本发明涉及制药技术领域，具体涉及束花石斛降血糖有效部位、有效成分及其制备方法和应用。
背景技术：
石斛，兰科植物之一，在我国主要分布于西南、华南、台湾等地，对人体具有曲解虚热、益精强阴等疗效，药用价值已被世人所认可，并被广泛使用。石斛始载于《神农本草经》，记载：“味甘、平，无毒；治伤中，除痹，下气，补五脏虚劳，赢瘦，强阴；久服厚肠胃，轻身，延年，长肌肉，逐皮肤邪热，定志除惊等”。《本草纲目拾遗》(清·赵学敏)：“清胃除虚热，生津，已劳损，以之代茶，开胃健脾，定惊疗风，能镇炎痰，解暑，甘芳降气等”。
石斛属为兰科比较大的属之一，全球约有1000余种，我国有石斛属植物共74种2变种，其中有药用价值且能进行商品流通的有50余种，如束花石斛、铁皮石斛、金钗石斛等。束花石斛(dendrobiumchrysanthumlindl.)是《中华人民共和国药典》收载入药的石斛中药材之一，味淡、性微寒，有滋阴养胃、清热解毒的功效，在临床上多用于治疗慢性咽喉炎、眼科疾病、血栓闭塞性疾病，效果十分明显，现是脉络宁、通塞脉片、石斛夜光丸等著名中成药的主要原料之一，为我国常用的传统中药植物，国内外需求量大。在我国主要分布在云南、广西、贵州等省。
现有研究中，尚未有束花石斛及其制剂用于糖脂代谢紊乱防治中的研究报道。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明所要解决的技术问题，就是提出一种束花石斛降血糖有效部位和有效成分，其具有降血糖活性，可用于防治糖脂代谢紊乱，同时提出上述有效部位和有效成分的制备方法和应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：
一种束花石斛降血糖有效部位的制备方法，包括以下步骤：
(1)以干燥束花石斛茎为原料，粉碎后用极性溶剂提取得到提取液，然后进行抽滤处理得到总浸膏；
(2)将总浸膏与水混溶，然后依次用极性由低到高的a、b、c、d四种溶剂进行梯度萃取，分别得到四种萃取部位的浸膏，其中，溶剂a为非极性溶剂，溶剂b为常用的中等偏低极性溶剂，溶剂c为中强极性溶剂，溶剂d为强极性溶剂；
(3)最后将四种萃取部位的浸膏分别进行浓缩和蒸干，得到a、b、c、d四种有效部位。
作为优选地，所述步骤(1)中提取用的极性溶剂为丙酮、甲醇、乙醇、水中的一种或多种，提取温度为60～100℃,回流提取3-5次，每次2-4h。
作为优选地，所述步骤(2)中的溶剂a为石油醚、环己烷、苯中的一种或多种，溶剂b为三氯甲烷、乙醚、四氢呋喃中的一种或多种，所述溶剂c为乙酸乙酯，所述溶剂d为正丁醇、异丙醇中的一种或两种。
作为优选地，上述束花石斛降血糖有效部位的制备方法具体包括以下步骤：
(1)以干燥束花石斛茎为原料，粉碎后用95％的乙醇提取得到提取液，然后进行抽滤处理得到总浸膏；
(2)将总浸膏与水按2:1混溶，然后依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇四种溶剂进行梯度萃取，分别得到四种萃取部位的浸膏；
(3)最后将四种萃取部位的浸膏分别进行浓缩和蒸干，得到石油醚有效部位、三氯甲烷有效部位、乙酸乙酯有效部位及正丁醇有效部位。
一种束花石斛降血糖有效成分的制备方法，包括如下步骤：将溶剂b萃取得到的有效部位先经200-300目的硅胶柱色谱分离，然后用极性从小到大的洗脱剂体系e和洗脱剂体系f进行梯度洗脱，tlc检识，合并相同组分，得到各组分再反复经200-300目的硅胶柱色谱，sephadexlh-20柱色谱及石油醚或乙酸乙酯重结晶分离纯化得到化合物异纽替皂苷元和26-o-纽替皂苷元葡萄糖苷。
作为优选地，所述洗脱剂体系e为石油醚-二氯甲烷体系，所述洗脱剂体系f为二氯甲烷-甲醇体系。
作为优选地，上述束花石斛降血糖有效成分的制备方法，具体包括如下步骤：将三氯甲烷部位经过200-300目硅胶柱色谱，以硅胶作为吸附剂，石油醚-二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，每1000ml为一个流分，以石油醚:二氯甲烷＝100:1、20:1、10:1、8:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1和二氯甲烷11个梯度进行第一阶段洗脱，然后以二氯甲烷：甲醇＝100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、4:1、2:1及纯甲醇8个梯度进行第二阶段洗脱；二氯甲烷：甲醇＝50:1的流分经200-300目硅胶柱色谱，sephadexlh-20柱色谱及石油醚/乙酸乙酯混合重结晶分离纯化得到变形螺甾烷醇类甾体皂苷：26-o-纽替皂苷元葡萄糖苷及异纽替皂苷元化合物。
本发明还提出了采用上述束花石斛降血糖有效部位的制备方法制备得到的束花石斛降血糖有效部位。
本发明还提出了采用上述束花石斛降血糖有效成分的制备方法制备得到的束花石斛降血糖有效成分。
本发明还提出了束花石斛在制备降血糖的药物或者功能性食品方面的应用，具体地，是束花石斛制备得到的降血糖有效部位或有效成分在制备降血糖的药物或者功能性食品方面的应用。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：本发明的以束花石斛根茎作为依托，开发其功效，扩大束花石斛新的药用资源和实现资源的综合利用。后期采用hplc-ms/ms对束花石斛醇提物化学成分进行分析，结合保留时间、分子离子峰及二级质谱的碎片信息等，推定出苯丙素类化合物29个(其中14个为新化合物)、黄酮及黄酮苷类9个、菲类及联苄类25个、糖苷类18个、简单苯取代物18个、芴酮类化合物4个、生物碱类化合物12个。动物实验研究表明：将束花石斛三氯甲烷部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位不同浓度的样品作用于胰岛素抵抗的hepg2细胞，用葡萄糖试剂盒检测细胞对葡萄糖的消耗量，mtt法检测细胞活性，结果显示，与模型组比较，束花石斛各部位浸膏都能够在一定程度上促进胰岛素抵抗的hepg2细胞对葡萄糖的消耗，其中三氯甲烷部位给药组hepg2细胞胰岛素敏感性显著改善。
另外，三氯甲烷部位进行处理获得异纽替皂苷元和26-o-纽替皂苷元葡萄糖苷的束花石斛降血糖有效成分，其通过改善胰岛素抵抗，恢复胰岛素这种降血糖激素对血糖的调节，用于防治糖脂代谢紊乱。
附图说明
图1为试验大鼠口服葡萄糖后各个时刻血糖值。
具体实施方式
为让本领域的技术人员更加清晰直观的了解本发明，下面将结合附图，对本发明作进一步的说明。
实施例1
束花石斛总浸膏的制备：用7.5kg束花石斛干燥茎粉碎后用95％乙醇加热回流提取4次，每次3h，抽滤，旋蒸回收溶剂，得束花石斛总浸膏550g。
将束花石斛总浸膏(高、低剂量组)作用于2型糖尿病大鼠(高糖高脂喂养联合小剂量注射stz诱导)，通过比较给药前后大鼠血糖和体重的变化，并测定给药后大鼠血脂四项、胰岛素的含量和血糖值，结合口服糖耐量试验来研究束花石斛对2型糖尿病大鼠的影响。
结果显示，与给药前大鼠血糖值比较，束花石斛高剂量组能显著降低糖尿病大鼠血糖；束花石斛给药组(高、低剂量组)的hdl-c含量明显高于模型组，而ldl-c含量明显低于模型组；束花石斛给药组(高、低剂量组)血糖和糖化血清蛋白均明显低于模型组，束花石斛高剂量组胰岛素抵抗指数也明显低于模型组；口服糖耐量试验显示，模型组大鼠的药时曲线下面积最大。说明束花石斛具有显著的降低糖尿病大鼠血糖、综合改善糖尿病大鼠脂代谢紊乱和胰岛素抵抗、增强糖尿病大鼠耐受葡萄糖的能力，为研究束花石斛降血糖物质基础提供了实验依据。
因此，本发明的束花石斛茎提取物可应用在降血糖的药物或者功能性食品中，用于防治糖脂代谢紊乱。
上述验证实验具体过程如下：
一、实验材料
1、实验动物
4-5周雄性sd大鼠50只，体重80-110g，购于广东省医学实验动物中心。
2、材料来源
束花石斛干燥茎，购于云南文山。
3、主要试剂与仪器
链脲佐菌素(stz)购于美国sigma公司，临用前用0.1mol/ml柠檬酸盐缓冲液(ph＝4.4)配成1％的溶液(10mg/ml的stz)；阳性药：罗格列酮(购于广州有田生物科技有限公司)，配成0.084mg/ml备用；麻醉药：戊巴比妥钠(购于广州东巨实验仪器有限公司)；甘油三酯(tg，批号：20151207)；总胆固醇(tc，批号：20151206)；高密度脂蛋白胆固醇(hdl，批号：20151204)；低密度脂蛋白胆固醇(ldl，批号：20151207)；葡萄糖(glu，批号：20150603147)；糖化血清蛋白(gsp，批号：20151216)试剂盒购于南京建成生物工程研究所；高糖高脂饲料购于广东省医学实验动物中心；欧姆龙血糖仪(购于欧姆龙健康医疗(中国)有限公司)；血糖试纸(购于达而泰(天津)实业有限公司)。
二、实验方法
1、造模
4-5周雄性sd大鼠50只，免疫观察室喂养三天后将其置于室温(18-25℃)，相对湿度(50％-80％)的环境下，自由采食饮水，适应饲养1周后，高糖高脂饲料喂养，喂养四周后，禁食过夜。将已配好的10mg/ml的stz，避光、冰浴、即用。按35mg/kg的stz腹腔注射造模，继续高脂饮食，观察大鼠饮食饮水量、尿量、毛色、体重等情况，两周后禁食8h测血糖，选取血糖高于11.1mmol/l者作为高血糖模型大鼠。
2、降血糖实验
将高血糖模型大鼠随机分成4组，分别为模型组、阳性对照组、束花石斛高剂量组、束花石斛低剂量组，每组8只，正常对照组8只。记录给药前各大鼠的血糖值和体重。束花石斛高剂量组的给药剂量折算为生药材按平均每日2.16g/kg体重给药，束花石斛低剂量组的给药剂量折算为生药材按平均每日1.08g/kg体重给药。模型对照组给予同体积生理盐水，阳性对照组每日平均给予0.42mg/kg罗格列酮，连续灌胃给药。因糖尿病模型大鼠具有典型的三多一少症状，每日观察记录体重、饮食、饮水、垫料情况，每10天检测血糖值(尾静脉取血)，给药8周后，将所有大鼠禁食过夜，尾静脉取血测血糖值，并记录大鼠体重。采用1％戊巴比妥钠(0.3ml/100g)麻醉大鼠，将鼠仰卧并固定于鼠固定板上，剪去胸腹部位的被毛，并且用75％酒精消毒皮肤，剪开腹腔，静脉采血，血样置入无酶采血管中，离心(3000rpm，15min)，弃去血浆，留血清备用。取大鼠肾脏、下丘脑、垂体备用。测定血清中的甘油三酯(tg)、总胆固醇(tc)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)、糖化血清蛋白(gsp)、胰岛素及血糖值。
三、实验原理
1、血脂四项的测定
血脂四项包括血浆总胆固醇(tc)，血浆甘油三酯(tg)，低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)，高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)。总胆固醇是指血液中所有脂蛋白所含胆固醇之总和，是临床血脂分析的重要指标，总胆固醇升高，患心脑血管病的危险性增加。甘油三酯是人体内含量最多的脂类，其首要功能是为细胞代谢提供能量。但当其升高可见于各种高脂蛋白血症、糖尿病、痛风、梗阻、黄疸、甲状腺功能低下、胰腺炎等，同时甘油三酯也是冠心病的一个危险因素。高密度脂蛋白为血清蛋白之一，是一种抗动脉粥样硬化的血浆脂蛋白，是冠心病的保护因子。俗称“血管清道夫”。相反，低密度脂蛋白则被称之为“坏的胆固醇”。
糖尿病患者血脂异常典型特征：tg增高、ldl-c升高或正常、ldl-c亚型小而密、ldl(sldl-c)比例增高，从而致粥样硬化血脂异常。临床上高tg合并高ldl-c较为多见，最常见的是tc和tg水平都显著升高，而单纯性血脂异常很少。因此，血脂四项的测定可以在一定程度上反映出糖尿病大鼠的状态。
2、血糖、糖化血清蛋白、胰岛素的测定及胰岛素抵抗指数的计算
对于糖尿病病人而言，血糖浓度是其临床检验的重要指标，但它具有临时性的特点。糖化血清蛋白(gsp)主要是白蛋白与葡萄糖发生糖化反应，形成果糖胺，其形成量与血糖水平呈正相关，gsp在血中浓度稳定，半衰期为14-20天，血清中gsp的水平能有效反映过去2-3周内平均血糖水平，其不会受到临时血糖浓度波动的干扰。因此，联合测定空腹血糖和糖化血清蛋白在糖尿病检测中具有重要的意义，测定结果可以成为糖尿病病人的敏感性诊断标准。
胰岛素由胰岛β细胞分泌，是机体内唯一降低血糖的激素，同时也是唯一能促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。测定血清胰岛素是糖尿病诊断和分型的参考指标。
homa-ir是用于评价个体胰岛素抵抗水平的指标，本实验中胰岛素抵抗指数计算公式如下：
homair＝fpg×fins/22.5
fpg：空腹血糖值(mmol/l)；fins：空腹胰岛素水平(miu/l)。
四、口服糖耐量实验
口服葡萄糖耐量试验(ogtt)是一种葡萄糖负荷试验，指给成人口服75g无水葡萄糖，儿童按每公斤体重1.75g计算，总量不超过75g，然后测其血糖变化，观察病人耐受葡萄糖的能力，其目的是了解胰岛β细胞功能和机体对血糖的调节能力，是诊断糖尿病的金标准。
五、实验结果
1、束花石斛对血糖和体重的影响
在造模前，各大鼠的血糖平均值在(4.8±0.5)mmol/l，造模后各大鼠逐渐出现多食多饮、多尿、体重下降、毛色灰暗等症状，造模2周后大鼠血糖显著升高，模型较稳定，各给药组对大鼠空腹血糖和体重的实验结果如表1所示，给药8周后，束花石斛高剂量组大鼠血糖降低差异具有统计学意义，模型组大鼠血糖值有所升高。后期罗格列酮阳性组以及束花石斛给药组大鼠毛色和精神状态都有好转，运动量增加，多食、多饮、多尿的症状显著减轻，后期的体重也有所增加。
表1给药前后大鼠的血糖和体重(
给药前后比较：*p<0.05。
六、束花石斛对血脂四项的影响
sd大鼠造模成功之后出现了糖尿病常见的三多一少症状：多尿，多食，多饮，体重减轻。测得的大鼠血清中的血脂四项结果如下：从表2可知，与模型组相比，罗格列酮阳性组、束花石斛高剂量给药组及束花石斛低剂量给药组的高密度脂蛋白含量显著高于模型组(p<0.05)，同时也显著高于正常组(p<0.05)，具有统计学意义；正常组、罗格列酮阳性组、束花石斛高剂量给药组及束花石斛低剂量给药组的低密度脂蛋白含量显著低于模型组(p<0.05)；正常组、束花石斛高剂量组及束花石斛低剂量的甘油三酯含量均显著低于模型组(p<0.05)，模型组的甘油三酯水平显著高于正常组(p<0.05)；给药组和模型组的总胆固醇水平均高于正常组，尤其是模型组、阳性组和束花石斛低剂量组显著高于正常组(p<0.05)。
表2给药后大鼠的血脂四项(
与模型组比较：*p<0.05；与正常组比较：△p<0.05
七、血糖、糖化血清蛋白、胰岛素及胰岛素抵抗指数
测得的大鼠血清中的血糖、糖化血清蛋白及胰岛素水平结果如下：从表3可知，罗格列酮阳性组、束花石斛高剂量组和束花石斛低剂量组的血糖和糖化血清蛋白含量均明显低于模型组(p<0.05)，具有统计学意义。与正常组比较，所有组的的血糖水平都明显高于正常组(p<0.05)，但只有模型组的糖化血清蛋白明显高于正常组(p<0.05)；正常组和束花石斛低剂量组血清胰岛素含量明显高于模型组(p<0.05)，罗格列酮阳性组和束花石斛高剂量组的胰岛素水平也高于模型组，但不具有统计学意义。
模型组、罗格列酮阳性组、束花石斛高剂量组和束花石斛低剂量组的胰岛素抵抗指数均大于正常组(p<0.05)，但阳性药组、束花石斛高剂量组和束花石斛低剂量组的胰岛素抵抗指数均小于模型组，而且束花石斛高剂量组明显低于模型组，说明束花石斛可显著改善糖尿病大鼠的胰岛素抵抗。
表3给药后大鼠的血糖、糖化血清蛋白、胰岛素及胰岛素抵抗指数(
与模型组比较：*p<0.05；与正常组比较：△p<0.05
八、口服葡萄糖耐量试验(ogtt)
大鼠口服葡萄糖耐量试验结果如图1所示，由此可知，正常组大鼠在口服葡萄糖1h后，血糖值达最大，在3h时基本恢复至空腹血糖水平。模型组、阳性组、束花石斛高剂量组、束花石斛低剂量组大鼠在口服葡萄糖0.5h后，血糖值达最大，随后随着时间的推移，血糖值逐渐降低，但不能降至空腹水平。模型组大鼠的药时曲线下面积大于阳性组、束花石斛高剂量给药组、束花石斛低剂量给药组，说明药物干预能提高糖尿病大鼠对葡萄糖耐受能力。
上述实施例中，95％乙醇可以用丙酮、甲醇、水代替，并不会影响实验结果，本实施例中不再进行赘述。
实施例2
束花石斛降血糖有效部位的制备：将实施例1获得的总浸膏用2倍体积的水溶解，先后用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，分别得到四种萃取部位的浸膏；最后将各萃取部位的浸膏进行浓缩，分别蒸干，得到石油醚有效部位、三氯甲烷有效部位、乙酸乙酯有效部位以及正丁醇有效部位。
采用高浓度胰岛素诱导的胰岛素抵抗的肝癌细胞(hepg2)对各部位浸膏进行改善胰岛素抵抗活性测试，综合细胞葡萄糖消耗量和mtt筛选结果，表明三氯甲烷部位给药组hepg2细胞胰岛素敏感性显著改善，当加药浓度为2.0mg/ml时，葡萄糖消耗量达到模型组的4.424倍，为继续研究束花石斛三氯甲烷部位的降血糖活性成分提供了实验依据。
本实施例中，萃取溶剂石油醚还可以由环己烷和/或苯代替，三氯甲烷还可以由乙醚和/或四氢呋喃代替，正丁醇还可以由异丙醇代替。
实施例3
将实施例2中获得的三氯甲烷部分经过200-300目硅胶柱色谱，以硅胶作为吸附剂，石油醚-二氯甲烷，二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，每1000ml为一个流分，以石油醚：二氯甲烷＝100:1、20:1、10:1、8:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1和二氯甲烷11个梯度进行第一阶段洗脱，然后以二氯甲烷：甲醇＝100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、4:1、2:1及纯甲醇8个梯度进行第二阶段洗脱；二氯甲烷：甲醇＝50:1的流分经200-300目硅胶柱色谱，sephadexlh-20柱色谱及石油醚或乙酸乙酯重结晶分离纯化得到化合物异纽替皂苷元和26-o-纽替皂苷元葡萄糖苷。
化合物1：异纽替皂苷元；化合物2：26-o-纽替皂苷元葡萄糖苷的单体降血糖部位。
表4化合物1、2葡萄糖消耗量(x±s，n＝4)
与模型组比较：**p≤0.01*p≤0.05
表5化合物1、2mtt检测od值(x±s，n＝4)
由表4可知，异纽替皂苷元加药组葡萄糖消耗在药物浓度为3.125-12.5μmol·l-1时随浓度增加而逐渐增大，当浓度为12.5μmol·l-1时，异纽替皂苷元加药组葡萄糖消耗达到最大，为模型组的179.4％。随着加药浓度的继续增加，葡萄糖消耗量逐渐减小。在浓度为25μmol·l-1时，26-o-纽替皂苷元葡萄糖苷加药组的葡萄糖消耗达到最大，为模型组的186.5％。随着浓度增加，葡萄糖消耗量逐渐减少。由表5可知，当浓度为100μmol·l-1时，26-o-纽替皂苷元葡萄糖苷加药组的细胞存活量为模型组的55.1％，可见26-o-纽替皂苷元葡萄糖苷在高浓度时对hepg2细胞的活力影响较大。26-o-纽替皂苷元葡萄糖苷为变形螺甾烷型甾体皂苷，其苷元为异纽替皂苷元。
化合物2的活性优于化合物1，其结构上存在相似性，区别在于葡萄糖分子，可见与葡萄糖分子结合形成苷后，能促进细胞的葡萄糖消耗。
因此，本发明的束花石斛、束花石斛降血糖有效部位以及束花石斛降血糖有效成分可在降血糖方面得到应用，尤其是在制备降血糖的药物或者功能性食品方面的应用。
本发明首次发现石斛属中含有变形螺甾烷型甾体皂苷：26-o-纽替皂苷元葡萄糖苷及其作用，丰富了该属植物的成分类型和降血糖机理。