS稀释并加入30％体积的氢氧化铝佐剂，实验组每只小鼠注射100μL(含5μg蛋白)，分别在14天和28天后加强免疫。对照组小鼠只注射不含上述免疫蛋白的PBS与佐剂。在完成三次免疫后的第7天采集小鼠静脉血样品，收集血清作为一抗进行酶联免疫吸附分析，用纯化的蛋白作为底物，计算血清中的抗体效价。

结果表明，经过皮下注射Pbp2b蛋白、SP148蛋白和ScpB蛋白对小鼠免疫后(以氢氧化铝为佐剂)，小鼠体内产生了针对该蛋白抗原的高效价抗体(见图2)。

实施例3主动免疫保护试验-呼吸道感染

实施例2的小鼠在完成三次免疫后的第21天，对小鼠进行麻醉，并由鼻腔滴入含有5×10⁶个肺炎链球菌的PBS悬液40μL。7天后处死小鼠，用无菌PBS灌洗鼻腔并取出肺组织进行研磨，将灌洗液和研磨液稀释涂布平板，过夜培养后计算细菌的数量和密度，并比较实验组与对照组(滴入不含肺炎链球菌的PBS悬液)的差别，进行统计学分析。

结果表明，Pbp2b蛋白、SP148蛋白和ScpB蛋白表现出了显著的免疫保护效果。其中，在呼吸道感染模型中，Pbp2b蛋白和ScpB蛋白的免疫显著降低了小鼠鼻腔内定植的细菌密度，SP148蛋白和ScpB蛋白的免疫显著降低了小鼠肺组织中细菌的含量(见图3)。

实施例4主动免疫保护试验-全身系统感染

实施例2的小鼠在完成三次免疫后的第21天，对小鼠经腹腔注射含有约100个肺炎链球菌的PBS悬液100μL肺炎链球菌。在接下来的14天内每天监测小鼠的死亡及存活情况，并比较实验组与对照组(注射不含肺炎链球菌的PBS悬液)的差别，进行统计学分析。

结果表明，Pbp2b蛋白、SP148蛋白和ScpB蛋白的免疫均可显著提高小鼠在腹腔注射感染后的生存率(见图4)。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。