本发明属于高分子药物载体领域，具体涉及一种负载盐酸阿霉素的自愈合水凝胶给药体系及其制备方法。
背景技术：
盐酸阿霉素（doxorubicin，dox）是目前临床常用的蒽环类抗肿瘤药物，它通过细胞膜进入肿瘤细胞作用于dna，从而达到抗肿瘤的目的。盐酸阿霉素抗瘤谱广、疗效好，主要用于治疗急慢性白血病、恶性淋巴瘤和多种实体瘤等。然而该类药物毒性较大，长期应用可发生剂量依赖性的不可逆的心肌病变、骨髓抑制、脱发及消化道症状等，同时其多药耐药性的存在也使其在临床的应用受到一定限制。为了解决上述问题，临床上一直在寻找降低盐酸阿霉素毒副反应，提高其治疗疗效的有效方法，例如制备高分子载体给药系统，如脂质体、纳米粒和水凝胶等。其中，水凝胶因其优异的仿生性能、生物相容性、生物可降解性以及可作为多种活性物质的贮库等特性受到人们的重视。基于动态共价键形成的自愈合水凝胶是一类近年来发展起来的新型水凝胶，其独特的自愈合性在生物医疗、药物缓释等领域具有巨大的潜在用途。
普鲁兰多糖是一种水溶性中性大分子粘质真菌多糖，具有良好的生物相容性及抗氧化性，并能够被体内酶降解，是一种良好的天然高分子载体材料。普鲁兰多糖富含羟基，易被氧化剂氧化形成富含醛基的氧化普鲁兰多糖。选取富含氨基的聚合物与氧化普鲁兰多糖上的醛基发生席夫碱反应生成动态亚胺键，通过动态亚胺键使聚合物交联起来制备自愈合水凝胶是一种简单快捷的制备方法。
ε-聚赖氨酸是一种富含氨基的生物可降解高分子材料，由于ε-聚赖氨酸在降解过程中能释放出天然的小分子氨基酸，因此具有良好的生物相容性，在药物载体及药物控制释放等方面受到广泛关注。枝化聚乙烯亚胺是一种阳离子型水溶性聚胺，其分子链中含有大量的氨基n原子，被广泛应用于高分子载体的改性。利用氧化普鲁兰多糖、ε-聚赖氨酸和枝化聚乙烯亚胺制备动态亚胺键交联的自愈合水凝胶并负载盐酸阿霉素形成水凝胶给药体系，能够缓慢并长期释放盐酸阿霉素，降低盐酸阿霉素的毒副反应，提高其肿瘤治疗效果。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种负载盐酸阿霉素的自愈合水凝胶给药体系及其制备方法，其制备方法简单，易于操作，不需要昂贵的仪器，且制备的水凝胶给药体系可实现对盐酸阿霉素的可控释放，有利于降低药物的毒副作用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种负载盐酸阿霉素的自愈合水凝胶给药体系，其是由氧化普鲁兰多糖、ε-聚赖氨酸、枝化聚乙烯亚胺及盐酸阿霉素构成，其质量比为：1:0.025~0.225:0.0026~0.013:0.04；其中，盐酸阿霉素通过动态亚胺键交联和凝胶网孔吸附两种方式载入自愈合水凝胶网络中。
所述负载盐酸阿霉素的自愈合水凝胶给药体系是先将天然微生物多糖-普鲁兰多糖氧化成富含醛基的氧化普鲁兰多糖，再以富含醛基的氧化普鲁兰多糖与富含氨基的ε-聚赖氨酸、枝化聚乙烯亚胺和盐酸阿霉素为原料，通过席夫碱反应在水凝胶网络中形成动态亚胺键交联点，从而制得所述自愈合水凝胶给药体系；其具体包括以下步骤：
1）按质量体积比1:40g/ml将普鲁兰多糖溶于双蒸水中，然后加入高碘酸钾，室温、避光条件下搅拌反应1.5h；
2）在步骤1）所得溶液中加入丙三醇，反应15min，以终止氧化反应；
3）将步骤2）所得反应液置于截留分子量（mwco）为6000da的透析袋中，于4℃条件下透析3d，期间每隔6-8h换一次水；
4）将透析后的溶液真空冷冻干燥3d，得到纯净的氧化普鲁兰多糖；
5）37℃下，将氧化普鲁兰多糖溶于双蒸水中，然后加入盐酸阿霉素使之充分溶解；
6）在步骤5）所得溶液中加入ε-聚赖氨酸水溶液，充分混匀，再加入枝化聚乙烯亚胺水溶液，迅速混合均匀，室温下反应45~120s；
7）将制得的水凝胶放入双蒸水中冲洗3次，然后置于-20℃预冻，再转入真空冷冻干燥箱中冷冻干燥3d，得干燥的自愈合水凝胶给药体系。
所用普鲁兰多糖的分子量为250000da。
普鲁兰多糖的重复单元与所用高碘酸钾、丙三醇的物质的量之比为1:1:1。
步骤5）所得溶液中氧化普鲁兰多糖的浓度为0.05g/ml，盐酸阿霉素的浓度为2mg/ml。
步骤6）中所用ε-聚赖氨酸水溶液的浓度为0.5g/ml，其中，ε-聚赖氨酸的分子量为4000da；所用枝化聚乙烯亚胺水溶液的浓度为0.26g/ml，其中，枝化聚乙烯亚胺的分子量为600da。
本发明的显著优点在于：
（1）本发明所得自愈合水凝胶给药体系是由氧化普鲁兰多糖、ε-聚赖氨酸、枝化聚乙烯亚胺、盐酸阿霉素组成，其具有良好的生物相容性、生物可降解性、温度和ph敏感性，且制备周期短，制备过程中不需要任何有机溶剂，属于绿色制备。
（2）本发明给药体系中的盐酸阿霉素一部分通过分子上氨基与氧化普鲁兰上醛基发生席夫碱反应而载入水凝胶网络当中，一部分通过氢键吸附等作用载入，从而实现了盐酸阿霉素在水凝胶给药体系中的稳定负载，并使得药物能够有序和缓慢的释放。
（3）本发明给药体系还具有可注射性和自愈合性，可通过瘤周注射给药直接注射到病灶部位，无需手术植入，且在注射过程中破坏的水凝胶可通过自愈合恢复完整性。因此，该水凝胶给药体系可在肿瘤治疗过程中减少药物毒副作用，同时也减轻病人手术植入的痛苦，达到高效减毒的目的。
附图说明
图1为实施例5所得自愈合水凝胶给药体系横截面的扫描电镜图。
图2为实施例5所得自愈合水凝胶给药体系中盐酸阿霉素的体外累积释放曲线图。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
所用普鲁兰多糖的分子量为250000da，ε-聚赖氨酸的分子量为4000da，枝化聚乙烯亚胺的分子量为600da。
实施例1
1）取5.000g普鲁兰多糖溶于200ml双蒸水中，磁力搅拌充分溶解；
2）吸取5ml232mg/ml的氧化剂高碘酸钾溶液加入步骤1）所得溶液中，室温、避光条件下搅拌反应1.5h；
3）在步骤2）所得溶液中加入0.36ml丙三醇，反应15min，以终止氧化反应；
4）将步骤3）所得溶液置于mwco6000的透析袋中，于4℃下透析3天，期间每隔6-8h换一次水；
5）将透析后的溶液真空冷冻干燥3天，得到纯净的固体状的氧化普鲁兰多糖；
6）称取1.000g所制备得到氧化普鲁兰多糖，加入20ml双蒸水中，于37℃溶解；
7）在步骤6）所得溶液中加入40mg盐酸阿霉素，于37℃充分溶解；
8）在步骤7）所得溶液中加入250μl0.5g/ml的ε-聚赖氨酸水溶液，充分混匀；
9）在步骤8）所得溶液中加入20μl0.26g/ml的聚乙烯亚胺水溶液，迅速混合均匀，室温下反应120s；
10）将制得的水凝胶取出，用双蒸水冲洗3次，然后于-20℃预冻12h，再真空冷冻干燥3天，得干燥的水凝胶给药体系。
将所得水凝胶分两部分，分别用甲基橙、罗丹明b染色，然后分别置于5ml注射器中。推动注射器的活塞部分，使注射器中经不同染料染色的水凝胶从注射器针头部位推出，经过10min后观察，水凝胶已经成为一个整体，证实所得水凝胶具有可注射性及良好的自愈合性能。
实施例2
1）取5.000g普鲁兰多糖溶于200ml双蒸水中，磁力搅拌充分溶解；
2）吸取5ml232mg/ml的氧化剂高碘酸钾溶液加入步骤1）所得溶液中，室温、避光条件下搅拌反应1.5h；
3）在步骤2）所得溶液中加入0.36ml丙三醇，反应15min，以终止氧化反应；
4）将步骤3）所得溶液置于mwco6000的透析袋中，于4℃下透析3天，期间每隔6-8h换一次水；
5）将透析后的溶液真空冷冻干燥3天，得到纯净的固体状的氧化普鲁兰多糖；
6）称取1.000g所制备得到氧化普鲁兰多糖，加入20ml双蒸水中，于37℃溶解；
7）在步骤6）所得溶液中加入40mg盐酸阿霉素，于37℃充分溶解；
8）在步骤7）所得溶液中加入350μl0.5g/ml的ε-聚赖氨酸水溶液，充分混匀；
9）在步骤8）所得溶液中加入30μl0.26g/ml的聚乙烯亚胺水溶液，迅速混合均匀，室温下反应80s；
10）将制得的水凝胶取出，用双蒸水冲洗3次，然后于-20℃预冻12h，再真空冷冻干燥3天，得干燥的水凝胶给药体系。
将所得水凝胶分两部分，分别用甲基橙、罗丹明b染色，然后分别置于5ml注射器中。推动注射器的活塞部分，使注射器中经不同染料染色的水凝胶从注射器针头部位推出，经过15min后观察，水凝胶已经成为一个整体，证实所得水凝胶具有可注射性及良好的自愈合性能。
实施例3
1）取5.000g普鲁兰多糖溶于200ml双蒸水中，磁力搅拌充分溶解；
2）吸取5ml232mg/ml的氧化剂高碘酸钾溶液加入步骤1）所得溶液中，室温、避光条件下搅拌反应1.5h；
3）在步骤2）所得溶液中加入0.36ml丙三醇，反应15min，以终止氧化反应；
4）将步骤3）所得溶液置于mwco6000的透析袋中，于4℃下透析3天，期间每隔6-8h换一次水；
5）将透析后的溶液真空冷冻干燥3天，得到纯净的固体状的氧化普鲁兰多糖；
6）称取1.000g所制备得到氧化普鲁兰多糖，加入20ml双蒸水中，于37℃溶解；
7）在步骤6）所得溶液中加入40mg盐酸阿霉素，于37℃充分溶解；
8）在步骤7）所得溶液中加入50μl0.5g/ml的ε-聚赖氨酸水溶液，充分混匀；
9）在步骤8）所得溶液中加入10μl0.26g/ml的聚乙烯亚胺水溶液，迅速混合均匀，室温下反应85s；
10）将制得的水凝胶取出，用双蒸水冲洗3次，然后于-20℃预冻12h，再真空冷冻干燥3天，得干燥的水凝胶给药体系。
将所得水凝胶分两部分，分别用甲基橙、罗丹明b染色，然后分别置于5ml注射器中。推动注射器的活塞部分，使注射器中经不同染料染色的水凝胶从注射器针头部位推出，经过12min后观察，水凝胶已经成为一个整体，证实所得水凝胶具有可注射性及良好的自愈合性能。
实施例4
1）取5.000g普鲁兰多糖溶于200ml双蒸水中，磁力搅拌充分溶解；
2）吸取5ml232mg/ml的氧化剂高碘酸钾溶液加入步骤1）所得溶液中，室温、避光条件下搅拌反应1.5h；
3）在步骤2）所得溶液中加入0.36ml丙三醇，反应15min，以终止氧化反应；
4）将步骤3）所得溶液置于mwco6000的透析袋中，于4℃下透析3天，期间每隔6-8h换一次水；
5）将透析后的溶液真空冷冻干燥3天，得到纯净的固体状的氧化普鲁兰多糖；
6）称取1.000g所制备得到氧化普鲁兰多糖，加入20ml双蒸水中，于37℃溶解；
7）在步骤6）所得溶液中加入40mg盐酸阿霉素，于37℃充分溶解；
8）在步骤7）所得溶液中加入450μl0.5g/ml的ε-聚赖氨酸水溶液，充分混匀；
9）在步骤8）所得溶液中加入30μl0.26g/ml的聚乙烯亚胺水溶液，迅速混合均匀，室温下反应60s；
10）将制得的水凝胶取出，用双蒸水冲洗3次，然后于-20℃预冻12h，再真空冷冻干燥3天，得干燥的水凝胶给药体系。
将所得水凝胶分两部分，分别用甲基橙、罗丹明b染色，然后分别置于5ml注射器中。推动注射器的活塞部分，使注射器中经不同染料染色的水凝胶从注射器针头部位推出，经过15min后观察，水凝胶已经成为一个整体，证实所得水凝胶具有可注射性及良好的自愈合性能。
实施例5
1）取5.000g普鲁兰多糖溶于200ml双蒸水中，磁力搅拌充分溶解；
2）吸取5ml232mg/ml的氧化剂高碘酸钾溶液加入步骤1）所得溶液中，室温、避光条件下搅拌反应1.5h；
3）在步骤2）所得溶液中加入0.36ml丙三醇，反应15min，以终止氧化反应；
4）将步骤3）所得溶液置于mwco6000的透析袋中，于4℃下透析3天，期间每隔6-8h换一次水；
5）将透析后的溶液真空冷冻干燥3天，得到纯净的固体状的氧化普鲁兰多糖；
6）称取1.000g所制备得到氧化普鲁兰多糖，加入20ml双蒸水中，于37℃溶解；
7）在步骤6）所得溶液中加入40mg盐酸阿霉素，于37℃充分溶解；
8）在步骤7）所得溶液中加入450μl0.5g/ml的ε-聚赖氨酸水溶液，充分混匀；
9）在步骤8）所得溶液中加入40μl0.26g/ml的聚乙烯亚胺水溶液，迅速混合均匀，室温下反应45s；
10）将制得的水凝胶取出，用双蒸水冲洗3次，然后于-20℃预冻12h，再真空冷冻干燥3天，得干燥的水凝胶给药体系。
将所得水凝胶分两部分，分别用甲基橙、罗丹明b染色，然后分别置于5ml注射器中。推动注射器的活塞部分，使注射器中经不同染料染色的水凝胶从注射器针头部位推出，经过20min后观察，水凝胶已经成为一个整体，证实所得水凝胶具有可注射性及良好的自愈合性能。
实施例6
1）取5.000g普鲁兰多糖溶于200ml双蒸水中，磁力搅拌充分溶解；
2）吸取5ml232mg/ml的氧化剂高碘酸钾溶液加入步骤1）所得溶液中，室温、避光条件下搅拌反应1.5h；
3）在步骤2）所得溶液中加入0.36ml丙三醇，反应15min，以终止氧化反应；
4）将步骤3）所得溶液置于mwco6000的透析袋中，于4℃下透析3天，期间每隔6-8h换一次水；
5）将透析后的溶液真空冷冻干燥3天，得到纯净的固体状的氧化普鲁兰多糖；
6）称取1.000g所制备得到氧化普鲁兰多糖，加入20ml双蒸水中，于37℃溶解；
7）在步骤6）所得溶液中加入40mg盐酸阿霉素，于37℃充分溶解；
8）在步骤7）所得溶液中加入450μl0.5g/ml的ε-聚赖氨酸水溶液，充分混匀；
9）在步骤8）所得溶液中加入50μl0.26g/ml的聚乙烯亚胺水溶液，迅速混合均匀，室温下反应45s；
10）将制得的水凝胶取出，用双蒸水冲洗3次，然后于-20℃预冻12h，再真空冷冻干燥3天，得干燥的水凝胶给药体系。
将所得水凝胶分两部分，分别用甲基橙、罗丹明b染色，然后分别置于5ml注射器中。推动注射器的活塞部分，使注射器中经不同染料染色的水凝胶从注射器针头部位推出，经过20min后观察，水凝胶已经成为一个整体，证实所得水凝胶具有可注射性及良好的自愈合性能。
图1为实施例5所得自愈合水凝胶给药体系横截面的扫描电镜图。由图1可知，所得水凝胶给药体系的横截面呈现大网孔结构，且网孔均匀。其大网孔结构有利于药物的吸附和包埋，从而可增加载药量；而均匀的网孔结构有利于使水凝胶中药物的均匀释放。
图2为实施例5所得自愈合水凝胶给药体系中盐酸阿霉素的体外累积释放曲线图。由图2可见，所得水凝胶给药体系具有良好的缓释性能，其持续释放效果长达200h左右，这不仅可以提高药物的利用率，还可以降低药物的毒副作用，且其药物释放量接近90%，可以充分发挥药物的作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。