鱼腥草总黄酮在制备防治病毒性肺炎的药物中的用途的制作方法

本发明属于中药领域，涉及中药鱼腥草总黄酮新的药物用途，具体涉及鱼腥草总黄酮在制备防治病毒性肺炎的药物中的用途。

背景技术：

现有技术报道了病毒性肺炎(viralpneumonia)是由多种病毒感染而引起的肺部炎症，通常是由上呼吸道病毒感染向下蔓延所致。研究显示，引起病毒性肺炎的病毒以流行性感冒病毒为常见，还包括副流感病毒，巨细胞病毒，腺病毒，鼻病毒，冠状病毒和某些肠道病毒等。甲型流感病毒是引起人和禽类呼吸道疾病的重要病原体。流感病毒侵入细支气管上皮引起细支气管炎，感染波及肺间质与肺泡而致肺炎。流感病毒一方面在呼吸道上皮细胞和血管内皮细胞内复制，损伤肺组织，破坏气体交换屏障；另一方面，通过巨噬细胞、分叶核中性粒细胞、淋巴细胞以及内皮细胞等释放大量细胞因子，宿主免疫机制被过度激活并失控，导致急性肺损伤(孙婉容，吴琦，邵世峰.国际呼吸杂志，2011,14:1094-1096)。有研究显示，在机体抗病毒感染免疫的过程中，早期起作用的是以巨噬细胞、干扰素和nk细胞为主的非特异性免疫，后期则是特异性的细胞免疫和体液免疫起作用。在流感病毒感染的过程中，单核/巨噬细胞活化产生多种细胞因子，它们以网络的形式在调节机体的免疫应答和炎症反应中起着重要作用(候佩莉，张茂林，李影，关振宏.动物医学进展，2010,10:108-112)。

研究表明，病毒性肺炎主要病理改变是肺泡水平的气体交换障碍，病毒感染后所致的急性肺损伤(acutelunginjury,ali)可引发患者出现呼吸窘迫和严重的低氧血症；单核细胞浸润、肺泡水肿是形成肺毛细血管通透性增高及肺水肿的病理基础，病毒感染诱发的肺损伤，临床表现为呼吸困难，严重的可以导致急性呼吸窘迫综合征，甚至死亡。

鱼腥草是我国的常用中药，临床应用较广泛。鱼腥草(herbahouttuyniae)为三白草科植物蕺菜属蕺菜(houttuyniacordatathunb.)的全草。味辛、性寒，具有清热解毒、消肿排脓、利尿通淋之功效，主要应用于肿痈化脓、痰热喘咳、热痢热淋、痈肿疮毒(《中国药典》一部，北京:中国医药科技出版社，2010)。药理学研究证明，鱼腥草具有解热、抗炎、抗菌、抗病毒、抗过敏及免疫增强等作用(杜向群,陈敏燕,许颖.江西中医药，2012,43(2):66-68)。文献报道，鱼腥草水提物和挥发油均具有显著抗单纯疱疹病毒活性(k.hayashi,m.kamiyaandt.hayashi.plantamedica.1995,61(3)：237-241；chianglc,changjs,chenccetal.americajournalofchinesemedicine,2003,31(3):355-362.)。鱼腥草水提物能够通过抑制sars病毒rna聚合酶活性和免疫调节能力缓解sars诱导的小鼠肺损伤(laukm,leekm,kooncmetal.journalofethnopharmacology,2008,118(1):79-85)。鱼腥草挥发油对流感病毒有抑制作用(zhangw,luf,pansetal.practicalpreventivemedicine.2008,15(2):312-316)。上述研究均未涉及鱼腥草总黄酮对病毒诱导急性肺损伤的防治作用。

纵观国内外的研究，均未见鱼腥草总黄酮治疗病毒性肺炎的药效及其药物研究的报道。

本申请的发明人拟提供中药鱼腥草总黄酮新的药物用途，尤其是鱼腥草总黄酮在制备防治病毒性肺炎的药物中的用途。

技术实现要素：

本发明的目的是提供鱼腥草总黄酮在防治病毒性肺炎中新的药物用途。

本发明从中药鱼腥草中分离提取得到总黄酮提取物，经整体动物模型试验证实其具有显著治疗病毒性肺炎的作用，尤其是鱼腥草总黄酮对病毒诱导的急性肺损伤小鼠具有治疗作用

本发明的鱼腥草总黄酮通过下述方法制备：

取鱼腥草药材，粉碎，以60％-90％乙醇提取，过滤，收集提取液并浓缩至小体积，将浓缩液滴加在ab-8大孔吸附树脂柱上层静置过夜，用2-4倍柱床体积的10％乙醇洗柱后再经4-6倍柱床体积的70％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，得鱼腥草总黄酮；采用亚硝酸钠-硝酸铝法测得鱼腥草总黄酮的黄酮含量超过75％；主要化学成分包括槲皮苷、金丝桃苷、异槲皮苷、芦丁等。

本发明的目的通过下述方法实现：

1.鱼腥草总黄酮用于治疗病毒诱导肺损伤试验：

1)肺指数

病毒感染第四天，动物称重，充分取血，解剖完整取下肺脏，将整个肺叶置于滤纸，待滤纸吸干表面水分后称重，以此为肺湿重；计算肺指数，肺指数＝肺湿重(mg)/体重(g)。

2)肺总蛋白测定

整个全肺留取用于病理切片的肺叶后，其余部分的肺叶盐水漂洗，用适量冰浴的pbs匀浆，肺匀浆液分装，100ul肺匀浆液使用ripa裂解法提取肺总蛋白，裂解液低温高速离心，收获上清分装，应用bca法检测蛋白含量。牛血清白蛋白作为标准蛋白溶液，制作标准曲线。bca工作液加入待测样品后，于自动酶标仪(epoch，bio-tek)a562nm处读取吸收度(a)值。

3)肺匀浆血凝效价测定

根据流感病毒上的血凝素ha能与鸡红细胞发生凝集反应的原理，来评价病毒毒力的强弱。取肺匀浆液，高速离心获得上清液，将等倍系列稀释的匀浆液与u型96孔板内1％鸡红血球混合，静置观察，记录鸡红细胞发生凝集的稀释度即该肺组织匀浆的血凝效价。

4)小鼠血清tnf-α测定

小鼠全血离心获得血清，分装，冻存。应用elisa法，将上清按tnf-α试剂盒说明书测定。

5)小鼠肺匀浆il-6、tnf-α测定

小鼠肺匀浆液，高速离心收获上清，分装，冻存。应用elisa法，将匀浆上清按il-6、tnf-α试剂盒说明书测定。

本发明实验结果显示，所述的鱼腥草总黄酮对流感病毒h1n1诱导的急性肺损伤有显著治疗作用；鱼腥草总黄酮可显著降低小鼠体重下降程度、肺指数(肺组织湿重/体重比值)和血凝素效价、减少肺内总蛋白含量、抑制全身和肺内细胞因子il-6、tnf-α的释放。

本发明所述的鱼腥草总黄酮能通过其抗炎作用来降低肺毛细血管通透性、减少淋巴细胞浸润及炎性蛋白的招募、抑制全身和肺部局部炎症反应，从而减轻病毒感染造成的炎性损伤。

本发明所述的鱼腥草总黄酮可进一步制备防治病毒性肺炎的药物。

附图说明

图1鱼腥草总黄酮对h1n1病毒感染鼠体重的影响。

图2鱼腥草总黄酮对h1n1病毒感染鼠肺指数的影响。

图3鱼腥草总黄酮对h1n1病毒感染鼠肺总蛋白的影响。

图4鱼腥草总黄酮对h1n1病毒感染鼠肺血凝滴度的影响。

图5鱼腥草总黄酮对h1n1病毒感染鼠血清tnf-α的作用。

图6鱼腥草总黄酮对h1n1病毒感染鼠肺匀浆il-6的作用。

图7鱼腥草总黄酮对h1n1病毒感染鼠肺匀浆tnf-α的作用。

图8鱼腥草总黄酮对病毒性肺炎小鼠肺部病理变化的影响。

具体实施方式

实施例1：制备鱼腥草总黄酮

取鱼腥草药材100g,粉碎，以60％-90％乙醇80℃水浴回流提取3次，过滤，收集提取液并浓缩至小体积，将浓缩液滴加在ab-8大孔吸附树脂柱上层静置过夜，用10％乙醇洗柱后再经70％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥成粉末，得鱼腥草总黄酮，产物收率达1.5％以上；采用亚硝酸钠-硝酸铝法测得鱼腥草总黄酮的黄酮含量超过75％。

表1是鱼腥草总黄酮收率及含量

实施例2：鱼腥草总黄酮体内药效评价

balb/c小鼠30只(15-16g)，按体重随机分为4组(a、b、c、d、e):a组为正常对照组，b组为h1n1病毒模型组，c组为鱼腥草总黄酮(100mg/kg)，d组为鱼腥草总黄酮(200mg/kg)，e为阳性药利巴韦林组，每组6只，所有组动物经丙泊酚尾静脉麻醉，滴鼻感染3ld50h1n1病毒液30ul，a组滴鼻感染1640培养液30ul作为对照；b、c、d、e组感染h1n1稀释液，c、d组感染后2小时灌胃给药鱼腥草总黄酮，剂量为100mg/kg、200mg/kg；a组与b组给予0.5％cmc灌胃给药，作为正常和病毒对照；e组给予阳性药利巴韦林，剂量为100mg/kg，一天给药一次，连续给药四天并记录小鼠每日体重，h1n1病毒攻击96h后，称量体重，摘眼球取血。小心剪下全肺，滤纸沾干血迹，称重记录；小心剪下左肺置于10％福尔马林中，用于小鼠肺组织病理评价；右肺用生理盐水漂洗干净，置于-80℃冰箱保存，冻存的肺组织之后使用预冷的pbs，用匀浆器在冰浴中匀浆，收获匀浆液，离心，收集上清，分装，-80℃保存，用于检测肺总蛋白，肺匀浆血凝效价，肺炎性因子等指标；

体重变化是评价药物对病毒性肺炎小鼠有无保护作用的一个宏观指标，将小鼠每天体重除以感染当天体重即得体重变化率，以小鼠每天的体重变化率绘制体重变化曲线，结果显示，模型组小鼠体重下降幅度最大，鱼腥草总黄酮100mg/kg给药组和200mg/kg给药组小鼠体重变化趋势相近，下降幅度均显著低于模型组(如图1所示)；

肺指数是小鼠的肺重与体重的比值，其值越大说明肺病变程度越严重。与正常组相比，模型组小鼠肺指数明显升高；给予药物后，鱼腥草总黄酮100mg/kg组小鼠肺指数有下降趋势，鱼腥草总黄酮200mg/kg组小鼠肺指数显著降低(p<0.05)(如图2所示)；

肺部蛋白含量是衡量小鼠肺毛细血管通透性增高的重要指标，是肺部炎症细胞募集和肺水肿的重要标志。结果显示，鱼腥草总黄酮200mg/kg可显著抑制小鼠肺总蛋白水平的升高(p<0.01)，抑制病毒诱导后肺部对炎性蛋白的募集(如图3所示)；

流感病毒的血凝素(ha)在病毒感染宿主细胞的过程中扮演了重要角色，根据流感病毒上的血凝素ha能与鸡红细胞发生凝集反应的原理，来评价肺内病毒滴度。实验结果显示，与模型组相比，100mg/kg和200mg/kg鱼腥草总黄酮可显著抑制病毒感染鼠肺中血凝素的效价升高(p<0.001)，即能有效抑制病毒在鼠肺中的复制(如图4所示)；

对血清和肺匀浆中炎症因子的测定结果显示，与正常组相比，模型组小鼠血清tnf-α、肺匀浆il-6、tnf-α水平显著升高；给予药物后，100mg/kg和200mg/kg鱼腥草总黄酮可显著抑制小鼠血清中炎症因子tnf-α的分泌(p<0.05,p<0.001)及肺匀浆中促炎因子il-6、tnf-α水平的升高(p<0.05，p<0.001)(如图5-7所示)；

病理检查结果表明，正常组肺泡轮廓清晰，结构完整，无渗血现象，基本无炎症；模型组病理切片显示肺泡壁明显增厚，肺泡萎缩变形，大量白细胞聚集，炎症严重。鱼腥草总黄酮给药组，尤其是鱼腥草总黄酮200mg/kg给药组肺泡轮廓清晰，结构较完整，无严重出血现象，炎症症状显著减轻。

综上所述，鱼腥草总黄酮对流感病毒h1n1诱导的小鼠病毒性肺炎有显著治疗作用；鱼腥草总黄酮可显著降低小鼠体重下降程度、肺指数、肺内血凝素效价、减少肺内总蛋白含量、抑制全身和肺内细胞因子il-6、tnf-α的释放，从而降低肺毛细血管通透性、减少淋巴细胞浸润及炎性蛋白的招募、抑制全身和肺部局部炎症反应，减轻病毒感染造成的炎性损伤。

本发明所述的鱼腥草总黄酮可进一步制备防治病毒性肺炎的药物。