川陈皮素在预防或治疗心衰药物中的应用的制作方法

本发明涉及川陈皮素的新用途，尤其涉及川陈皮素在预防或治疗心衰药物中的应用。

背景技术：

慢性心衰(chronicheartfailure)是指心脏功能异常导致心脏泵血量不能满足代谢需要的一种病理生理状态，病因有心脏负荷过重、心肌舒张受限致、感染病毒和贫血等。慢性心衰伴随着心肌重构的发生，心肌重构是导致心衰的基本基制。

川陈皮素来源于芸香科川橘，主要由醇提、萃取、层析、结晶等工序获得。川陈皮素具有的药效作用有：抗细胞凝集、抗血栓形成、抗癌、抗真菌、抗炎、抗过敏、抗胆碱脂酶和抗癫痫，同时川陈皮素还是碳水化合物代谢的促进剂。

现有的慢性心衰治疗药物多种多样，有利尿剂、血管紧张素转换酶抑制剂和地高辛等；但未见报道，川陈皮素具有治疗慢性心衰的作用。

技术实现要素：

本发明目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种川陈皮素在预防或治疗心衰药物中的应用。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：川陈皮素在预防或治疗心衰药物中的应用。

作为上述技术方案的改进，所述川陈皮素预防或逆转慢性心衰缺血后的心肌重构。

作为上述技术方案进一步地改进，所述心衰为慢性心衰。

优选地，所述心肌重构包括心室收缩末期内径的增大，心室射血分数和心室短轴缩短率的降低，心肌梗死面积的增大以及心肌细胞存活率的降低。

另外，本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包括川陈皮素和药学上可接受的载体。

作为上述技术方案的改进，所述药物的剂型是注射液或冻干制剂。

在上述技术方案中，本发明的药物组合物可以为多种形式。这些形式包括例如液体、半固体和固体剂型，如液体溶液剂(例如可注射和可输注溶液剂)、分散剂或混悬剂、片剂、丸剂、散剂、脂质体和栓剂。优选的形式取决于预定的给药方式和治疗应用。典型的优选组合物为可注射或可输注溶液剂形式。优选的给药方式是胃肠外(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)给药。在一个优选的实施方案中，药物组合物通过腹膜注射给予。还可将辅助性活性化合物掺入到组合物中。

在上述技术方案中，“药学上可接受的载体”包括任何和所有生理上相容的溶剂、分散介质、包衣料、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂等。药学上可接受的载体的实例包括水、盐水、磷酸缓冲盐水、右旋糖酐、甘油、乙醇等中的一个或多个以及它们的组合。在很多情况下，优选的是将等渗剂例如糖、多元醇或氯化钠包括在组合物中。药学上可接受的载体还可包含少量的能提高抗体或抗体部分的货架期或有效性的辅助物质，如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液。

另外，本发明还提供所述药物组合物在预防或治疗心衰的应用。

作为上述技术方案的改进，所述药物组合物预防或逆转慢性心衰缺血后的心肌重构。

作为上述技术方案进一步地改进，所述心衰为慢性心衰。

本发明的有益效果在于：本发明提供川陈皮素在预防或治疗心衰药物中的应用，本发明通过构建心肌缺血模型和心肌细胞氧葡萄糖剥夺实验来证实川陈皮素逆转缺血后的心肌重构：逆转心室收缩末期内径的增大，逆转心室射血分数和心室短轴缩短率的降低，降低心肌梗死的面积以及激活心肌细胞存活，川陈皮素具有治疗慢性心衰的作用；川陈皮素可以作为治疗慢性心衰的药物。

附图说明

图1显示本发明实施例1中大鼠结扎前的冠状动脉左前降支；

图2显示本发明实施例1中大鼠冠状动脉左前降支结扎后心电图ⅱ导联出现st段抬高；

图3为显示本发明实施例1中大鼠冠状动脉左前降支结扎后远端心肌组织变灰白；

图4为本发明实施例1中的超声心动图；

图5为本发明实施例1中左室射血分数、左室短轴缩短率的柱状图；图5a为左室射血分数的柱状图，图5b为左室短轴缩短率的柱状图；其中，ns表示p>0.05，*表示p<0.05，***表示p<0.001；

图6为本发明实施例1中左室收缩末期内径、左室舒张末期内径的柱状图；图6a为左室收缩末期内径的柱状图，图6b为左室舒张末期内径的柱状图；其中，ns表示p>0.05，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001；

图7为本发明实施例2中大鼠心肌的ttc染色图；

图8为本发明实施例2中大鼠心肌梗死面积百分数的柱状图；其中，**表示p<0.01，***表示p<0.001；

图9为本发明实施例3中心肌细胞氧葡萄糖剥夺实验的散点图；其中，横坐标为annexinv标记的绿荧光,纵坐标为pi标记的红荧光，propidiumiodide为碘化丙锭；nob-5um表示该实验组中川陈皮素加入的浓度为5um，nob-10um表示该实验组中川陈皮素加入的浓度为10um，nob-20um表示该实验组中川陈皮素加入的浓度为20um，nob-40um表示该实验组中川陈皮素加入的浓度为40um，nob-80um表示该实验组中川陈皮素加入的浓度为80um，以下类同；

图10为本发明实施例3中心肌细胞氧葡萄糖剥夺实验的统计图；其中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例、附表和附图对本发明作进一步说明。

实施例1川陈皮素对心室的影响

将60只sd大鼠随机分为6组：①假手术组(sham)n＝10(大鼠冠状动脉左前降支只穿线，不结扎，0.5％吐温生理盐水溶液腹腔注射)；②梗死组(ami)n＝10(大鼠冠状动脉左前降支进行结扎后，0.5％吐温生理盐水溶液腹腔注射)；③川陈皮素低剂量组(ami+nob-l)n＝10(大鼠冠状动脉左前降支进行结扎后，川陈皮素7.5mg/kg腹腔注射)；④川陈皮素中剂量组(ami+nob-m)n＝10(大鼠冠状动脉左前降支进行结扎后，川陈皮素15mg/kg腹腔注射)；⑤川陈皮素高剂量组(ami+nob-h)n＝10(大鼠冠状动脉左前降支进行结扎后，川陈皮素30mg/kg腹腔注射)；⑥依那普利组(ami+enalapril)n＝10(大鼠冠状动脉左前降支进行结扎后，依那普利10mg/kg灌胃)；21d实验结束后，行超声心动图检查心脏功能。

1.大鼠心肌缺血模型建立

将实验用雄性sd大鼠称重，用10％水合氯醛，按(300mg/kg)剂量腹腔注射麻醉。将动物仰卧，固定于实验台上，连上心电图仪，用ⅱ导联记录心电图。然后进行气管插管，连接小动物呼吸机，正压通气，设置频率为70次/min，呼吸气时比为5：4，潮气量约15ml/kg。于左胸第3～4肋间消毒、切开皮肤，钝性分离肌层，开胸，剪开心包，暴露心脏左心室和左心耳，可见左心室冠状动脉自左心耳缘中部向下走行于左心室前壁(见图1)。在左心耳与肺动脉圆锥间，以左冠状动脉主干为标志，用6-0号缝线针穿刺结扎冠状动脉左前降支。观察心电图，以心电图ⅱ导联出现st段抬高(见图2)及肉眼观察结扎区域以下组织变灰白等心肌缺血表现确定为结扎成功的指标(见图3)。假手术组(sham)除不结扎冠状动脉外，其余操作相同。

2.超声心动图检查

实验结束前一天进行m型超声心动图检测。采用加拿大visualsonics产的vevo2100高分辨小动物超声成像系统(rmv707b探头，频率设置为23mhz或30mhz，探测深度为10～15mm)和连接15l8高频探头西门子超声仪(contrastpulsesequencingtm，sequoia512，siemens，germany)。大鼠在2％异氟烷吸入麻醉下仰卧位固定于37℃恒温加热板上，四肢与心电图电极相连用于监测心率并记录ecg心电图。左胸前化学脱毛膏脱毛以减少超声干扰，在胸廓表面涂抹超声波导声剂以优化心腔环境，进行超声检测。m型超声心动图的测量：探头置于小鼠胸骨前，获取胸骨旁长轴、短轴视野。左室短轴切面，于乳头肌水平应用m型超声记录左心室运动曲线，测量左室舒张末期内径(leftventricularinternaldimension，diastolic；lvidd)和左室收缩末期内径(leftventricularinternaldimension，systolic；lvids)，通过最大和最小横截面积和厚度计算左室舒张末容积(leftventricularend-systolicvolumes，lvesv)和左室收缩末容积(leftventricularend-diastolicvolumeslvedv)，左室射血分数(leftventricularejectionfraction，lvef)、左室短轴缩短率(fractionalshortening，lvfs)。相关计算公式如下：

lvef(％)＝(lvedv-lvesv)/lvedv×100％

lvfs(％)＝[(lvidd-lvids)/lvidd]×100％

如图4～6所示，梗死组相对假手术组而言，左室射血分数及短轴缩短率明显下降、左室舒张末期内径和左室收缩末期内径增大；川陈皮素中、高剂量组以及依那普利组相对梗死组而言，能显著性提高左室射血分数及短轴缩短率、降低左室收缩末期内径增大的幅度，降低左室舒张末期内径增大幅度的效果不显著；说明川陈皮素主要改善其心肌收缩功能。

实施例2ttc染色法测定大鼠心肌梗死面积

正常心肌细胞含有脱氢酶，在nadh存在的条件下，能将无色的氧化型染料氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazoliumchloride，简称ttc)还原成红色的ttc，而使活体心肌染色。心肌梗死一定时间后，细胞中脱氢酶因细胞膜损伤而释放丢失，不能再使ttc还原染色，故梗死的心肌不能被染色。因此可把不被染色的梗死区与染色的正常心肌分离，用称量法或平面切片的面积求积法估计心肌梗死范围。计算公式为：心肌梗死面积(％)＝∑(每片梗死心肌面积/该片心肌面积×该片心肌重量)/左心室重量×100％。

大鼠完成实施例1中行超声心动图检查心脏功能后被处死，取心脏，做ttc染色，检测心肌的梗死面积，具体操作如下：

1)取材：用1％戊巴比妥钠麻醉大鼠后，将下腔静脉剪断，从主动脉弓灌洗心脏，迅速取出心脏，用冷的pbs将残留的血液冲洗干净；

2)修剪心脏：沿冠状沟切除心房和右心室，留下左心室称重，记录；

3)切片：将左心室置于-20℃冰箱速冻20min左右，待组织稍变硬后将左心室自心尖至心底部横切成4片，每片厚1～2mm。每片称重，并记录；

4)染色：将心脏切片置于用棕色瓶盛装的预热至37℃的1％ttc磷酸盐缓冲液(ph＝7.4，重复用两次)中，37℃孵箱中避光孵育15min。不时翻动瓶子使心肌组织均匀接触到染色液。待染色结束后梗死区呈现白色，非梗死区呈深红色；

5)固定：将染色后的心肌切片置于4％多聚甲醛中固定30min；

6)拍照：用佳能数码相机拍照，将心肌组织由心底向心尖排列好后进行数码拍照

7)结果分析：运用image-proplus图像分析软件测量不同染色区的面积。心肌梗死的程度以梗死区重量(呈现白色的部分)与左心室的重量的百分比表示。

图7的原图为彩色图，彩色图中能清晰显示心肌梗死染色后呈现出的白色，梗死组相对假手术组而言，心肌梗死呈现白色的面积比较大；川陈皮素剂量组以及依那普利组相对梗死组而言，心肌梗死呈现白色的面积比较小。图8中量化了大鼠心肌梗死面积百分数，梗死组相对假手术组而言，心肌梗死面积百分数比较大；川陈皮素剂量组以及依那普利组相对梗死组而言，心肌梗死面积百分数比较小。

综合实施例1和2中的实验，依那普利组(enalapril)为血管紧张素转换酶抑制剂，是一种治疗慢性心衰的药物；川陈皮素中剂量组(ami+nob-m)与依那普利组(ami+enalapril)具有相近治疗慢性心衰的效果。

实施例3川陈皮素对氧葡萄糖剥夺后心肌细胞存活的影响

体外采用h9c2心肌细胞氧葡萄糖剥夺实验模拟心肌缺血模型。氧葡萄糖剥夺实验：细胞生长至80％～90％密度时，进行氧葡萄糖剥夺处理。将细胞取出后，先弃去原有的培养基，用无糖ebss培养基清洗细胞3遍，再加入适量无糖ebss培养基，放置于37℃三气缺氧(n2：co2：o2＝94％：5％：1％)培养箱内缺氧孵育至预定时间。

annexv/pi双染检测细胞凋亡率

实验结束后各组细胞采用0.25％胰消化酶消化并收集细胞，用异硫氰酸荧光素(fitc)标记的连接素(annexinv-fitc)和pi双染(按照annexinv-fitc试剂盒说明书进行)。立即在488nm的激发波长下，用流式细胞仪检测1×10⁴个细胞。pi发射荧光约623nm(红色荧光)，fitc发射荧光约520nm(绿色荧光)，用cellqest软件进行数据分析，得到散点图(见图9)和统计结果图(见图10)。

如图9和图10所示，结果显示川陈皮素明显改善氧葡萄糖剥夺引起的心肌细胞凋亡，呈剂量依赖性。

最后所应当说明的是，以上实施例用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者同等替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。