本发明涉及甘露聚糖结合凝集素的新用途技术领域，具体涉及mbl在制备预防或治疗th17细胞引发疾病药物中的应用。
背景技术：
甘露聚糖结合凝集素（mannan-bindinglectin，mbl）是一种急性时相反应蛋白，主要由肝细胞分泌，为c型凝集素超家族中胶凝素（collectins）家族成员，属于ca+依赖型的凝集素。人类mbl基因位于10q11-q21染色体上，mbl肽链由229个氨基酸残基组成，成熟的mbl有四个结构域，自n端至c端依次为富含半胱氨酸的n端区、胶原样区、颈区以及能够进行糖类识别的c区。mbl是天然免疫系统中一个关键的可溶性模式识别受体（patternrecognitionreceptor，prr），可以选择性识别多种病原体（如细菌、真菌、病毒、寄生虫）表面的糖结构，通过激活补体凝集素途径，发挥溶破和间接调理作用；或通过与吞噬细胞表面胶凝受体结合，发挥直接调理作用，从而保护机体免受病原体的侵害。研究表明，正常人血清中mbl浓度约为0.01-10mg/l，mbl作为一种急性期反应蛋白，在应急状态下，其浓度可升高3倍以上。mbl被称为“天然免疫系统中的关键分子”，其在机体免疫系统中发挥着重要作用。
研究已证实mbl缺陷是人类最常见的免疫缺陷状态，主要由mbl-2启动子基因和结构基因第一外显子的多态性所致。mbl缺陷使血清中mbl浓度水平明显降低，机体处于免疫缺陷状态，极易感染，情况严重者会危及生命。研究表明，mbl缺陷与多种感染性疾病密切相关，特别是在机体合并其它免疫功能低下时（如在hiv感染的患者中、肿瘤患者进行药物化疗后、儿童时期），其表现得更加明显；mbl缺陷与多种自身免疫病密切相关，如mbl缺陷与系统性红斑性狼疮（sle）密切相关；mbl缺陷可能利于自身免疫复合物的沉积，激活补体经典途径，导致关节损伤，从而引发类风湿关节炎（ra）；mbl与心血管疾病如动脉粥样硬化也密切相关；mbl与糖尿病的发生发展也是密切相关的。
随着对mbl的深入研究，发现其不仅作为天然免疫系统中的关键分子，在补体的第三种途径（即甘露聚糖结合凝集素途径）中发挥着重要作用，而且在适应性免疫系统中也发挥着极其重要的作用。体外研究发现，用mbl预处理hiv-1可100%抑制hiv感染cd4+的h9淋巴细胞；高浓度的mbl（10-50mg/l）能够显著抑制b淋巴系raji细胞的生长；mbl可以抑制白假丝酵母菌（c.albicans）诱导的htp1/cd14细胞产生tnf-α和il-8。因此，深入研究mbl在适应性免疫系统中的作用，具有重要的科学意义和潜在的医学实践意义。
在适应性免疫应答反应中t淋巴细胞是主要的参与者，最初研究发现cd4+t细胞分为经典的th1细胞、th2细胞和调节性t细胞（regulatorytcell，treg）三个亚群。th1细胞主要通过分泌ifn-γ、il-12等细胞因子控制细胞内病原体（细菌和病毒）的感染，th1细胞与各种自身免疫病有关；th2细胞主要分泌il-4、il-5和il-13等细胞因子控制寄生虫和其它细胞外微生物的感染，部分介导过敏反应；treg细胞主要在维持机体免疫平衡中起重要作用。随着研究的不断深入，人们发现以上几种t细胞并不能完全解释一些自身免疫性疾病，感染和过敏反应等一些疾病的发病机制。近年来研究发现一种不同于th1细胞、th2细胞和treg细胞独立的cd4+t细胞，越来越受到人们的关注，因其主要分泌il-17细胞因子，被称为th17细胞（thelper17cells）。th17细胞在维持机体平衡中起着举足轻重的作用。研究发现在一些鼠自身免疫性疾病的模型中和一些自身免疫病患者中，均发现th17细胞数量增高，如实验性自身免疫性脑脊髓炎（eae）、胶原诱导的关节炎（cia）、系统性红斑性狼疮（sle）、类风湿关节炎（ra）、多发性硬化症（ms）、哮喘等。这些研究成果表明，对th17细胞进行干预，可能是治疗多种自身免疫性疾病和一些炎症性疾病的靶目标。
近年来研究发现，th17细胞作为一种促炎性的cd4+t细胞亚群，在慢性炎症、自身免疫性疾病、肿瘤以及感染性疾病中均发挥重要作用。研究表明，核孤儿受体γt（theorphannuclearreceptorrorγt）是th17细胞分化的关键转录因子，促进人类th17细胞分化的特异性转录因子是rorc，而转化生长因子tgf-β1（transforminggrowthfactor-β1）、il-6、il-21和il-23对th17细胞诱导分化中至关重要。因此，寻找新的抑制th17细胞分化因素，对于治疗多种自身免疫性疾病具有重要的科学意义和临床医学实践意义。如果想减少th17细胞的数量，除了阻断其特异性核转录因子rorγt的表达以及减少诱导其分化的几种细胞因子，是否还有其它未知的能够抑制th17细胞的分化的因素亟待进一步深入研究。
近年来本课题组一直从事mbl免疫调节相关研究，研究发现，低浓度mbl（生理浓度，1mg/l）对树突状细胞（dc）分化成熟起促进作用，增强免疫应答；高浓度mbl（超生理浓度，10mg/l）明显抑制b淋巴系raji细胞的生长；高浓度mbl（超生理浓度，10mg/l）可以抑制白假丝酵母菌（c.albicans）诱导的htp1/cd14细胞产生tnf-α和il-8。这些研究结果均表明，mbl在免疫调节中起着不同的作用。
技术实现要素：
本发明的目的是提出了mbl在制备预防或治疗th17细胞引发疾病药物中的应用，主要探讨了mbl对cd4+t细胞向th17细胞诱导分化的影响，结果表明mbl可以直接抑制cd4+t细胞向th17细胞诱导分化，这不仅是在理论上有显著性突破（在此之前从未有关mbl诱导th17细胞的文献报道），而且具有潜在的临床医学意义，为治疗th17细胞引起的自身免疫性疾病、过敏性疾病和感染性疾病提供了一种新的治疗途径。
本发明为实现上述目的采用如下技术方案，mbl在制备预防或治疗th17细胞引发疾病药物中的应用，th17细胞引发疾病包括自身免疫性疾病、过敏性疾病和感染性疾病，其中自身免疫性疾病包括系统性红斑性狼疮、类风湿关节炎、多发性硬化症、graves病和糖尿病肾病，过敏性疾病包括支气管哮喘、过敏性紫癜和过敏性鼻炎，感染性疾病包括慢性乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染、hiv感染和hbv宫内感染。
进一步优选，所述mbl通过抑制cd4+t细胞向th17细胞诱导分化实现药物的功效。
进一步优选，所述mbl为联合应用配体和单克隆抗体亲和层析纯化人血浆天然mbl蛋白。
进一步优选，所述mbl的浓度高于其在体内的生理浓度。
进一步优选，所述mbl的浓度为10ng/ml。
本发明具有以下优点：
1、本发明采用的血标本来源是脐带血，相比于外周血而言，脐带血更容易获得，而且采集的量相对来说较多，脐带血中还有大量造血干细胞，更容易诱导分化；
2、本发明通过探索得到了调节th17细胞诱导分化的新因素，即mbl直接抑制cd4+t细胞向th17细胞诱导分化；
3、本发明中流式细胞术检测的是th17细胞特异性的转录因子rorγt抗体，相对于检测il-17a抗体（il-17a主要是th17细胞分泌的）更具有特异性；
4、本发明突显出mbl的一种新功能，不仅在天然免疫中发挥重要作用，而且能够抑制促炎性th17细胞的诱导分化，是治疗多种自身免疫性疾病和炎症性疾病的新靶点。
附图说明
图1是免疫磁珠分选cd4+t细胞的纯度图；
图2是流式细胞术检测mbl对cd4+t细胞向th17细胞诱导分化图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
实施例
实验材料
1、实验所用细胞来源
新生儿脐带血采自新乡医学院第三附属医院和新乡市第一人民医院妇产科足月健康新生儿，胎儿娩出后立即从胎盘脐静脉穿刺采血放入含有28ml保存液的采血袋中。所有血样标本均在采样后4h内送达实验室。
2、主要试剂
培养基rpmi1640、胎牛血清（fetalbovineserum，fbs）10×pbs溶液、均购自thermofisherscientific公司。
淋巴细胞分离液（ficoll-paqueplus），是ficolltmpm400和密度1.077g/ml的泛影酸钠的无菌内毒素（＜0.12eu/ml）测试溶液，购自gehealthcarelifesciences公司。
抗人cd3单克隆抗体（cd3mab）、抗人cd28单克隆抗体（cd28mab）、pe-cyanine7标记的cd3mab、fitc标记的cd4mab、pe标记的rorγtmab以及cellstimulationcocktail（plusproteintransportinhibitors）均购自ebioscience公司；bv605标记的cd8mab购自biolegend公司。
人cd4+磁珠分选试剂盒、ms分选柱、macs分选架均购自miltenyibiotec公司。
重组人mbl购自acrobiosystems公司；人il-6和转化生长因子-β1（tgf-β1）购自miltenyibiotec公司。
3、主要仪器和设备
超净工作台，sw-cj-2fd型，苏州净化设备有限公司。
水浴箱，ssw-420-2s型，上海博讯公司。
co2培养箱，thermo，thermo公司。
低速台式离心机，tdl-5型，上海安享科学仪器厂。
流式细胞仪，facscalibur型，美国bd公司。
倒置显微镜，ts100-f型，日本nikon公司。
低温离心机，eppendorf5810r型，德国eppendorf公司。
纯水仪，nw型，healforece公司。
4、常用试剂配制
（1）1×pbs溶液
1体积份10×pbs溶液+9体积份蒸馏水
（2）1×permbuffer溶液
1体积份10×permbuffer+9体积份deionizedwater
例如：需要10ml的1×permbuffer溶液，则量取1ml的10×permbuffer，9ml的deionizedwater，混匀即可。
实验方法
1、人脐带血单个核细胞（cbmc）的提取
依照淋巴细胞分离液（ficoll）说明书，通过密度梯度离心法分离人脐带血单个核细胞，具体操作步骤如下：取15ml的玻璃管数支，每支加4ml的ficoll，玻璃管倾斜45℃，沿管壁缓慢加入1:1稀释的新鲜脐带血液8ml于淋巴细胞分离液液面上，并且保持两界面清晰。水平离心机1500r/min室温离心30min。离心结束后液面分三层，上层为血浆层，中间为人淋巴分离液层，下层主要为红细胞和粒细胞层。在上层和中间层之间乳白色云雾状层即为单个核细胞层（cbmc）。用一次性吸管小心吸取云雾状层，移入到一支新的15ml离心管中，并加入三倍体积的1×pbs洗涤细胞。1500r/min离心10min，弃去上清，并重复两次。用rpmimedium1640培养基（10wt%fbs）重悬细胞沉淀，并进行活细胞计数，以待用。
2、人脐带血cd4+t细胞磁性分选
样品准备
用buffer重悬已提取的cbmc细胞，为去除血小板，用buffer重悬细胞并200×g离心10-15min，小心吸取上清，重复洗涤两次。
磁性标记cd4+t细胞
整个过程要快速完成，并保持细胞处于预冷状态，防止成帽现象出现。
推荐孵育的温度为2-8℃。
ms柱磁性标记≤107细胞。
采用带有30μm的血液尼龙过滤网的过滤器处理细胞悬液，过滤器使用前用buffer湿润一下。
（1）细胞计数；
（2）细胞悬液300×g离心10min，完全弃上清；
（3）每107细胞加入80μlmacsbuffer重悬细胞；
（4）每107细胞加入20μlcd4microbeads；
（5）混匀并在冰箱（2-8℃）孵育15min；
（6）（可选步骤）加入染色抗体。比如，加入10μlcd4-fitc，在冰箱（2-8℃）避光孵育5min；
（7）每107细胞加入1-2mlmacsbuffer重悬细胞，300×g离心10min，完全弃上清；
（8）每108细胞加入500μlbuffer重悬细胞，细胞数目应小于108，大于108应相应增加buffer的体积；
（9）进入下一步磁性分选。
cd4+t细胞的磁性正分选
依据总细胞数目选择适合的分选柱。
总是要等到分离柱中的液体流尽时，再执行下一步。
用ms分离柱分选
（1）将ms分离柱置于macs分选器中；
（2）加入500μlbuffer润洗分离柱；
（3）将500μl细胞悬液置于ms分离柱中，收集流出的液体（即未标记的cd4-t细胞）；
（4）加入500μlbuffer冲洗ms分离柱3次，收集流出的液体（即未标记的cd4-t细胞）；
（5）将ms分离柱移出macs分选器，放置合适的收集管上；
（6）加入1mlbuffer置于ms分离柱中，立即推动活塞将标记的cd4+t细胞置于收集管中，重复两次；
（7）为增加cd4+t细胞的纯度，上一步收集的cd4+t细胞可以通过第二个ms分离柱，重复1-6的分选步骤；
（8）收集的cd4+t细胞悬液，1500rpm离心10min，完全弃去上清，用10wt%fbsrpmimedium1640培养基重悬细胞沉淀，并进行活细胞计数，以待用。
3、包被anti-cd3mab
将1mg/ml的anti-cd3mab用无菌的1×pbs稀释至2μg/ml，加入96孔板，50μl/孔，4℃过夜。
4、不同浓度mbl对th17细胞的诱导分化
以每孔1×106个/ml的密度，将分选的cd4+t细胞加入预先包被的2μg/mlanti-cd3mab的96孔细胞培养板中，每孔200μl，各孔均加入anti-cd28mab（1μg/ml）、il-6（25ng/ml）tgf-β1（0.5ng/ml），实验组分别加入不同浓度（1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml）的mbl，对照组不加mbl，每组均设3个复孔。将细胞置于37℃，体积分数为5%的co2培养箱中培养。在细胞培养的第3天，加入cellstimulationcocktail（plusproteintransportinhibitors500×）刺激20h，然后收集细胞用于相关实验。
5、流式细胞术检测th17细胞在不同条件下转录因子rorγt的表达
（1）收集各组培养后的细胞悬液于1.5mlep管，每管1×106个细胞；
（2）4℃离心机500×g，离心5min，完全弃上清；
（3）加入400μl1×pbs重悬细胞沉淀，4℃离心机500×g，离心5min，弃上清，重复一次；
（4）加入200μl1×pbs重悬细胞，分别加入1μlpecyanine7-cd3、2μlfitc-cd4、1μlbv605-cd8，4℃，避光孵育30min；
（5）孵育完成后，直接加入200μl1×pbs，4℃，500×g，离心5min，弃上清，重复一次；
（6）加入200μl1×fixation/permeabilization溶液重悬细胞，4℃，避光孵育30min；
（7）孵育完成后，直接加入200μl1×perm/washbuffer，4℃，500×g，离心5min，弃上清，重复一次；
（8）分别加入100μl1×perm/washbuffer和1μlpe-rorγt，4℃，避光孵育30min；
（9）孵育完成后，直接加入200μl1×perm/washbuffer，4℃，500×g，离心5min，弃上清，重复一次；
（10）分别加入400μl1×pbs重悬细胞，待上机检测，倘若不能及时上机检测可加入500μl4wt%多聚甲醛重悬细胞，于24-48h内上机。
实验结果
从图1可以看出，通过免疫磁珠分选可以得到高纯度的cd4+t细胞；从图2可以看出，mbl抑制cd4+rorγt+th17细胞的比例，由此可见，高浓度（10ng/ml，高于生理浓度）的mbl能够抑制cd4+t细胞向th17细胞诱导分化，进而能够作为治疗多种自身免疫性疾病和炎症性疾病的新靶点。
以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。