本发明涉及医药技术领域，特别涉及尤其涉及甘草宁m在制备治疗血栓性疾病药物中的应用。
背景技术：
血栓栓塞性疾病是目前严重危害中老年人健康的疾病，其发病率高，致残致死率高。血栓形成是多因素参与、渐进发展的复杂过程，血液在流动状态下因血小板的活化和凝血因子被激活而发生的异常凝固。血栓形成在心脑血管疾病的发生与发展中起促进作用，也是引起死亡和致残的主要原因之一。血栓形成的条件包括血管内膜损伤、血流状态的改变和血液凝固性增加。因此，抑制血小板功能和防止血液凝固可预防血栓形成。临床上应用的抗血小板和抗凝血酶药物较多，如血小板环氧化酶抑制剂阿司匹林、血小板内环核苷酸抑制剂双嘧达莫、二磷酸腺苷(adp)受体拮抗剂氯吡格雷、抗凝血酶ш(atш)的肝素、维生素k拮抗剂华法林等，这些药物共同的特点是单药、单靶点、且不可逆的抑制，导致不良反应时有发生。因此，寻找多靶点、多通路且疗效显著、安全性高的抗血栓药物具有重要意义。近年来，中药治疗血栓性疾病的研究逐渐引起人们的关注，而且由于很多中药组分属于天然提取药物，具有副作用小等优点。
甘草glycyrrhizaeradixetrhizoma.为豆科植物乌拉尔甘草(glycyrrhizauralensisfisch.)、胀果甘草(glycyrrhizainflatabat.)或光果甘草(glycyrrhizaglabral.)的干燥根及根茎，是一种常用的中药。近年来的研究显示，甘草中所含有的黄酮类成分具有较强的抗氧化、抗动脉粥样硬化和一定的降血脂、降血压等作用。
甘草宁m(gancaoninm，c21h20o5，cas号：129145-51-3)是甘草中的黄酮类成分，其结构式如式i所示：
有关甘草宁m在药理研究报道甚少，更未见甘草宁m在制备治疗血栓性疾病药物中应用的报道。
技术实现要素：
本发明旨在从中药中寻找一种能够预防和/或治疗血栓性疾病的天然提取药物。本发明令人意外地发现从甘草中提取出来的甘草宁m能显著地抑制大鼠颈动静脉旁路血栓形成，且具有一定的抗氧化活性，对脑血栓具有明显的保护作用。
有鉴于此，本发明提出了甘草宁m在制备治疗和/或预防血栓性疾病的药物中的应用。
进一步地，所述血栓性疾病为动静脉旁路血栓。
进一步地，所述血栓性疾病为脑血栓。
本发明还提出了一种用甘草宁m制成的治疗和/或预防血栓性疾病的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
具体地，所述药物的剂型为口服给药剂型、注射给药剂型或外用给药制剂。
进一步地，所述口服给药剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、口服液剂、煎膏剂、悬浮剂、分散剂或糖浆剂。
所述注射给药剂型为注射液剂或注射用粉针剂。
所述外用给药制剂为栓剂、贴剂或凝胶剂。
优选地，通过剂量换算，所述口服给药剂型的甘草宁m剂量为16mg/kg·d-1～64mg/kg·d-1。更优选地，所述甘草宁m的剂量为32mg/kg·d-1～64mg/kg·d-1。
本发明所述甘草宁m购自上海源叶生物科技有限公司，货号129145-51-3。本发明所述的甘草宁m在体内能显著的降低动静脉旁路血栓的重量并同时显著提高血栓大鼠血浆中no，cgmp，pgi2水平；表明甘草宁m可以通过影响no/cgmp代谢通路及改变pgi2的水平而抑制血小板聚集。
此外，甘草宁m可以显著减轻脑血栓引起脑水肿程度，并能降低脑组织中mda含量，增加sod活性；表明该化合物具有一定的抗氧化活性，对脑血栓具有明显的保护作用。
具体实施方式
如前所述，本发明旨在提供甘草宁m在制备治疗和/或预防血栓性疾病的药物中的应用。以下将结合实验的内容进行具体描述。
特别需要指出的是，针对本发明所做出的类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明如未注明具体条件者，均按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用原料药或辅料，以及所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
一甘草宁m抗实验性血栓模型大鼠的作用
1实验材料
清洁级sd大鼠60只，雄性，体质量180-220g左右，购于北京维通利华实验动物技术有限公司；pgi2、cgmp和no试剂盒购于南京建成生物工程研究所；其余试剂为国产分析纯。
2实验方法
2.1实验分组及造模
将60只sd大鼠常规喂养一周后随机分为5组：正常对照组、模型组、低、中、高剂量用药组，每组各12只。用药组按100、200、400mg/kg体质量标准灌胃甘草宁m，正常对照组和模型组灌胃等量生理盐水，每日1次，连续2周。末次给药1h后取60只大鼠进行颈动静脉旁路血栓形成实验。将大鼠麻醉(戊巴比妥钠30～40mg/kg,i.p.)，分离右颈总动脉及左颈外静脉，在聚乙烯管中段放入一根长6cm的丝线，以肝素生理盐水溶液(50u/ml)充满聚乙烯管。当聚乙烯管的一端插入左颈外静脉后，由聚乙烯管准确的注入肝素(50u/ml)抗凝，然后再将聚乙烯管的另一端插入右颈总动脉，打开动脉夹，血液从右颈总动脉流至聚乙烯管，返回左颈外静脉，开放血流15min后中断血流，迅速取出丝线称重，总重量减去丝线重量即得血栓重量。同时计算出血栓抑制率。
血栓抑制率(％)＝(模型组组血栓湿重－用药组血栓湿重)/模型组血栓湿重×100％
2.2血浆no，cgmp，pgi2水平的测定测定
取颈动静脉旁路血栓形成实验中的60只大鼠，下腔静脉取血1ml，edta抗凝。按试剂盒说明采用放免法测定cgmp和pgi2，分光光度法测定no。
2.3统计学分析
所得数据结果以均数±标准差
3实验结果
3.1甘草宁m对对动静脉旁路血栓模型的影响
表2所示，正常对照组无血栓形成。与模型组相比，甘草宁m各剂量组的血栓重量明显降低(p<0.01)，具有剂量依赖性。
表2甘草宁m对动静脉旁路血栓的抑制作用
与模型组比较，*p<0.05,**p<0.01.
3.2甘草宁m对大鼠血浆中no,cgmp，pgi2水平影响
表3显示，甘草宁m各剂量组与模型组比较均显著升高血浆中no,pgi2水平(p<0.05或p<0.01)，具有剂量依赖性，除甘草宁m低剂量组外，与模型组比较均可显著提高血浆中cgmp水平(p<0.01)。
表3甘草宁m对大鼠血浆中no,cgmp，pgi2水平影响
与正常对照组比较，##p<0.01；与模型组比较，*p<0.05,**p<0.01.
经我们的实验证实其确实可以显著地抑制大鼠颈动静脉旁路血栓的形成，提高no，cgmp，pgi2水平，这为以后将甘草宁m用于临床药物的开发提供了实验依据。
大鼠颈动静脉旁路法所形成的血栓是血小板血栓，是由于血小板粘附到丝线上产生聚集而引起的，形成的血栓结构类似动脉中的白色血栓，与病理情况比较接近。银杏叶提取物可以有效抑制该血栓的形成，说明其抑制血栓形成的机制可能与抑制血小板聚集有关。
已知no，cgmp，pgi2都与血栓的形成有关。no作为一种信使分子，具有抗血小板聚集，抗血小板和血细胞粘附作用。其作用机制是经no/cgmp代谢通路，使血小板内cgmp升高，通过cgmp的第二信使作用，调节收缩蛋白质磷酸化水平，并使细胞内ca2+水平降低，抑制血小板的聚集从而减少血栓的形成。另有研究发现no可以同时升高pgi2水平，机制较为复杂。前列环素(pgi2)在心血管系统中具有保护作用，它能扩张血管，抑制血小板聚集，并可拮抗性减少血栓素txa2含量，而后者是已知最强的血小板聚集剂。pgi2与txa2的比值对于心血管系统生理功能的稳定与调节至关重要。本实验证实，甘草宁m可以同时升高no，cgmp，pgi2水平，通过影响no/cgmp代谢通路及改变pgi2的水平而抑制血小板聚集，产生溶栓作用。
综上所述，甘草宁m具有抗血栓作用，抑制血小板的聚集有可能是抗栓作用的机制之一。
二甘草宁m对实验性脑血栓模型的影响
1实验材料
清洁级雄性sd大鼠60只，体质量180-220g左右，购于北京维通利华实验动物技术有限公司；超氧化物岐化酶(sod)、丙二醛(mda)测定试剂盒，购于南京建成生物工程研究所；其余试剂为国产分析纯。
2实验方法
2.1实验性脑血栓模型的建立及分组
健康雄性sd大鼠60只，随机分为5组，即正常对照组、模型组、低、中、高剂量用药组，每组各12只。用药组按100、200、400mg/kg体质量标准灌胃甘草宁m，正常对照组和模型组灌胃等量生理盐水。各组大鼠连续灌胃给药2周，每天1次(1ml/100g)。末次给药后1h，参照文献方法复制大鼠脑血栓模型。5min后右颈总动脉按5ml/kg大鼠体质量注射0.5％伊文思蓝溶液；再过5min后迅速断头处死，取出大脑左、右半球，称脑湿重。将脑组织按每克5ml匀浆液(0.5％na2so4：丙酮＝3：7)匀浆，移入试管密封，4℃下静置60min，3000r/min离心10min，取上清，620nm处测定吸光度(a)。以栓塞半球(右侧梗死区，左侧对照区)的光密度与其脑重量之比表示伊文思蓝的含量。
2.2脑血栓大鼠右侧脑指数、脑含水量的检测
健康雄性sd大鼠60只，按“2.1”分组、给药及复制脑血栓模型，3h后，开颅取脑组织，吸去多余的血液，左、右大脑半球称重，计算右侧脑指数、脑含水量(脑干重110℃烤至恒重)。
右侧脑指数＝右侧脑湿重×100/体质量
右侧脑含水量＝(右侧脑湿重－右侧脑干重)/右侧脑湿重×100％
2.3脑缺血大鼠脑组织中sod、mda含量的检测
健康雄性sd大鼠60只，按“2.1”分组、给药及复制脑血栓模型，3h后，开颅取脑组织，右侧大脑半球加生理盐水研磨制成10％的脑组织匀浆，3000r/min离心15min，取上清，－20℃保存，按试剂盒说明书进行sod、mda测定。
2.4统计学分析
所得数据结果以均数±标准差
3实验结果
3.1甘草宁m对大鼠脑梗死区伊文思蓝含量的影响
如表4所示，模型组sd大鼠右侧颈总动脉注射血栓诱导剂后，右侧大脑半球血管通透性增加，伊文思蓝透过血管到达脑组织增多，左侧半球未见蓝染。甘草宁m能剂量依赖性地降低大鼠右侧大脑半球伊文思蓝蓝染程度(p<0.05或p<0.01)。
表4甘草宁m对对大鼠脑梗死区伊文思蓝含量的影响
与正常对照组比较，##p<0.01；与模型组比较，*p<0.05,**p<0.01
3.2甘草宁m对脑血栓大鼠脑指数及脑含水量的影响
正常sd大鼠右侧颈总动脉注射血栓诱导剂并结扎后3h，右侧脑指数、脑含水量以及右/左脑半球重量之比均显著增加；甘草宁m能剂量依赖性的缓解血栓诱导剂导致的大鼠脑水肿，降低右侧脑含水量以及右/左脑半球重量之比(见表5)。
表5甘草宁m对对脑血栓大鼠脑水肿的影响
与正常对照组比较，##p<0.01；与模型组比较，*p<0.05,**p<0.01.
3.3甘草宁m对大鼠脑组织中sod、mda的影响
正常大鼠结扎右侧颈总动脉并给予血栓诱导剂以后，能升高右侧脑组织中mda含量，降低sod活性；甘草宁m可以降低脑组织中mda含量、升高sod活性，部分具有统计学差异，结果见表6。
表6甘草宁m对对脑血栓大鼠脑组织中sod、mda的影响
与正常对照组比较，##p<0.01；与模型组比较，*p<0.05,**p<0.01.
越来越多的证据表明，脑缺血缺氧时，脑内atp耗尽，可使脑细胞正常代谢途径受到破坏，体内自由基大量产生。sod是体内清除自由基的最主要的物质，在缺血性脑血管病急性发作时，sod活性下降，对氧自由基的清除能力降低。自由基大量积聚使得神经细胞膜的完整性受到破坏，出现脑水肿及其他并发症。本实验结果表明，甘草宁m可以显著减轻脑血栓引起的伊文思蓝蓝染和脑水肿程度，并能降低脑组织中mda含量，增加sod活性。以上研究结果显示，甘草宁m具有一定的抗氧化活性，对脑血栓具有明显的保护作用。
在上述实验的基础上，本发明还提出了一种用甘草宁m制成的治疗和/或预防血栓性疾病的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
具体地，所述药物的剂型为口服给药剂型、注射给药剂型或外用给药制剂。
进一步地，所述口服给药剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、口服液剂、煎膏剂、悬浮剂、分散剂或糖浆剂。所述注射给药剂型为注射液剂或注射用粉针剂；所述外用给药制剂为栓剂、贴剂或凝胶剂。
制剂辅料种类和范围的选择、制剂的制备均能够按照本领域常规手段实现。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
上述实验结果表明甘草宁m各剂量组对动静脉旁路血栓或脑血栓都有很好的治疗或预防作用，且具有剂量依赖性。其中，中剂量组、高剂量组对血栓的作用尤为突出，能全面改善所有的血栓指标参数。更优选地，当剂量为400mg/kg·d-1时，最显著地降低大鼠动静脉旁路血栓的重量并同时显著提高血栓大鼠血浆中no,cgmp，pgi2水平，且大大减轻脑血栓引起脑水肿程度，并能降低脑组织中mda含量，增加sod活性。这表明甘草宁m可以通过影响no/cgmp代谢通路及改变pgi2的水平而抑制血小板聚集，该化合物的抗氧化活性也对脑血栓具有明显的保护作用。