本发明涉及中药技术领域，尤其涉及茜草有效部位及其制备方法与应用。
背景技术
流感病毒按照病毒颗粒内核蛋白和基质蛋白抗原性的不同可分为甲、乙、丙三种类型。其中，甲型流感病毒又可根据其表面血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)抗原结构的不同分成很多亚型。至今发现不同的ha亚型有18种，其中h1和h3要引起人类的大多数流感，h5、h7、h9偶尔也会造成人类的感染。na亚型有11种，目前在人类中主要的亚型是n1、n2和n9。甲型流感病毒是引起人的季节性流感的主要影响因素，同时它也能感染包括家禽、猪、马在内的多种动物。
流感不仅给人类和动物的健康带来极大的威胁，同时也造成巨大的经济损失及社会秩序的扰乱。季节性流感每年可引发300万到500万例重症，导致25万到50万人死亡。当前对于流感病毒的主要防治措施是接种疫苗，但是疫苗本身具有一定的局限性：免疫接种率低，很难产生有效的群体免疫；对高危人群很难产生有效的免疫力；由于流感病毒rna聚合酶缺少翻译后校正机制，流感病毒易突变，所以在新突变的病毒快速流行的早期较难在短时间内生产出相应的疫苗。因此，抗流感药物在流感的预防和治疗中具有重要作用。
茜草为茜草科植物茜草(rubiacordifolial.)的干燥根和根茎。茜草多年生攀援草本，根数条至数十条丛生，外皮紫红色或橙红色，叶四片轮生，具长柄，叶片形状变化较大，卵形、三角状卵形、宽卵形至窄卵形，浆果球形，红色后转为黑色，花期6-9月，果期8-10月。生于山坡路旁、沟沿、田边、灌丛及林缘，春、秋季采挖。茜草主产于安徽、江苏、山东、河南、山西等地，朝鲜、日本和俄罗斯远东地区亦有分布。具有行血、止血、通经活络、止咳祛痰、抗风湿作用。
茜草属植物主要的化学成分为水溶性的环己肽类，脂溶性的蒽醌及其糖苷类，还原萘醌及其糖苷类，还含有多糖类、萜类、微量元素及谷甾醇、茜草素、茜草酸等，但专门针对茜草蒽醌有效部位研究报道甚少，更未见茜草蒽醌抗病毒作用的相关报道。
技术实现要素：
本发明旨在对茜草的抗病毒作用进行研究，进而发现茜草抗病毒作用的有效部位，且对茜草提取物的制备方法进行优化，以得到高抗病毒活性的有效部位。
有鉴于此，本发明提出了一种茜草有效部位，其特征在于，所述有效部位中的总蒽醌含量为40％以上。
进一步地，所述有效部位中的总蒽醌含量为50％以上。
更进一步地，所述有效部位中的总蒽醌含量为65％以上。
本发明还提供了一种包含上述茜草有效部位的药物组合物，其特征在于，该药物组合物还包括药学上可接受的载体。所述药物组合物可以包括利巴韦林。
进一步地，所述药物组合物的剂型选自注射剂、片剂、栓剂、软膏剂、凝胶剂、丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂和合剂。
本发明还提供了茜草有效部位在制备抗病毒药物中的应用。
本发明还提供了一种茜草有效部位的制备方法，包括如下步骤：
a.茜草的干燥根和根茎加水、醇或醇水混合溶剂加热提取，合并煎液或提取液，过滤，滤液减压浓缩得药液1；
b.将药液1加水稀释，离心后得上清液，将所得上清液过滤，得药液2；
c.将药液2用有机溶剂萃取，合并有机溶剂层，减压浓缩得干膏；
d.将干膏用水稀释，通过大孔树脂柱吸附，先用水洗，再用乙醇洗脱，合并洗脱液，再经过减压浓缩，将得到的浓缩液干燥，粉碎，即得茜草有效部位。
进一步地，步骤a中的醇选自乙醇。提取用乙醇的浓度优选为50-90％。
优选地，在步骤c中，所述药液2与所述有机溶剂的体积比为1：(1～5)。
具体地，在步骤c中，所述有机溶剂选自乙酸乙酯、正丁醇。
进一步地，所述大孔树脂选自苯乙烯、二乙烯苯、丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯中任意一种或几种作为骨架材料的极性或非极性树脂。
更进一步地，在步骤d中，用60％-90％乙醇洗脱。进一步优选用65％-75％乙醇洗脱。
利用本发明的提取物的制备方法得到了高蒽醌含量的茜草有效部位，其制备工艺简单，采用有机溶剂充分萃取，使茜草有效部位中蒽醌的含量在40％以上，易于操作，成本低廉。该方法获得的茜草有效部位有非常好的抗病毒效果，然后通过实验进一步发现总蒽醌含量越高，其抗病毒效果越强，显示出茜草蒽醌类物质有较强的抗病毒活性。
具体实施方式
如前所述，本发明旨在提供一种茜草有效部位及其制备方法与应用。以下将结合实验例的内容进行具体描述。
特别需要指出的是，针对本发明所做出的类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明如未注明具体条件者，均按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用原料药或辅料，以及所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
茜草抗病毒有效部位制备
制备例1：
取茜草科植物茜草的干燥根或根茎，加入重量体积比为10倍量的水煎煮，煎煮2次，每次3h，合并煎液，过滤，滤液减压浓缩得药液1。将所得药液1加热水稀释，离心得上清液，将所得上清液滤过，得药液2。所得滤液2用乙酸乙酯按1:3比例萃取3次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩得到至干膏，干膏用水稀释后，通过ab-8大孔树脂柱吸附，弃去流出液，用水洗除去水溶性杂质，弃去水洗液，再用60％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、干燥、粉碎，即得茜草抗病毒有效部位，其总蒽醌含量为50.6％。
制备例2：
茜草科植物茜草的干燥根或根茎，加入重量体积比为8倍量的体积浓度为60％乙醇水溶液，提取3次，每次2h，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩得药液1。将所得药液1加热水稀释，离心得上清液，将所得上清液滤过，得药液2。所得滤液2用正丁醇按1:4比例萃取3次，合并正丁醇层，减压浓缩得到至干膏，干膏用水稀释后，通过hp-20大孔树脂柱吸附，弃去流出液，用水洗除去水溶性杂质，弃去水洗液，再用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、干燥、粉碎，即得茜草抗病毒有效部位，其总蒽醌含量为60.7％。
制备例3：
加入重量体积比为6倍量的体积浓度为70％乙醇水溶液，提取3次，每次2h，合并提取液，过滤,滤液减压浓缩得药液1。将所得药液1加热水稀释，离心得上清液，将所得上清液滤过，得药液2。所得滤液2用乙酸乙酯按1:5比例萃取3次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩得到至干膏，干膏用水稀释后，通过d101大孔树脂柱吸附，弃去流出液，用水洗除去水溶性杂质，弃去水洗液，用80％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、干燥、粉碎，即得茜草抗病毒有效部位，其总蒽醌含量为64.7％。
制备例4：
茜草科植物茜草的干燥根或根茎，加入重量体积比为8倍量的体积浓度为50％乙醇水溶液，提取4次，每次1h，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩得药液1。将所得药液1加热水稀释，离心得上清液，将所得上清液滤过，得药液2。所得滤液2用正丁醇按1:4比例萃取2次，合并正丁醇层，减压浓缩得到至干膏，干膏用水稀释后，通过hp-20大孔树脂柱吸附，弃去流出液，用水洗除去水溶性杂质，弃去水洗液，再用60％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、干燥、粉碎，即得茜草抗病毒有效部位，其总蒽醌含量为55.2％。
制备例5：
取茜草科植物茜草的干燥根或根茎，加入重量体积比为10倍量的水煎煮，煎煮2次，每次2h，合并煎液，过滤，滤液减压浓缩得药液1。将所得药液1加热水稀释，离心得上清液，将所得上清液滤过，得药液2。所得滤液2用乙酸乙酯按1:1比例萃取2次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩得到至干膏，干膏用水稀释后，通过ab-8大孔树脂柱吸附，弃去流出液，用水洗除去水溶性杂质，弃去水洗液，再用65％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、干燥、粉碎，即得茜草抗病毒有效部位，其总蒽醌含量为45.6％。
制备例6：
茜草科植物茜草的干燥根或根茎，加入重量体积比为9倍量的体积浓度为70％乙醇水溶液，提取3次，每次2h，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩得药液1。将所得药液1加热水稀释，离心得上清液，将所得上清液滤过，得药液2。所得滤液2用正丁醇按1:2比例萃取4次，合并正丁醇层，减压浓缩得到至干膏，干膏用水稀释后，通过hpd100大孔树脂柱吸附，弃去流出液，用水洗除去水溶性杂质，弃去水洗液，再用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、干燥、粉碎，即得茜草抗病毒有效部位，其总蒽醌含量为70.7％。
制备例7：
茜草科植物茜草的干燥根或根茎，加入重量体积比为10倍量的体积浓度为70％乙醇水溶液，提取2次，每次2h，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩得药液1。将所得药液1加热水稀释，离心得上清液，将所得上清液滤过，得药液2。所得滤液2用乙酸乙酯按1:3比例萃取3次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩得到至干膏，干膏用水稀释后，通过hpd100大孔树脂柱吸附，弃去流出液，用水洗除去水溶性杂质，弃去水洗液，用75％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、干燥、粉碎，即得茜草抗病毒有效部位，其总蒽醌含量为68.7％。
制备例8：
加入重量体积比为6倍量的体积浓度为水溶液，提取2次，每次2h，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩得药液1。将所得药液1加热水稀释，离心得上清液，将所得上清液滤过，得药液2。所得滤液2用乙酸乙酯按1:5比例萃取2次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩得到至干膏，干膏用水稀释后，通过d201大孔树脂柱吸附，弃去流出液，用水洗除去水溶性杂质，弃去水洗液，用60％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、干燥、粉碎，即得茜草抗病毒有效部位，其总蒽醌含量为42.1％。
制备例9：
茜草科植物茜草的干燥根或根茎，加入重量体积比为8倍量的体积浓度为60％乙醇水溶液，提取1次，回流3h，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩得药液1。将所得药液1加热水稀释，离心得上清液，将所得上清液滤过，得药液2。所得滤液2用正丁醇按1:4比例萃取3次，合并正丁醇层，减压浓缩得到至干膏，干膏用水稀释后，通过hp-20大孔树脂柱吸附，弃去流出液，用水洗除去水溶性杂质，弃去水洗液，再用90％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、干燥、粉碎，即得茜草抗病毒有效部位，其总蒽醌含量为50.5％。
基于以上制备例，本发明因而提出了一种高蒽醌含量的茜草有效部位的制备方法，其包括如下步骤：
a.茜草的干燥根和根茎加水、醇或醇水混合溶剂加热提取，合并煎液或提取液，过滤，滤液减压浓缩得药液1；
b.将药液1加水稀释，离心后得上清液，将所得上清液过滤，得药液2；
c.将药液2用有机溶剂萃取，合并有机溶剂层，减压浓缩得干膏；
d.将干膏用水稀释，通过大孔树脂柱吸附，先用水洗，再用乙醇洗脱，合并洗脱液，再经过减压浓缩，将得到的浓缩液干燥，粉碎，即得茜草有效部位。
具体地，在步骤a中，茜草药材和提取溶剂的比例为1：(6～10)，更优选为1：(8～10)，再优选为1：(9～10)，最优选为1：10。提取方法为回流提取，所述提取的次数优选为1～3次，更优选为2～3次，再优选为2次；每次提取的时间优选为1～4h，更优选为2～4h，再优选为2～3h，最优选为2h；浓缩的方法并无特殊限定，可以为本领域公知的浓缩方法，本发明优选采用减压的方法进行浓缩，除去溶剂即得到药液1。
步骤a中的醇优选为浓度为50-90％的乙醇，浓度更优选为60％～80％，最优选为70％。
在步骤c中，所述药液2与所述有机溶剂的体积比优选为1：(1～5)，更优选为1：(1～4)，再优选为1：(1～3)；所述有机溶剂选自乙酸乙酯、正丁醇；所述萃取的次数优选为2～4次，更优选为3～4次，最优选为3次。
进一步地，所述大孔树脂选自苯乙烯、二乙烯苯、丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯中任意一种或几种作为骨架材料的极性或非极性树脂，例如d101、d201、ab-8、hp-20、xad-4、xad-16、hpd100、hpd200、hpd400等，优选为苯乙烯型大孔树脂。
更进一步地，在步骤d中，用60％-90％乙醇洗脱。进一步优选用65％-75％乙醇洗脱。所用的干燥方法为真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、常压干燥等，优选为真空干燥、冷冻干燥。
可见，上述提取物的制备方法，其工艺简单，该采用水或有机溶剂充分提取或萃取的方法，易于操作，成本低廉，得到的茜草有效部位中蒽醌的含量在40％以上，最高能达到70.7％。
本发明的茜草有效部位中总蒽醌的含量测定方法
1.仪器与试剂
uv-300型紫外可见分光光度计，日本岛津公司；恒温水浴锅，电子分析天平，1,8-二羟基蒽醌，中国药品检定所。
2.最大吸收波长及标准曲线确定
精密称取1,8-二羟基蒽醌10mg，甲醇溶解，定容至100ml，作为对照品标准溶液，吸取1ml水浴蒸干，加0.5％醋酸镁甲醇溶液，摇匀使之溶解，在紫外可见分光光度计下对其进行500-800nm波长范围光谱扫描，确定其最大吸收波长为515nm。
分别精密吸取对照品标准溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml，水浴蒸干，加0.5％醋酸镁甲醇溶液，摇匀使之溶解，分别定容至10ml，以0.5％醋酸镁甲醇溶液作为空白对照，在515nm下测定吸光度，以吸光度(a)为纵坐标，浓度(c)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为a＝0.039c-0.018，r2＝0.999。对照品溶液在0.05～0.25mg/ml浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系。3.供试品溶液的制备
取待测成分适量，精密称定，加甲醇制成0.1mg/ml溶液。
4.纯度测定方法
精密吸取供试品溶液2ml，回收溶液至干，残渣加入0.5％醋酸镁甲醇溶液溶解，定容至10ml，于515nm下测定吸光度，根据标准曲线计算得出样品中总蒽醌含量。
5.测定方法考察
精密度考察：精密吸取2项下制得的对照品溶液1ml于10ml量瓶中，加0.5％醋酸镁甲醇溶液定容。摇匀后于515nm处重复测定5次，记录吸光度值，计算rsd值。结果rsd为0.52％，表明仪器精密度良好。
稳定性考察：精密吸取2项下制得的对照品溶液1ml于10ml量瓶中，加0.5％醋酸镁甲醇溶液定容。分别于0，15，30，60，120min在515nm下进行测定，记录吸光度值，计算rsd值。结果rsd为2.33％，表明供试品溶液在2h内稳定性良好。
重复性考察：精密称取制备例2所得茜草有效部位5份，加甲醇制成0.1mg/ml溶液。精密吸取供试品溶液2ml，回收溶液至干，残渣加入0.5％醋酸镁甲醇溶液溶解，定容至10ml，于515nm下测定吸光度，计算rsd。结果总蒽醌平均含量为60.7％，rsd为1.23％，表明本方法重现性良好。
加样回收率考察：采用加样回收法，精密称取精密称取制备例2所得茜草有效部位5份，分别按照1∶0.8，1∶1.0，1∶1.2加入1,8-二羟基蒽醌对照品，加甲醇制成0.1mg/ml溶液。精密吸取供试品溶液2ml，回收溶液至干，残渣加入0.5％醋酸镁甲醇溶液溶解，定容至10ml，于515nm下测定吸光度。
该法专属性好，空白溶剂在515nm下对总蒽醌吸光度无干扰；在0.05～0.25mg/ml范围内线性关系良好，相关系数大于0.999；回收率良好，在98％～102％之间，rsd值均低于2.0％；精密度符合规定，rsd小于1％；溶液在2h内稳定性好，供试品溶液与对照品溶液于室温下放置2h，吸光度均无明显变化。
茜草有效部位抗病毒活性检测
选择蒽醌含量在40-70％的上述制备例中的样品用于抗病毒活性检测，并以利巴韦林作为阳性对照组，以检测不同蒽醌含量的茜草有效部位的抗病毒活性。
实验一：茜草有效部位细胞毒性实验
1.实验材料
茜草抗病毒活性有效部位：样品1(制备例1的制备方法所得，茜草总蒽醌含量为50.6％)；样品2(制备例2的制备方法所得，茜草总蒽醌含量为60.7％)；样品3(制备例6的制备方法所得，茜草总蒽醌含量为70.7％)；样品4(制备例8的制备方法所得，茜草总蒽醌含量为42.1％)。狗肾细胞系mdck，来源于atcc，中国科学院武汉病毒研究所传代保存。
仪器：co2培养箱，美国thermofisherscientific；酶标仪，moleculardevices；生物安全柜，购自healforce公司。
2.实验原理及方法
2.1样品对mdck细胞的毒性检测
实验原理：实验采用
样品分组：组1为制备例1的制备方法所得，茜草总蒽醌含量为50.6％的茜草蒽醌有效部位；组2为制备例2的制备方法所得，茜草总蒽醌含量为60.7％的茜草蒽醌有效部位；组3为制备例6的制备方法所得，茜草总蒽醌含量为70.7％的茜草蒽醌有效部位；组4为制备例8的制备方法所得，茜草总蒽醌含量为42.1％的茜草蒽醌有效部位。
实验步骤：将mdck细胞接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后备用。药物用dmem培养基从2倍最高测试浓度起连续3倍梯度稀释6个梯度。将药物加入到细胞中，于37℃的co2培养箱中培养。加药培养24h后，显微镜下观察药物引起的细胞病变效应(cpe)，加入alamarblue检测细胞存活率。药物对细胞的毒性的大小与细胞的活性呈反比，并以细胞活性来反映。
计算公式：细胞活性(％)＝(药物组-空白对照)/(细胞对照-空白对照)*100
表1茜草蒽醌细胞毒性实验数据
结果如表1所示，在250μg/ml浓度下各样品组均对mdck细胞无细胞毒性。
实验二：茜草有效部位体外抗甲型流感病毒h3n2活性实验
1.实验材料
茜草抗病毒活性有效部位：样品1(制备例1的制备方法所得，茜草总蒽醌含量为50.6％)；样品2(制备例2的制备方法所得，茜草总蒽醌含量为60.7％)；样品3(制备例6的制备方法所得，茜草总蒽醌含量为70.7％)；样品4(制备例8的制备方法所得，茜草总蒽醌含量为42.1％)。
病毒株：甲型流感病毒(h3n2，a/hongkong/498/97)，由中国科学院武汉病毒研究所扩增保存。
培养条件：dmem+10％胎牛血清、37℃、5％co2。
仪器：co2培养箱，美国thermofisherscientific；酶标仪，moleculardevices；生物安全柜，购自healforce公司。
2.样品的抗h3n2活性检测
实验原理：由于流感病毒的结构蛋白的表达水平与病毒的复制成正比，实验通过测定流感病毒蛋白表达水平来反映病毒的复制水平。本实验室采用灵敏度高的试剂，检测荧光强度的变化，反应流感病毒蛋白的表达。
样品分组：组1为制备例1的制备方法所得，茜草总蒽醌含量为50.6％的茜草蒽醌有效部位；组2为制备例2的制备方法所得，茜草总蒽醌含量为60.7％的茜草蒽醌有效部位；组3为制备例6的制备方法所得，茜草总蒽醌含量为70.7％的茜草蒽醌有效部位；组4为制备例8的制备方法所得，茜草总蒽醌含量为42.1％的茜草蒽醌有效部位。组5为组3与阳性药按1:1比例混合所得；组6为组4与阳性药按1:1比例混合；组7为阳性药ribavirin。上述各分组初始浓度均为160μg/ml。
方法步骤：实验同时设空白对照孔(正常细胞)，病毒对照孔(病毒感染后未加药物)，阳性药物对照孔(感染后加利巴韦林)，根据细胞毒性实验的结果，在浓度为250μg/ml以内时，药物对细胞无毒性。
mdck细胞接种于96孔细胞培养板中，37℃培养过夜后备用。mdck细胞用pbs洗两遍后，同时加入流感病毒液及逐级稀释浓度的药物。置于37℃细胞培养箱培养24h后，显微镜观察细胞病变(cpe)；取培养液上清检测病毒蛋白表达水平。
抑制率(％)＝100-(样品孔-空白对照)/(病毒对照-空白对照)*100
3.样品抗h3n2活性检测结果
阳性药物利巴韦林及样品对流感病毒h3n2的具体抑制作用和对mdck细胞的毒性结果下。
表2样品对流感病毒h3n2的抑制作用和细胞毒性
在此次实验中通过检测流感病毒的复制水平，结果表明阳性药物利巴韦林对流感病毒h3n2有很强的呈剂量依赖的抑制作用，引起50％抑制效应的浓度ec50约为21.892μg/ml。受检测样品茜草有效部位对流感病毒h3n2有抗病毒活性，含量为70.7％的茜草有效部位在250μg/ml浓度下对mdck无毒性，对h3n2的ec50约为18.318μg/ml，其抗病毒活性优于阳性药利巴韦林。
蒽醌含量70.7％的茜草有效部位对h3n2的ec50为18.318μg/ml，而蒽醌含量42.1％的茜草有效部位ec50为36.336μg/ml，该实验结果表明茜草有效部位对流感病毒h3n2具有很好的抑制作用，并且随着茜草有效部位中总蒽醌的含量增加，其对流感病毒的抑制作用明显提高，表明总蒽醌为茜草中抗病毒的主要活性物质。
实验三：茜草有效部位体外抗甲型流感病毒h1n1活性实验
1、实验材料
茜草抗病毒活性有效部位样品1(制备例1的制备方法所得，茜草总蒽醌含量为50.6％)；样品2(制备例2的制备方法所得，茜草总蒽醌含量为60.7％)；样品3(制备例6的制备方法所得，茜草总蒽醌含量为70.7％)；样品4(制备例8的制备方法所得，茜草总蒽醌含量为42.1％)。
病毒株：甲型流感病毒(h1n1，a/puertorico/8/1934)，由中国科学院武汉病毒研究所扩增保存。
培养条件：dmem+10％胎牛血清、37℃、5％co2。
2.样品的抗h1n1活性检测
实验原理：由于流感病毒的结构蛋白的表达水平与病毒的复制成正比，实验通过测定流感病毒蛋白表达水平来反映病毒的复制水平。本实验室采用灵敏度高的试剂，检测荧光强度的变化，反应流感病毒蛋白的表达。
样品分组：组1为制备例1的制备方法所得，茜草总蒽醌含量为50.6％的茜草蒽醌有效部位；组2为制备例2的制备方法所得，茜草总蒽醌含量为60.7％的茜草蒽醌有效部位；组3为制备例6的制备方法所得，茜草总蒽醌含量为70.7％的茜草蒽醌有效部位；组4为制备例8的制备方法所得，茜草总蒽醌含量为42.1％的茜草蒽醌有效部位。组5为组3与阳性药按1:1比例混合所得；组6为组4与阳性药按1:1比例混合；组7为阳性药ribavirin。上述各分组初始浓度均为160μg/ml。
方法步骤：mdck细胞接种于96孔细胞培养板中，37℃培养过夜后备用。mdck细胞中同时加入药物及流感病毒液。置于37℃细胞培养箱培养24h后，显微镜观察细胞病变(cpe)；取培养液上清检测病毒蛋白表达水平。
实验设空白对照孔(正常细胞)，病毒对照孔(病毒感染后未加药物)，阳性药物对照孔(感染后加利巴韦林)。
抑制率(％)＝100-(样品孔-空白对照)/(病毒对照-空白对照)*100
3.样品抗h1n1活性检测结果
阳性药物利巴韦林及样品对流感病毒h1n1的具体抑制作用和对mdck细胞的毒性结果如下所示：
表3样品对流感病毒h1n1的抑制作用和细胞毒性
在此次实验中通过检测流感病毒的复制水平，结果表明阳性药物利巴韦林对流感病毒h1n1有很强的呈剂量依赖的抑制作用，引起50％抑制效应的浓度ec50约为26.375μg/ml。受检测样品含量为70.7％的茜草有效部位对流感病毒h1n1有抗病毒活性，在250μg/ml浓度下对mdck无毒性，对h1n1的ec50约为23.253μg/ml，其抗病毒活性高于利巴韦林组。蒽醌含量70.7％的茜草有效部位对h1n1的ec50为23.253μg/ml，而蒽醌含量42.1％的茜草有效部位ec50为79.624μg/ml，该实验结果表明茜草有效部位对流感病毒h3n2具有很好的抑制作用，并且随着茜草有效部位中总蒽醌的含量增加，其对流感病毒的抑制作用明显提高，表明总蒽醌为茜草中抗病毒的主要活性物质。
基于以上药效试验可知，该方法获得的茜草有效部位有非常好的抗病毒效果，总蒽醌含量越高，其抗病毒效果越强，显示出茜草蒽醌类物质有较强的抗病毒活性，其中，茜草有效部位中的总蒽醌含量在65％以上时，其抗病毒活性高于利巴韦林组。提示了本发明制备的茜草有效部位可以用于制备抗病毒药物，尤其是用于制备抗流感病毒的药物。
包含有效部位的组合物制备
片剂
取茜草抗病毒活性有效部位12.2g，研成细粉，加入10％淀粉糊约8g，药用淀粉7g，微粉硅胶0.8g，混合，14目筛制粒，于80℃干燥，整粒，加入硬脂酸镁0.05g，混匀，压制成100片，即得。每片重0.2g，口服，每次1片，一日三次。
硬胶囊
取茜草抗病毒活性有效部位16g，研成细粉，药用淀粉3.5g，硬脂酸镁0.01g，混合均匀，过筛，装入胶囊，制成100粒，即得。每粒内容物重0.2g，口服，每次1粒，一日两次。
软胶囊
取茜草抗病毒活性有效部位12.2g，加入丙二醇0.2g，卵磷脂0.9g，大豆油18g，振动磨超微20分钟，使混匀，制成软胶囊100粒，即得。每粒内容物重0.3g，口服，每次1粒，一日三次。
颗粒剂
取茜草抗病毒活性有效部位13.8g，研成细粉，加入糊精25g，乳糖458g，混合均匀，制粒，于80℃干燥，整粒，分装，制100包，即得。每包重5g，口服，每次1包，一日两次。
缓释片
取茜草抗病毒活性有效部位24.4g，研成细粉，过100目筛，hpmc10.3g，乳糖16g，十二烷基硫酸钠1g，过100目筛，混合均匀，加入2％聚维酮(95％乙醇)黏合剂制软材，过20目筛制粒，于50℃干燥，过18目筛整粒，干颗粒采用外加法加入2％硬脂酸镁，混匀，压片，制成缓释片100片，即得。每片重0.5g。口服，每次1片，一日一次。
滴丸
取茜草抗病毒活性有效部位12.2g，研成细粉，另取24.8g聚乙二醇4000加热熔融，加入水翁花提取物，振动磨超微20分钟，使混合均匀，滴制成滴丸，即得。每丸重0.35g，口服，每次1粒，一日三次。
注射剂
取上茜草抗病毒活性有效部位12.2g，研成细粉，加入β环糊精4.5g，蔗糖500g，纯水适量(约390g)搅拌加热溶解，煮沸10分钟，稍冷后加入10％(w/v)尼泊金乙酯乙醇溶液搅匀，用水调整至100ml，过滤，分装，灭菌，即得。每支10ml。口服，每次1支，一日三次。
需要指出的是，上述包含茜草有效部位的药物组合物，可根据药剂学领域的常用辅料，根据剂型和实际情况进行恰当选择，例如常见的辅料有淀粉、低取代羟丙基纤维素、微粉硅胶、硬脂酸镁、淀粉浆、蔗糖、糊精、羧甲基淀粉钠、滑石粉、聚山梨酯、聚乙二醇、注射用大豆磷脂和注射用甘油等；制备所需药物的各种剂型时，可以按照药剂学领域的常规生产方法制备，如将该化合物与一种或多种载体混合，然后制成相应的剂型。作为优选，所述药物制剂的剂型包括注射剂、片剂、栓剂、软膏剂、凝胶剂、丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂与合剂等等。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。