所属技术领域
本发明属于肿瘤细胞免疫治疗技术领域，本发明涉及双氧化酶duox2的新用途，具体涉及双氧化酶duox2修饰的dc细胞在靶向杀伤胰腺癌起始细胞中的应用。
背景技术：
胰腺癌是致死率最高的恶性肿瘤之一，全球每年的新发病例和死亡人数接近25万(shahm，dasilvar，gravekampc，libuttisk，abrahamt，dadachovae.targetedradionuclidetherapiesforpancreaticcancer.cancergenetherapy.2015；22(8)：375-9)。由于发展早期没有显著的症状，胰腺癌通常只能在晚期被诊断，临床研究报道胰腺癌对放化疗不敏感并易产生耐受(bardeesyn，depinhora.pancreaticcancerbiologyandgenetics.naturereviewscancer.2002；2(12)：897-909)。目前，胰腺癌的主要治疗方式是手术切除，通过完整的清除肿瘤组织，达到有效治疗目的。近年来，尽管胰腺癌的手术切除和药物治疗不断取得进步，但是胰腺癌患者的死亡率居高不下，在最优的辅助系统结合治疗下胰腺癌患者五年生存期仍然不超过20％(bednarf，simeonedm.pancreaticcancerstemcellbiologyanditstherapeuticimplications.journalofgastroenterology.2011；46(12)：1345-52)。因此，新型胰腺癌治疗手段的研发迫在眉睫。
肿瘤起始细胞是具备普通起始细胞分化特性的肿瘤细胞，并能通过自我更新和分化潜能形成肿瘤。肿瘤起始细胞是肿瘤组织独特的细胞群，与肿瘤的复发与转移密切相关。肿瘤起始细胞对常规的放化疗不敏感，易产生耐受，因此传统的放化疗不能有效杀伤肿瘤起始细胞，继而使肿瘤起始细胞获得增殖优势，最终引起肿瘤的复发和转移(fesslere，dijkgraaffe，desousaemf，medemajp.cancerstemcelldynamicsintumorprogressionandmetastasis：isthemicroenvironmenttoblame？cancerletters.2013；341(1)：97-104)。研究表明特异性靶向肿瘤起始细胞的细胞免疫治疗能有效控制肿瘤的复发与转移，显著提升肿瘤患者的生存质量与生命周期(iovinof，meraviglias，spinam，orlandov，saladinov，dielif，etal.immunotherapytargetingcoloncancerstemcells.immunotherapy.2011；3(1)：97-106；kwiatkowska-borowczykep，gabka-buszeka，jankowskij，mackiewicza.immunotargetingofcancerstemcells.contemporaryoncology.2015；19(1a)：a52-9)。晚期胰腺癌极易复发转移，传统的抗肿瘤治疗并未显著降低胰腺癌患者的死亡率(bednarf，simeonedm.pancreaticcancerstemcellbiologyanditstherapeuticimplications.journalofgastroenterology.2011；46(12)：1345-52)，因此研发一种新型靶向杀伤胰腺癌起始细胞的免疫治疗方法，对治疗胰腺癌具有重要的研究意义。
目前，细胞免疫治疗逐渐成为继手术切除、放疗和化疗外的第四种肿瘤治疗方法，以dc细胞为基础的肿瘤疫苗是细胞免疫治疗领域中的研究热点。dc细胞是体内递呈抗原能力最强的抗原递呈细胞(apc)，具有连接机体天然免疫与适应性免疫的作用。dc细胞通过识别、处理和递呈抗原给t淋巴细胞，从而启动抗原特异性cd4+和cd8+t细胞反应。此外，耐受原的dc细胞诱导t细胞失能，促进调节性t细胞(treg)的产生，从而导致免疫耐受(gehriee，vandertouww，brombergjs，ochandojc.plasmacytoiddendriticcellsintolerance.methodsinmolecularbiology.2011；677：127-47)。近年来，研究发现肿瘤细胞可以通过诱导激活耐受原dc细胞，介导treg的产生来实现免疫逃逸(pinzon-charrya，maxwellt，lopezja.dendriticcelldysfunctionincancer：amechanismforimmunosuppression.immunologyandcellbiology.2005；83(5)：451-61；gajewskitf，schreiberh，fuyx.innateandadaptiveimmunecellsinthetumormicroenvironment.natureimmunology.2013；14(10)：1014-22)。jun-o等发现乳腺癌细胞通过抑制转运蛋白abcg2的表达诱导产生耐受原的dc细胞，继而产生免疫耐受(jinjo，zhangw，wongkw，kwakm，vandrielir，yuq.inhibitionofbreastcancerresistanceprotein(abcg2)inhumanmyeloiddendriticcellsinducespotenttolerogenicfunctionsduringlpsstimulation.plosone.2014；9(8)：e104753)。研究表明，负载肿瘤相关抗原的dc疫苗能有效规避免疫系统的耐受性，引发强烈的抗肿瘤免疫反应。
双氧化酶duox2首先发现于哺乳动物的甲状腺，duox2有两个亚型：hduox1和hduox2，其中hduox1主要分布于呼吸道上皮细胞，hduox2主要表达于唾液腺和胃肠道。目前，duox2被认为参与调控真核生物非吞噬细胞过程中活性氧(ros)的生成，遗传分析表明duox2调控的ros在高血压、肿瘤和囊胞性纤维症等疾病过程中起到非常的重要的作用(radab，lekstromk，damians，dupuyc，letotl.thepseudomonastoxinpyocyanininhibitsthedualoxidase-basedantimicrobialsystemasitimposesoxidativestressonairwayepithelialcells.journalofimmunology.2008；181(7)：4883-93；nguyendm，parekhpr，changet，sharmank，carrierf.contributionofdualoxidase2(duox2)tohyper-radiosensitivityinhumangastriccancercells.radiationresearch.2015；184(2)：151-60)。duox2在肿瘤生物学方面的研究主要集中在duox2表达紊乱诱导ros的产生、堆积对炎症相关肿瘤的生成，肿瘤复发转移和肿瘤耐药方面的作用和影响(wuy，antonys，hewittsm，jiangg，yangsx，meitzlerjl，etal.functionalactivityandtumor-specificexpressionofdualoxidase2inpancreaticcancercellsandhumanmalignanciescharacterizedwithanovelmonoclonalantibody.internationaljournalofoncology.2013；42(4)：1229-38)。此外，有报道指出duox2过表达协同天然免疫促进肿瘤的生成(wuy，luj，antonys，juhasza，liuh，jiangg，etal.activationoftlr4isrequiredforthe synergisticinductionofdualoxidase2anddualoxidasea2byifn-gammaandlipopolysaccharideinhumanpancreaticcancercelllines.journalofimmunology.2013；190(4)：1859-72)。目前尚无duox2在胰腺癌起始细胞的研究报道。
技术实现要素：
本发明的主要目的在于提供一种新型胰腺癌细胞免疫治疗的设计方法，首次提出duox2作为胰腺癌起始细胞相关抗原，本发明还提供了duox2修饰的dc疫苗的制备方法。该方法用duox2修饰树突状细胞，靶向杀伤胰腺癌起始细胞，抑制胰腺癌的复发与转移，解决了传统手术切除以及放化疗无法有效杀死胰腺癌起始细胞，而没能达到理想的治疗效果，以及仅含有胰腺癌相关抗原的dc疫苗，未能产生长期的治疗效果等科学技术问题。
本发明的目的是按以下技术方案来实现的：
本发明采用基因芯片技术，对cd44+cd24+esa+胰腺癌起始细胞与cd44-cd24-esa-非胰腺癌起始细胞以及胰腺癌和正常胰腺进行差异基因表达分析，筛选出cd44+cd24+esa+的胰腺癌起始细胞以及胰腺癌高表达的基因duox2，然后通过实验验证duox2作为抗原可诱导靶向杀伤肝癌起始细胞的能力。采用电穿孔的方法将duox2质粒导入dc细胞，在体外实验中激活抗原特异性t细胞，靶向杀伤胰腺癌起始细胞，在动物实验体内能引发较强的抗原特异性t细胞免疫反应，抑制胰腺癌的成瘤能力。这些研究结果为靶向杀伤胰腺癌起始细胞的新型免疫治疗方法提供了依据，同时为靶向杀伤胰腺癌起始细胞的免疫治疗在临床上的应用奠定了基础。
附图说明
图1实时荧光定量聚合酶链反应结果表明duox2在cd44+cd24+esa+胰腺癌起始细胞和胰腺癌组织中高表达；
图2是本发明基因修饰的dc和未经修饰的dc免疫表型流式细胞鉴定的结果；
图3是本发明基因修饰的dc和未经修饰的dc疫苗免疫原性的ics结果；
图4是duox2抗原特异性ctl细胞对靶细胞panc1的体外杀伤结果；
图5是panc1细胞与基因修饰dc刺激的ctl和未修饰dc刺激的ctl分别接种裸鼠，检测5周内的肿瘤生长体积和肿瘤细胞cd44+cd24+esa+的胰腺癌起始细胞的比例。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。
实施例1：胰腺癌起始细胞和胰腺癌相关抗原的基因筛选与鉴定
采用基因芯片筛选在cd44+cd24+esa+胰腺癌起始细胞与cd44-cd24-esa-非胰腺癌起始细胞以及胰腺癌和正常胰腺组织中差异表达的基因谱。首先用流式细胞仪分选出胰腺癌起始细胞和非胰腺癌起始细胞，分别提取胰腺癌起始细胞和非胰腺癌起始细胞以及胰腺癌和正常胰腺组织的总rna，通过affymetrixhumangene1.0st人类基因表达谱芯片扫描分析，初步筛选出cd44+cd24+esa+胰腺癌起始细胞和胰腺癌中高表达的基因duox2，实时荧光定量聚合酶链反应验证了所筛选出的duox2基因在胰腺癌起始细胞和胰腺癌中高表达。
实施例2：duox2修饰的dc疫苗制备
1、外周血单核细胞分离：
取出血液，缓慢加到ficoll分离液上层，1000g离心30min，吸取分界处白色pbmc，1640培养基重悬；350g离心8min，去除上清，重复三遍，加10ml培养基重悬后计数。根据计数结果，培养dc。
2、dc的培养与转染
调整细胞浓度为3×106/ml，取6ml加到t25培养瓶中，在37℃、5％co2孵箱中培养2h后取出，弃去悬浮的细胞，轻轻冲洗，加入6ml含gm-csf(50ng/ml)、il-4(50ng/ml)、双抗(100u/ml)和10％fbs的rpmi-1640培养基，5天后加3ml含il-1β(10ng/ml)，il-6(100ng/ml)、tnf-α(10ng/ml)、pge2(1μg/ml)、cd40lwithenhancer(1μg/ml)、ifn-α(3000μ/ml)、il-4(800u/ml)、gm-csf(50ng/ml)、il-4(50ng/ml)培养基继续培养24h。350g、8min离心，去除上清，通过amaxadc电转染仪将duox2质粒或对照质粒转染至成熟的dc细胞中，用10％的人血白蛋白的dc培养液培养，24h内使用。
实施例3：duox2修饰的dc疫苗诱导特异性t细胞反应
1、抗原特异性的t细胞制备与免疫原性检测
将负载duox2抗原的成熟dc细胞及t细胞按1∶10的比例混匀，加到含终浓度为5ng/mlil-7，20iu/mlil-2的淋巴细胞培养液培养，每天换液，第7天得到负载duox2抗原的dc细胞刺激的t细胞。
2、成熟dc细胞的免疫表型检测
取成熟的dc细胞，用pbs洗2次后，各取1×105/ml，分别加入相应的流式管中。加入待检测单克隆抗体包括hla-dr、cd80、cd83和cd86抗体各1μl，4℃避光孵育30分钟。用pbs洗2次，用400μl的pbs重悬，采用流式细胞仪cytoflex(beckman)检测。
3、成熟dc疫苗免疫原性检测
分别用dmso、duox2抗原肽(1ug/ml)和pma(40ng/ml)+ionomycin(1000ng/ml) percp抗体孵育30min后，用cytofix/cytoperm破膜液孵育30分钟，加入ifn-r--pe、il-2--apc-cy7、tnf-a--pe-cy7抗体孵育60分钟，上机检测。
实施例4：duox2抗原特异性细胞毒t淋巴细胞(ctl细胞)对胰腺癌起始细胞特异性的杀伤
1、体外杀伤实验
用流式细胞仪检测制备好的duox2抗原特异性ctl细胞的杀伤能力。将1×105panc1细胞(靶细胞)经pbs洗涤后用200nmcfse染色，种于96孔板中，然后，ctl细胞(效应细胞)按照1∶1、2∶1、5∶1、10∶1的效靶比加于孔内。另设一孔不加效应细胞的靶细胞孔，用于检测靶细胞的自发凋亡。效靶细胞共同孵育5h洗涤后，加入10μg/ml的pi孵育20min，最后在流式细胞仪cytoflex(beckman)中检测杀伤效果及cd44+cd24+esa+细胞的比例。
结果表明负载duox2抗原的dc细胞诱导的ctl细胞对d44+cd24+esa+胰腺癌起始细胞的杀伤能力最强。参见图所示，panc1细胞与负载duox2抗原的dc细胞诱导的ctl细胞混合培养5h后，panc1细胞中d44+cd24+esa+细胞比例与对照组相比降低，说明负载duox2抗原的dc细胞诱导的ctl细胞能特异性的杀伤胰腺癌起始细胞。
2、体内杀伤实验
2×106panc1细胞与2×107基因修饰dc刺激的ctl细胞混合后，种植于裸鼠皮下，对照组注射panc1和未修饰dc刺激的ctl混合细胞。每周测量肿瘤体积大小，35天后处死所有裸鼠，取出胰腺癌组织，制备成单细胞悬液，流式细胞仪cytoflex(beckman)检测肿瘤内cd44+cd24+esa+细胞的比例。
结果发现负载duox2抗原的dc细胞诱导的ctl细胞混合注射组中，其肿瘤细胞中cd44+cd24+esa+细胞比例明显降低，肿瘤体积显著降低。这些结果表明负载duox2抗原的dc细胞诱导的ctl细胞能特异性杀伤胰腺癌起始细胞，从而有效抑制了胰腺癌细胞的生长，同时也说明肿瘤起始细胞在肿瘤生长过程中发挥重要的作用。