本发明涉及骨肽的制备和应用，具体涉及一种用于预防和治疗肿瘤化疗所引起的骨髓损伤的多肽的制备和应用。
背景技术：
目前，癌症治疗方法主要包括手术、放疗和化疗，以化学药物治疗成为了许多晚期肿瘤患者的选择。但是大多数化疗药物是通过损伤细胞核dna或干扰dna的合成而起到杀伤细胞作用，因而对于分裂繁殖旺盛的正常组织细胞(如胃肠道上皮细胞、骨髓造血干细胞、生殖细胞及生发细胞等)均有杀伤作用，产生胃肠道反应、骨髓抑制、脱发、疲劳、免疫抑制或心、肾、神经系统的损害。骨髓抑制是其中最主要的不良反应。临床上出现全血细胞减少，从而继发严重感染、出血、衰竭、死亡。骨髓抑制是多数化疗药的常见毒性反应，大多数化疗药均可引起有不同程度的骨髓抑制，使周围血细胞数量减少，血细胞由多种成分组成，每一种成分都对人体起着不可缺少的作用。外周血红细胞和白细胞都源于骨髓中的干细胞，外周血里的血细胞寿命短，常常需要不断补充。为了达到及时补充的目的，作为血细胞前体的干细胞必须快速分裂。因此骨髓细胞数和外周血中各种血细胞数量直接反应骨髓的造血功能情况。
动物实验表明骨肽提取液能预防和治疗环磷酰胺致小鼠骨髓损伤模型外周血和骨髓造血功能，对化疗药物引起的骨髓损伤具有明显的保护作用。目前对猪骨进行酶解提取，所得骨肽提取液具有抗高血压、预防与治疗骨关节炎和骨质疏松、治疗胃溃疡等疾病、抗衰老和抗氧化等功能，但其在预防和治疗放化疗引起的骨髓损伤方面的新用途尚未挖掘。
技术实现要素：
本发明提出了一种骨肽提取液及其制备方法和在治疗骨髓损伤的应用，可有效治疗和预防因化疗药物引起的骨髓损伤。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：
一种骨肽提取液的制备方法，包括以下步骤：
(1)将猪骨清洗后，在105℃-120℃的温度下蒸煮至骨头变酥；
(2)将变酥的骨头粉碎后，加入水混合后，用胶磨机研磨至骨泥；
(3)在骨泥中加入酸液调节ph值至1-4，加入胃蛋白酶，在35-40℃温度下搅拌12-72h酸化和酶解的骨泥混合物，备用；
(4)将骨泥混合物与水混合煎煮两次，合并两次煎煮液，离心去渣得到粗滤液；
(5)将粗滤液采用碱调节至ph值为6.5-7.5，保持温度为37.5-45℃，加入胰酶酶解，酶解后的物质通过孔径为1.4微米钛型陶瓷膜过滤得粗提取物；
(6)将粗提取物煮沸18-25min灭火，再浓缩得到骨肽提取液。
优选的，所述猪骨、胃蛋白酶和胰酶的质量比为500:1:1。
优选的，所述步骤(2)中加入的水与骨头的质量比为1:1。
优选的，所述步骤(3)中加入的酸液为盐酸、柠檬酸和乳酸中的任意一种或几种。
优选的，所述步骤(5)中胰酶酶解的时间为6h。
本发明还公开了一种通过上述制备方法得到的骨肽提取液。
本发明还公开了一种上述制备方法得到的骨肽提取液在预防和治疗因化疗药物引起的骨髓损伤方面的应用。
本发明骨肽提取液及其制备方法和在治疗骨髓损伤的应用，其有益效果在于：
(1)通过胃蛋白酶和胰酶分别在酸性和弱碱性环境下的对猪骨的混合提取，得到高含量的骨肽提取物，且制备方法简单。
(2)本发明得到的骨肽提取液不仅能够防止胃粘膜溃疡、抑制血压上升、提高骨骼强度、促进皮肤胶原代谢延缓衰老、促进矿物质的吸收作用，还可抗高血压、预防与治疗骨关节炎和骨质疏松、治疗胃溃疡等疾病、抗衰老和抗氧化。最重要的还能在目前癌症化疗易出现的不良反应骨髓抑制具有有效的预防和治疗作用，可效预防和治疗骨髓损伤外周血和骨髓造血功能，改善骨髓增生。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步详细说明本发明。
实施例1
一种骨肽提取液的制备方法，包括以下步骤：
(1)将100g猪骨清洗后，在105℃的温度下蒸煮2-6h至骨头变酥；
(2)将变酥的骨头粉碎至粒度小于1厘米后，加入按照固液比1：1加入水混合后，用胶磨机研磨至骨泥，要求手搓骨泥没有砂粒感即可；
(3)在骨泥中加入盐酸调节ph值至2，加入0.2g胃蛋白酶，在37℃温度下搅拌48h酸化和酶解的骨泥混合物，备用；
(4)将骨泥混合物与水混合煎煮两次，第煎煮1次1.5小时，加200g水；第二次煎煮1小时，加100g水；合并两次煎煮液，离心去渣得到粗滤液；
(5)将粗滤液采用氢氧化钠调节至ph值为7.5，保持温度为37.5-45℃，加入0.2g胰酶酶解，酶解后的物质通过孔径为1.4微米钛型陶瓷膜过滤得粗提取物；
(6)将粗提取物煮沸20min灭火，再浓缩得到骨肽提取液。
实施例2
一种骨肽提取液的制备方法，包括以下步骤：
(1)将100g猪骨清洗后，在105℃的温度下蒸煮2-6h至骨头变酥；
(2)将变酥的骨头粉碎至粒度小于1厘米后，加入按照固液比1：1加入水混合后，用胶磨机研磨至骨泥，要求手搓骨泥没有砂粒感即可；
(3)在骨泥中加入盐酸调节ph值至4，加入0.2g胃蛋白酶，在35℃温度下搅拌72h酸化和酶解的骨泥混合物，备用；
(4)将骨泥混合物与水混合煎煮两次，第煎煮1次1.5小时，加200g水；第二次煎煮1小时，加100g水；合并两次煎煮液，离心去渣得到粗滤液；
(5)将粗滤液采用氢氧化钠调节至ph值为6.5，保持温度为37.5-45℃，加入0.2g胰酶酶解，酶解后的物质通过孔径为1.4微米钛型陶瓷膜过滤得粗提取物；
(6)将粗提取物煮沸20min灭火，再浓缩得到骨肽提取液。
实施例3
一种骨肽提取液的制备方法，包括以下步骤：
(1)将100g猪骨清洗后，在105℃的温度下蒸煮2-6h至骨头变酥；
(2)将变酥的骨头粉碎至粒度小于1厘米后，加入按照固液比1：1加入水混合后，用胶磨机研磨至骨泥，要求手搓骨泥没有砂粒感即可；
(3)在骨泥中加入盐酸调节ph值至1，加入0.2g胃蛋白酶，在37℃温度下搅拌12h酸化和酶解的骨泥混合物，备用；
(4)将骨泥混合物与水混合煎煮两次，第煎煮1次1.5小时，加200g水；第二次煎煮1小时，加100g水；合并两次煎煮液，离心去渣得到粗滤液；
(5)将粗滤液采用氢氧化钠调节至ph值为7.5，保持温度为37.5-45℃，加入0.2g胰酶酶解，酶解后的物质通过孔径为1.4微米钛型陶瓷膜过滤得粗提取物；
(6)将粗提取物煮沸20min灭火，再浓缩得到骨肽提取液。
实施例4
骨肽提取液对环磷酰胺致小鼠骨髓损伤模型的影响(预防给药)
1.1.1造模与分组
balb/c小鼠60只，雌雄各半，体重18～22g，按性别体重随机分为6组，每组10只动物，即：正常对照组、模型对照组、阿胶补血颗粒组(1.04g/kg)、骨肽提取液低(2.73ml/kg)、中(5.46ml/kg)、高剂量组(10.92ml/kg)。各给药组小鼠按20ml/kg灌胃给予相应剂量药液，1次/日，连续30天，正常对照组和模型对照组灌胃给予等体积蒸馏水。于第26天给药后1h，除正常对照组外，其余各组小鼠腹腔注射80mg/kg环磷酰胺，连续注射5天。末次给予环磷酰胺24h后称重并眼眶取血检测血常规，取股骨骨髓，制备骨髓涂片。
1.1.2检测指标
1.1.2.1外周血检测：采用血球分析仪测定血常规，包括白细胞(wbc)计数、血小板(plt)计数、红细胞(rbc)计数、血红蛋白(hgb)。
1.1.2.2骨髓检查：取左侧股骨用镊子将骨髓挤出，与少量小牛血清混匀，制备骨髓涂片，瑞氏染液染色。骨髓象检测是用细胞形态学检查的方法来观察骨髓中细胞的数量和质量的变化，借以了解造血功能。可以在显微镜下观察有核细胞均数来判断骨髓增生程度，骨髓增生程度分为5级，分级与记分标准见表1。
表1骨髓增生程度分级与记分标准
1.2骨肽提取液对环磷酰胺致小鼠骨髓损伤模型的影响(治疗给药)
1.2.1造模与分组
balb/c小鼠72只，雌雄各半，体重18～22g，动物按性别体重随机分为6组，每组12只动物，即：正常对照组、模型对照组、阿胶补血颗粒组(1.04g/kg)、骨肽提取液低(2.73ml/kg)、中(5.46ml/kg)、高剂量组(10.92ml/kg)。除正常对照组12只外，其余小鼠腹腔注射80mg/kg环磷酰胺，连续注射5天，注射环磷酰胺结束后，各组小鼠按20ml/kg灌胃给予相应剂量药液，1次/日，连续14天，每7d称重一次，正常对照组和模型对照组灌胃给予等体积蒸馏水。给药后第14天每组动物眼眶取血检测血常规，取股骨骨髓，制备骨髓涂片。
1.2.2检测指标
1.2.2.1外周血检测：在给药第14天采用血球分析仪测定血常规，包括白细胞(wbc)、计数、血小板(plt)计数、红细胞(rbc)计数、血红蛋白(hgb)。
1.2.2.2骨髓检查：在给药第14天取左侧股骨用镊子将骨髓挤出，与少量小牛血清混匀，制备骨髓涂片，瑞氏染液染色，在高倍显微镜镜下观察有核细胞数来判断骨髓损伤情况。
1.3剂量设计
骨肽提取液的临床拟用量为21ml/日，根据体表面积法换算成小鼠等效剂量为21ml*0.0026/0.02kg＝2.73ml/kg。本实验以小鼠等效剂量作为低剂量，中、高剂量分别为等效剂量的2、4倍，即小鼠中、高剂量分别为5.46ml/kg、10.92ml/kg。阿胶补血颗粒临床用量为8g/日，根据体表面积法换算成小鼠等效剂量为8*0.0026/0.02＝1.04g/kg，详见表2。
表2试验分组和剂量设计
以上采用spss16.0进行统计分析，统计学意义的水平设定为p<0.05。计量资料采用均数±标准差(±s)。用leven’stest方法检验正态性和方差齐性。如果符合正态性和方差齐性，用单因素方差分析(one-wayanova)和posthoclsd进行统计分析；如果不符合正态性和方差不齐，则用kruskal-wallis检验。如果kruskal-wallis检验有统计学意义(p<0.05)，则用dunnett’stest(非参数方法)进行比较分析。评价时考虑统计学差异和生物学意义。
实验结果：
骨肽提取液对小鼠骨髓损伤模型体重的影响
如下表3所示，给药30天，与正常对照组比较，模型对照组小鼠体重明显降低(p<0.05)；与模型对照组比较，骨肽提取液低、中、高剂量组小鼠体重变化无显著性差异。
表3骨肽提取液对环磷酰胺致小鼠骨髓损伤模型体重的影响(预防给药)(
骨肽提取液对小鼠骨髓损伤血液学指标的影响
如下表4所示，与正常对照组比较，模型对照组小鼠外周血wbc、rbc、hgb、plt明显降低(p<0.05)。与模型对照组比较，骨肽提取液低剂量能明显升高hgb数量(p<0.05)，骨肽提取液中剂量能明显升高rbc、hgb数量(p<0.05)；骨肽提取液高剂量能明显升高wbc、rbc、hgb数量(p<0.05)；阿胶补血颗粒能明显能明显升高hgb数量(p<0.05)。
表4骨肽提取液对小鼠骨髓损伤模型血液学指标的影响(
骨肽提取液对小鼠骨髓损伤模型骨髓增生评分的影响
与正常对照组比较，模型对照组小鼠骨髓有核细胞数明显减少，骨肽提取液高剂量能够明显对抗环磷酰胺腹腔注射导致小鼠骨髓有核细胞数的减少。如下表5所示，与正常对照组比较，模型对照组小鼠骨髓增生评分明显降低(p<0.05)，骨肽提取液高剂量能够明显的对抗环磷酰胺腹腔注射导致小鼠骨髓抑制效果，
表5骨肽提取液对小鼠骨髓损伤骨髓增生评分的影响(
骨肽提取液对小鼠骨髓损伤的影响(治疗给药)
a、强骨生血颗粒对小鼠骨髓损伤模型体重的影响
如下表6所示，与正常对照组比较，模型对照组小鼠体重明显降低(p<0.01)；给药后14天，与模型对照组比较，骨肽提取液高剂量组小鼠体重明显升高(p<0.05)。
表6骨肽提取液对环磷酰胺致小鼠骨髓损伤模型体重的影响(治疗给药)(
b、骨肽提取液对小鼠骨髓损伤血液学指标的影响
如下表7所示，与正常对照组比较，模型对照组小鼠外周血白细胞wbc、rbc、plt明显降低(p<0.05)。与模型对照组比较，骨肽提取液高剂量外周血wbc、rbc、plt数量明显升高(p<0.05)。阿胶补血颗粒外周血rbc、plt数量明显升高(p<0.05)。
表7骨肽提取液对小鼠骨髓损伤血液学指标的影响(
c、骨肽提取液对小鼠骨髓损伤骨髓增生评分的影响
模型对照组小鼠骨髓有核细胞数明显减少，骨肽提取液高剂量能够明显的对抗环磷酰胺腹腔注射导致小鼠骨髓有核细胞数的减少。如下表8所示，与正常对照组比较，模型对照组小鼠骨髓增生评分明显降低(p<0.05)。与模型对照组比较，骨肽提取液高剂量能够明显的对抗环磷酰胺腹腔注射导致小鼠骨髓损伤，骨髓增生程度与模型组比较，具有统计学意义(p<0.05)。
表8骨肽提取液对小鼠骨髓损伤骨髓增生评分的影响(
从以上实施例可以可按出，骨肽提取液低剂量能明显升高骨髓损伤模型小鼠外周血hgb数量，骨液中、高剂量能明显升高rbc、hgb数量；骨肽提取液高剂量能明显升高wbc数量。骨肽提取液高剂量能明显改善模型小鼠骨髓增生评分；
骨肽提取液高剂量能明显升高给药后14天小鼠体重。骨肽提取液高剂量能明显升高外周血wbc、rbc、plt数量。骨肽提取液高剂量能明显增加模型小鼠骨髓增生评分。
骨肽提取液能预防和治疗环磷酰胺致小鼠骨髓损伤模型外周血和骨髓造血功能，对化疗药物引起的骨髓损伤具有明显的保护作用。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。