一种卵巢切除术导致的食蟹猴骨质疏松模型的构建方法与流程

本发明涉及生物医学研究技术领域，特别涉及一种卵巢切除术导致的食蟹猴骨质疏松模型的构建方法。

背景技术：

骨质疏松是一种骨量低下的疾病，易发生骨折，好发于老年人群及绝经期妇女。造成的原因是骨微观结构变细、变疏、骨盐及有机质同时减少，可能影响全身性骨骼出现多发性骨折。基本机制主要由骨形成即成骨细胞活性和骨吸收即破骨细胞活性的不平衡所致。骨质疏松症给患者生活带来极大不便和痛若，治疗收效很慢，一旦骨折又可危及生命。老年骨质疏松症时，椎体压缩变形，脊柱前屈，肌肉疲劳甚至痉挛，产生疼痛。疼痛患者中的70％～80％疼痛沿脊柱向两侧扩散，仰卧或坐位时疼痛减轻，直立时后伸或久立、久坐时疼痛加剧，弯腰、咳嗽、大便用力时加重。

故急需构建一种模拟绝经期妇女的生理情况，卵巢切除术导致的食蟹猴骨质疏松模型，为医学进一步研究绝经期妇女骨质疏松提供治疗过程中可靠数据。

技术实现要素：

鉴于以上问题，本发明提供了一种模拟绝经期妇女的生理情况，卵巢切除术导致的食蟹猴骨质疏松模型，为医学进一步研究绝经期妇女骨质疏松提供治疗过程中可靠数据。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种卵巢切除术导致的食蟹猴骨质疏松模型的构建方法，包括以下步骤：

a.术前给药及麻醉

选择各项检测指标在正常范围内的成年雌性食蟹猴进行实验。将12只食蟹猴随机分为2组，组间需要保证年龄、体重、腰椎骨矿物质含量(bmc)和骨密度(bmd)的均衡。第一组为双侧卵巢摘除手术组，第二组为假手术组(sham组)。术前每只动物分别肌注一定剂量的抗生素，50mg/kg头孢曲松钠，0.05mg/kg阿托品，5-10min后，对每只动物进行手术麻醉。

b.双侧卵巢切除术

动物麻醉后使用碘伏消毒皮肤，上至肋下，下至耻骨联合上，两侧至侧腹壁。医用手术铺巾铺在腹部，由布巾钳固定；在下腹中线作大约4cm左右的纵行切口，钝性分离皮下组织暴露腹正中线，在腹白线切开腹膜，钝性游离出一侧卵巢，提起卵巢，显露卵巢输卵管系膜、卵巢固有韧带，保持骨盆漏斗韧带呈伸展状态。沿卵巢基底部钳夹骨盆漏斗韧带血管、系膜及卵巢固有韧带，完整切除卵巢，交叉贯穿缝合残端。同样的方式切除另一侧卵巢；检查有无活动出血，无出血，连续缝合创面，关闭腹腔。假手术组：手术方式同双侧卵巢切除术，不切除卵巢，以切除卵巢周围部分脂肪替代。

c.术后护理

所有动物术后连续3天给予0.02mg/kg的镇痛剂丁丙诺啡，每日三次。所有动物手术结束后，连续3天给予50mg/kg的抗生素头孢曲松钠。麻醉恢复期动物允许自由的活动及完全负重，动物实验人员在麻醉恢复期须密切监控所有动物。

d.安乐死及取材

实验期结束后，将所有动物麻醉安乐死之后，l2腰椎于10％中性福尔马林保存用于骨组织形态计量学测定；椎骨l4取材后裹着纱布浸泡于生理盐水，覆盖着塑料薄膜，放在塑料袋中，储存在-20℃用于生物力学检测。

e.建模结果验证

动物采血，进行血清骨形成标记物、血清骨吸收标记物和血清骨吸收标记物的分析，进行dxa检测，hologicapex软件分析面积骨密度相关参数，骨组织形态计量学测定，定量组织形态学测定，生物力学测定及压缩试验。

所述步骤a中的动物麻醉方法为，肌注0.05ml舒泰预麻醉，1.5-3.0％异氟烷。

所述步骤e中的压缩试验采用压缩法，将l4椎体中心部位分别置于mts试验机上，加载速度为20mm/mim。

所述步骤e中的动物采血过程为，采4ml血到真空采血促凝管中并于室温放置1h，于4℃，2000-4000g，离心10min，收集血清。

本发明的优点和有益效果在于提供了一种模拟绝经期妇女的生理情况，卵巢切除术导致的食蟹猴骨质疏松模型，为医学进一步研究绝经期妇女骨质疏松提供治疗过程中可靠数据。并通过检测血清骨转换相关指标、骨密度测定、骨组织形态学计量学测定，显微ct测试，生物力学测定评价各组骨质量，验证该模型的可靠性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1压缩实验示意图。

图2骨体积与组织体积的比值。

图3骨小梁数目。

图4骨形成率。

图5破骨细胞贴壁长度百分比。

图6最大载荷。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例1.术前给药及麻醉

成年雌性食蟹猴，年龄9周岁以上，动物在接收后适应期观察14天后进行基础数据检测，选用身体健康、月经周期正常、骨骼无异常、骺板闭合和血清及尿液检测指标在正常范围内的动物进行实验。

将12只食蟹猴随机分为2组，如下表1所示，组内动物数量根据统计计算和参考其他长期去卵巢(ovx)食蟹猴骨质量研究的结果，组间需要保证年龄、体重、腰椎骨矿物质含量(bmc)和骨密度(bmd)的均衡。

第一组为双侧卵巢摘除手术组，第二组为假手术组(sham组)。术前每只动物分别肌注一定剂量的抗生素，50mg/kg头孢曲松钠，0.05mg/kg阿托品，5-10min后，对每只动物肌注0.05ml舒泰预麻醉，1.5-3.0％异氟烷用于维持手术中麻醉。

表1研究方案分组

实施例2.双侧卵巢切除术

动物麻醉后使用碘伏消毒皮肤，上至肋下，下至耻骨联合上，两侧至侧腹壁。医用手术铺巾铺在腹部，由布巾钳固定；在下腹中线作大约4cm左右的纵行切口，钝性分离皮下组织暴露腹正中线，在腹白线切开腹膜，钝性游离出一侧卵巢，提起卵巢，显露卵巢输卵管系膜、卵巢固有韧带，保持骨盆漏斗韧带呈伸展状态。沿卵巢基底部钳夹骨盆漏斗韧带血管、系膜及卵巢固有韧带，完整切除卵巢，交叉贯穿缝合残端。同样的方式切除另一侧卵巢；检查有无活动出血，无出血，连续缝合创面，关闭腹腔。

假手术：手术方式同双侧卵巢切除术，不切除卵巢，以切除卵巢周围部分脂肪替代。

实施例3.术后护理

所有动物术后连续3天给予0.02mg/kg的镇痛剂丁丙诺啡，每日三次；如果必要可以追加一次。所有动物手术结束后，连续3天给予50mg/kg的抗生素头孢曲松钠。

麻醉恢复期动物允许自由的活动及完全负重，动物实验人员在麻醉恢复期须密切监控所有动物。食物和水尽可能地放置到笼子里底层以确保动物手术后可以获得食物和水；刺激动物食欲术后给予一定量的水果和蔬菜。动物术后监测伤口愈合及整体精神状态每日两次，连续3日，记录任何不适，疼痛，四肢活动受限度和其他手术相关生命体征。任何用于动物术后镇痛剂剂量的调整须遵从兽医的建议，任何动物术后用上述剂量达不到镇痛效果的动物实验人员须及时与兽医及项目负责人沟通，获得建议后方可调整镇痛药剂量，并酌量增加水果提高食欲。

实施例4.安乐死及取材

实验期结束后，将所有动物麻醉安乐死之后，l2腰椎于10％中性福尔马林保存用于骨组织形态计量学测定；椎骨l4取材后裹着纱布浸泡于生理盐水，覆盖着塑料薄膜，放在塑料袋中，储存在-20℃用于生物力学检测。

实施例5.观察和次数

5.1骨转换生化标志物分析

采血4ml到真空采血促凝管中并于室温放置1h内，于4℃，2000-4000g，离心10min，收集血清，用于血清标志物测试。血清骨形成标记物[骨钙素及骨碱性磷酸酶(salp)]、血清骨吸收标记物[c终端端肽(ctx)和trap-5b]和血清骨吸收标记物[n端肽(ntx)]的分析将于适应期、手术前、取材前进行。实验结果如下表2所示。与假手术组相比，去卵巢后骨形成参数骨碱性磷酸酶与骨吸收参数c-中端端肽显著增大。

表2实验测得各标记物含量

#：与sham组相比，p<0.05：##：与sham组相比，p<0.01。

5.2骨密度(dxa)测量和x光平片

第1至4腰椎截段和右股骨进行dxa检测，hologicapex软件分析面积骨密度相关参数。实验结果如表3所示；与假手术组相比，去卵巢手术后腰椎骨密度显著性降低，骨量下降。x光平片在适应期(手术前)和治疗结束后进行。

表3骨密度变化

#：与sham组相比，p<0.05。

5.3骨组织形态计量学测定

治疗结束动物进行安乐死后采取并固定于10％中性福林中的骨样后以不脱钙的组织处理方式包埋在mma塑料块中备至成甲苯胺蓝染色的切片。切片由专业的形态计量学人员进行骨组织形态计量学评价。腰椎(l2)用于松质骨评价。具体方法见下：

1)骨组织：食蟹猴，腰椎l2；处理方式：未脱钙塑料块；切片厚度：4μm，8μm，50μm；染色：不染色和甲苯胺蓝染色。

腰椎(l2)保存于70％的乙醇中，后经过浓度梯度酒精脱水(80％，95％和100％)，二甲苯清洗。脱水的样本浸润和包埋于甲基丙烯酸甲酯。腰椎(l2)样本用旋转切片机切成4μm和8μm厚并染色。其中4μm厚片子，甲苯胺蓝染色，8μm厚的片子不染色，在亮光、偏振光和荧光显微镜下观察。腰椎和右股骨颈于椎体中间段横截面进行切片。

2)定量组织形态学测定

样本的测定(roi)部位分别为：腰椎椎体骨松质，在腰椎中间部位的3.5mm*2.8mm。结合表4与图2和3所示，得出结论，与假手术组相比，去卵巢手术未能显著改变腰椎的静态学参数；如表4和图4表明，骨形成参数(骨形成率)结果，去卵巢手术使骨形成显著增多；如表4和图5表明，骨吸收参数(破骨细胞贴壁长度百分比)结果表明，去卵巢手术后骨吸收增大。

表4松质骨组织形态学参数(腰椎)

#：与sham组相比，p<0.05。

5.4生物力学测定及压缩试验

骨组织l4，取材后，所有需测生物力学的骨标本将单独裹着纱布浸泡于生理盐水，覆盖着塑料薄膜，放在塑料袋中，储存在-20℃。dxa分析左股骨中段的骨质量相关参数。l4使用dxa测定骨质量相关参数。

使用压缩试验测定l4椎体中心部位的松质骨生物力学参数。测试时，将-20℃保存的l4椎体中心部位常温解冻，生理盐水复湿。用858minibionixⅱ型材料测试系统检测和分析l4椎体中心部位的生物力学性能。本次测试采用压缩法，将l4椎体中心部位分别置于mts试验机上，如图1所示，加载速度为20mm/mim，受力结果如表5和图6所示。l4压缩测试中，与假手术组相比，去卵巢手术使l4的最大载荷显著降低。

表5l4的最大载荷

#：与sham组相比，p<0.05；##：与sham组相比，p<0.01。

本实验建立了食蟹猴去卵巢后雌激素减少引起的骨质疏松模型。正常成人骨代谢处于低转换型骨重建而且整体骨吸收量大于骨形成。去卵巢后由于雌激素水平骤然下降，破骨细胞骨吸收活动加速，而成骨细胞数虽亦增加但功能并未提升，因此整体骨重建过程表现为负性高转换的骨丢失，造成骨密度下降及骨组织形态学及超微结构上的破坏，进而导致骨生物力学性能的下降导致骨折风险加大。通过检测血清骨转换相关指标、腰椎骨密度测定、松质骨骨组织形态学计量学测定及腰椎压缩测试评价各组骨质量，各参数表明去卵巢手术使骨吸收及骨形成参数均有增加，骨量及骨密度显著性降低，力学强度下降。综上所述，去卵巢手术后会引发破骨细胞所介导的负性高转换骨丢失效应，使骨量降低，骨强度下降，说明食蟹猴去卵巢手术能够稳定构建骨质疏松模型，作为科学研究及药物验证的基础。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。