一种二妙散对类风湿关节炎抑炎因子表达试验方法与流程

本发明涉及医疗技术领域，特别涉及一种二妙散对类风湿关节炎抑炎因子表达试验方法。

背景技术：

二妙散源自《丹溪心法》，由苍术和黄柏等比配伍而成，黄柏苦寒清热，苍术苦温燥湿，为祛湿剂，是中医治疗ra的经典基本方。目前文献报道二妙散的研究主要集中在单味药的含量测定及药效，以及二妙散方剂对关节组织和血清炎症因子的作用。chen等证实二妙散有免疫抑制作用，其中黄柏为主要抑制药，而小檗碱为其主要免疫抑制成分，对免疫系统的多个环节均有较强的免疫抑制作用。用弗氏完全佐剂诱导的大鼠关节炎模型，发现二妙散和灵芝制剂在关节炎大鼠膝盖中具有止痛和抗炎作用，但没有进一步研究二妙散的抗炎作用机制。研究人员将二妙散作用于迟发型肝损伤小鼠超敏反应诱导期，结果显示抗血清转氨酶水平显著升高、组织病理学特性改变，表明二妙散具有免疫调节功能。

高度细胞类型依赖性α7烟碱乙酰胆碱受体(α7nachrs)表达在异源表达系统中。α7nachr失衡可能参与不同的疾病，如精神分裂症、阿尔茨海默病，以及炎症和免疫功能的调节高度相关。有报道显示，巨噬细胞等诸多免疫细胞上均表达α7nachr，并通过基因敲除小鼠实验证实了α7nachr在胆碱能抗炎通路中处于核心地位。α7nachr是调节细胞信号传导的重要因子，其在许多不同的非神经元细胞如血管和脑内皮细胞、支气管上皮细胞、角质形成细胞、星形胶质细胞、滑膜细胞、胸腺细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、单核细胞、巨噬细胞和小胶质细胞均有不同程度的表达。小胶质细胞上的α7nachr激活也可抑制促炎因子如肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactorα，tnf-α)的产生。

chrna7是编码α7nachr蛋白(uniprotidp36544)的关键基因，是配体门控离子通道超家族的成员，其促进突触处的快速信号传递，其异五聚体由同源亚基组成。chrna7编码的蛋白质形成同源寡聚体通道，对钙离子具有显著渗透性。研究表明，chrna7基因主要表达在小鼠杏仁核后部杏仁核和ca3区域，以及人类乳头体中。chrna7与chrna基因家族与参与神经疾病的jak2、akt1和pick1存在基因互作，表明chrna7在神经元发育阶段的细胞中受神经疾病调节。

现有的对于类风湿关节炎的治疗，还在研究实验阶段，目前没有较好实验方法证明二妙散对于减少炎症因子和增加抑炎因子的表达有作用。缺乏二妙散治疗类风湿关节炎的药理机制的科学依据。

技术实现要素：

发明的目的在于提供一种二妙散对类风湿关节炎抑炎因子表达试验方法，本发明为探究二妙散治疗类风湿关节炎的药理机制提供科学依据，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种二妙散对类风湿关节炎抑炎因子表达试验方法，试验材料包括80只sd大鼠、生理盐水、三种剂量的二妙散水煎剂、甲氨蝶呤，试验方法包括如下步骤：

s1：试验动物的处理

选择80只sd大鼠，将所有cia模型大鼠随机分为6组，每组12-15只；灌胃生理盐水，为正常对照组和模型对照组，灌胃三种剂量的二妙散水煎剂，灌胃甲氨蝶呤2.7mg/(kg·周)，为阳性对照组，每次灌胃1ml/100g，连续灌胃15天，禁食，麻醉，杀检，腹主动脉取血，同时将脾脏、关节取材备用；

s2：建立cia大鼠模型；

s3：脾脏系数指标检测

按照编号将大鼠体重与脾脏称重记录，通过计算公式脾脏系数＝脾脏重/体重得出结果，应用spss20.0软件分析结果；

s4：血清中il-6和tnf-α水平检测

检测血流变、血细胞检测及血浆中肿瘤坏死因子、白介素6水平的变化，依照试剂盒操作程序进行检测；

s5：关节滑膜切片病理检测观察

大鼠关节取材，edta脱钙，脱钙完成后纵向剖开踝关节，石蜡包埋，切片，he染色，观测各组炎症的变化；

s6：吞噬细胞中il-6、il-37、tnf-α、chrna7mrna的表达检测水平检测；

提取大鼠成纤维样滑膜细胞总rna，测定总rna浓度，在pcr仪中反转录为cdna，以cdna为模板，在rt-pcr仪中与α7nachr引物进行扩增，得到ct值，以gapdh作参照，二妙散含药组成分组与空白组之间进行比较，得到2^-δδct即为关节滑膜腔中α7nachr的mrna变化；

s7：数据分析

通过spss20.0软件分析，数据以均值xs表示，组间比较采用anova分析和lsd-t检验，p＜0.05为差异显著，p＜0.01为差异极显著。

进一步地，步骤s1中的sd大鼠的体重为180±15g。

进一步地，步骤s1中二妙散水煎剂由黄柏与苍术1∶1制备。

进一步地，步骤s1中二妙散水煎剂0.12g/kg、0.24g/kg、0.36g/kg为小中大剂量组。

进一步地，步骤s2包括如下步骤：

s2-1：初次免疫

通过牛二型胶原与弗氏完全佐剂乳化后浓度为1mg/ml，注射sd大鼠背部三点、尾跟部及任意一后足掌注射共0.5ml，正常组注射等量的生理盐水；

s2-2：加强免疫

2周后，给予实验组腹腔皮内注射含有牛二胶原1mg/ml的免疫复合物乳化液0.2ml/鼠，方法同上正常组皮内注射等量生理盐水；

s2-3：成模检验

根据传统关节评分指标对实验sd大鼠进行筛选。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提出的二妙散对类风湿关节炎抑炎因子表达试验方法，本试验建立sd大鼠胶原诱导关节炎模型，灌胃经典方药二妙散水煎剂黄柏与苍术1∶1，取血，杀检，观察脾脏系数改变、关节滑膜切片病理改变；检测血清il-6、tnf-α水平的变化、吞噬细胞及il-6、tnf-α水平的变化、及胆碱抗炎通路关键受体α7nachr的表达等指标探讨ra治疗机理，dg组与mg组相比，脾脏指数差异不显著(p＞0.05)；mg组与ng组相较，脾脏指数显著降低(p＜0.05)。二妙散组关节腔滑膜组织成绒毛状，伸向关节腔内，炎性细胞较少。随着二妙散药物浓度的升高，炎症因子il-6和tnf-α显著降低(p＜0.05，p＜0.01)；抑炎因子il-37随二妙散浓度的增加，显著增加(p＜0.05，p＜0.01)；chrna7mrna的表达不同程度增加，20.0mg/ml二妙散作用下，chrna7mrna表达量极显著增加(p＜0.01)。二妙散具有减缓膜组织增生和减少炎性细胞数量的重要作用。其最佳作用浓度为20mg/ml。二妙散对chrna7具有调控作用，为探究二妙散治疗类风湿关节炎的药理机制提供科学依据。

附图说明

图1为本发明的二妙散对cia大鼠脾脏系数的影响结果图；

图2为本发明的不同药物作用下脾脏病理检测结果图；

图3为本发明的二妙散对cia大鼠血液中il-6表达的影响结果图；

图4为本发明的二妙散对cia大鼠血液中tnf-α表达的影响结果图；

图5为本发明的不同浓度二妙散对巨噬细胞中il-6的影响结果图；

图6为本发明的不同浓度二妙散对巨噬细胞中il-37的影响结果图；

图7为本发明的不同浓度二妙散对巨噬细胞中tnf-α的影响结果图；

图8为本发明的不同浓度二妙散作用下chrna7mrna的表达影响结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种二妙散对类风湿关节炎抑炎因子表达试验方法，试验材料包括80只sd大鼠、生理盐水、三种剂量的二妙散水煎剂、甲氨蝶呤，试验方法包括如下步骤：

步骤1：试验动物的处理

采用80只sd大鼠建立cia模型，体重(180±15)g，由军事医学科学院实验动物中心提供；依据成模检验标准，将所有cia模型大鼠随机分为6组，每组12-15只；灌胃生理盐水，为正常对照组和模型对照组，灌胃二妙散水煎剂0.12g/kg，0.24g/kg，0.36g/kg为小中大剂量组，灌胃甲氨蝶呤2.7mg/(kg·周)，为阳性对照组，每次灌胃1ml/100g，连续灌胃15天，禁食，麻醉，杀检，腹主动脉取血，同时将脾脏、关节取材备用；

步骤2：建立cia大鼠模型；

1)初次免疫

通过牛二型胶原与弗氏完全佐剂乳化后浓度为1mg/ml，注射sd大鼠背部三点、尾跟部及任意一后足掌注射共0.5ml，正常组注射等量的生理盐水。

2)初次免疫加强免疫

2周后，给予实验组腹腔皮内注射含有牛二胶原1mg/ml的免疫复合物乳化液0.2ml/鼠，方法基本同上正常组皮内注射等量生理盐水。

3)初次免疫成模检验

根据传统关节评分指标对实验sd大鼠进行筛选。

步骤3：脾脏系数指标检测

按照编号将大鼠体重与脾脏称重记录，通过计算公式脾脏系数＝脾脏重/体重得出结果，应用spss20.0软件分析结果；

步骤4：血清中il-6和tnf-α水平检测

检测血流变、血细胞检测及血浆中肿瘤坏死因子、白介素6水平的变化，依照试剂盒操作程序进行检测；

步骤5：关节滑膜切片病理检测观察

大鼠关节取材，edta脱钙，脱钙完成后纵向剖开踝关节，石蜡包埋，切片，he染色，观测各组炎症的变化；

步骤6：吞噬细胞中il-6、il-37、tnf-α、chrna7mrna的表达检测水平检测；

提取大鼠成纤维样滑膜细胞总rna，测定总rna浓度，在pcr仪中反转录为cdna，以cdna为模板，在rt-pcr仪中与α7nachr引物进行扩增，得到ct值，以gapdh作参照，二妙散含药组成分组与空白组之间进行比较，得到2^-δδct即为关节滑膜腔中α7nachr的mrna变化；

步骤7：数据分析

通过spss20.0软件分析，数据以均值xs表示，组间比较采用anova分析和lsd-t检验，p＜0.05为差异显著，p＜0.01为差异极显著。

试验后进行结果分析

1.二妙散对脾脏系数的影响

二妙散治疗组(给药组，dg)与模型组(mg)相比，脾脏指数差异不显著(p＞0.05)；mg组与正常组(ng)相较，脾脏指数显著降低(p＜0.05)，甲氨蝶呤组(阳性对照组，pcg)与dg组比较差异不显著(p＞0.05)(图1)。初步表明二妙散对增强大鼠机体免疫功能具有促进作用。

2.不同药物作用下脾脏病理检测

he检测结果显示，正常组关节腔滑膜结构清晰，表面覆有薄层滑膜细胞(图2a)；模型组关节腔滑膜组织增生，呈粗指状突向关节腔内，并伴有大量炎性细胞浸润(图2b)；二妙散组关节腔滑膜组织成绒毛状，伸向关节腔内，炎性细胞较少(图2c)；阳性对照组关节腔滑膜组织成绒毛状，伸向关节腔内，炎性细胞较少(图2d)。证实二妙散具有减缓膜组织增生和减少炎性细胞数量的重要作用。图2中a：ng组脾脏；b：mg组脾脏；c：dg组脾脏；d：pcg组脾脏(he×100)。

3.血清炎症因子il-6和tnf-α的检测

检测炎症因子il-6和tnf-α的表达显示，二妙散组较正常组il-6表达量极显著降低(p＜0.01)，较模型组显著降低(p＜0.05)(图3)；二妙散组较正常组和模型组，tnf-α表达量显著降低(p＜0.05)(图4)。进一步说明二妙散对于抑炎因子的表达具有重要作用。

4.不同浓度二妙散对il-6、il-37和tnf-α表达的影响

分别用浓度(mg/ml)为0.5、1.0、4.0、6.0二妙散作用于cia大鼠，结果显示如图5-7，随着二妙散药物浓度的升高，炎症因子il-6和tnf-α显著降低(p＜0.05，p＜0.01)；抑炎因子il-37随二妙散浓度的增加，显著增加(p＜0.05，p＜0.01)。再次证实二妙散对于减少炎症因子和增加抑炎因子的表达具有重要作用。

5.不同浓度二妙散对chrna7mrna表达的影响

分别用浓度(mg/ml)为0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、20.0、30.0、50.0二妙散作用于cia大鼠，检测chrna7mrna水平表达。结果如图8所示，随着药物浓度的增加，chrna7mrna的表达不同程度的增加，20.0mg/ml二妙散作用下，chrna7mrna表达量极显著增加(p＜0.01)，说明二妙散的最佳作用浓度为20mg/ml。说明二妙散对类风湿性关节炎调控基因chrna7具有调控作用。

通过以上的结果分析可以得出结论，二妙散的二妙散具有减缓膜组织增生和减少炎性细胞数量的重要作用。其最佳作用浓度为20mg/ml。二妙散对类风湿性关节炎调控基因chrna7具有调控作用，为二妙散治疗类风湿关节炎的分子机制提供科学依据。

综上所述，本发明提出的二妙散对类风湿关节炎抑炎因子表达试验方法，本试验建立sd大鼠胶原诱导关节炎模型，灌胃经典方药二妙散水煎剂黄柏与苍术1∶1，取血，杀检，观察脾脏系数改变、关节滑膜切片病理改变；检测血清il-6、tnf-α水平的变化、吞噬细胞及il-6、tnf-α水平的变化、及胆碱抗炎通路关键受体α7nachr的表达等指标探讨ra治疗机理，dg组与mg组相比，脾脏指数差异不显著(p＞0.05)；mg组与ng组相较，脾脏指数显著降低(p＜0.05)。二妙散组关节腔滑膜组织成绒毛状，伸向关节腔内，炎性细胞较少。随着二妙散药物浓度的升高，炎症因子il-6和tnf-α显著降低(p＜0.05，p＜0.01)；抑炎因子il-37随二妙散浓度的增加，显著增加(p＜0.05，p＜0.01)；chrna7mrna的表达不同程度增加，20.0mg/ml二妙散作用下，chrna7mrna表达量极显著增加(p＜0.01)。二妙散具有减缓膜组织增生和减少炎性细胞数量的重要作用。其最佳作用浓度为20mg/ml。二妙散对chrna7具有调控作用，为探究二妙散治疗类风湿关节炎的药理机制提供科学依据。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。