一种酵母活细胞面膜及其制备方法和使用方法与流程

本发明涉及护肤品领域，尤其涉及一种酵母活细胞面膜及其制备方法和使用方法。

背景技术：

近些年，人们对于护肤的需求日益旺盛，护肤品的销售额逐年稳步增长。在众多护肤品中，日本宝洁旗下生产的skii系列倍受大家青睐。skii的主要成分是pitera，它由一种覆膜胞菌属(saccharomycopsis)的酵母在低氧环境中的培养发酵物所提炼出的代谢液，其主要成分包括维他命、氨基酸、矿物质和有机酸等。然而，由于skii系列售价高昂，普通家庭难以日常使用。因此，急需一种低成本、效果佳的面膜，给需要护肤的广大人群带来福音。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种护肤效果佳，且成本降低的面膜，具体是一种酵母活细胞面膜，其包含絮凝酿酒酵母活细胞。

进一步地，絮凝酿酒酵母包括酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)spsc01、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)6525flo1和酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)4126flo1中的一种或者多种。

酿酒酵母spsc01为栗酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombelindner2.1461)和酿酒酵母(sacchadromycescerevisiae2.607)的融合株，于2001年5月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc，中国，北京)，登录号为cgmcc0587(见专利cn1436851a)。可以在菌种保藏中心cgmcc中找到。文献出处：xutj,zhaoxq,baifw.continuousethanolproductionusingself-flocculatingyeastinacascadeoffermentors.enzymemicrobtech2005；37:634–40.

酿酒酵母6525flo1是采用基因工程的手段将flo-spsc基因导入酿酒酵母6525(atcc编号4006525)获得的。具体构建方法见下述文献的方法部分：hely,zhaoxq,baifw.engineeringindustrialsaccharomycescerevisiae,strainwiththeflo1-derivativegeneisolatedfromtheflocculatingyeastspsc01forconstitutiveflocculationandfuelethanolproduction[j].appliedenergy,2012,100(4):33-40。

酿酒酵母4126flo1是采用基因工程的手段将flo-spsc基因导入酿酒酵母4126(atcc编号4004126)获得的具体构建方法见下述文献的方法部分：liq,zhaoxq,changak,etal.ethanol-inducedyeastflocculationdirectedbythepromoteroftps1encodingtrehalose-6-phosphatesynthase1forefficientethanolproduction[j].metabolicengineering,2012,14(1):1–8。

进一步地，面膜包括面膜纸、泥面膜和细胞干粉中的一种或多种形式。

进一步地，絮凝酿酒酵母相比于游离酿酒酵母，其表面更粗糙，比表面积更大。

进一步地，絮凝酿酒酵母其对于重金属离子的吸附能力显著强于游离酿酒酵母；重金属离子包括铬离子、铅离子和镉离子中的一种或者多种。

本发明还公开了一种如所述上的酵母活细胞面膜的制备方法，当面膜的形式是面膜纸时，包括以下步骤：

步骤一、絮凝酿酒酵母的活化：取絮凝酿酒酵母冻存液接种到种子培养液中进行活化；

步骤二、絮凝酿酒酵母的培养：当活化的絮凝酿酒酵母细胞生长达到中后期时，转接活化的种子培养液至改良的发酵培养液中培养；

步骤三、絮凝酿酒酵母的收集：当培养的絮凝酿酒酵母细胞达到生长中期时，收集发酵罐下层的絮凝酿酒酵母细胞，将其覆盖在模拟脸部形状的载体上，制成面膜纸形式的面膜。

进一步地，当面膜的形式是泥面膜时，包括以下步骤：

步骤一、絮凝酿酒酵母的活化：取絮凝酿酒酵母冻存液接种到种子培养液中进行活化；

步骤二、絮凝酿酒酵母的培养：当活化的絮凝酿酒酵母细胞生长达到中后期时，转接活化的种子培养液至改良的发酵培养液中培养；

步骤三、絮凝酿酒酵母的收集：当培养的絮凝酿酒酵母细胞达到生长中期时，收集发酵罐下层的絮凝酿酒酵母细胞，得到泥面膜形式的面膜。

进一步地，当面膜的形式是细胞干粉时，包括以下步骤：

步骤一、絮凝酿酒酵母的活化：取絮凝酿酒酵母冻存液接种到种子培养液中进行活化；

步骤二、絮凝酿酒酵母的培养：当活化的絮凝酿酒酵母细胞生长达到中后期时，转接活化的种子培养液至发酵培养液中培养；

步骤三、絮凝酿酒酵母的收集：当培养的絮凝酿酒酵母细胞达到生长中期时，收集发酵罐下层的絮凝酿酒酵母细胞，冷冻干燥得到细胞干粉形式的面膜。

进一步地，种子培养液是ypd种子培养液，其配方是1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖。

进一步地，发酵培养液与种子培养液的成分及配比相同。

进一步地，改良的发酵培养液是改良的ypd发酵培养液，其配方是在ypd种子培养液的基础上额外添加芳香族氨基酸、维生素和/或甘露糖。芳香族氨基酸能够增加该面膜的香味；维生素能够增强面膜的抗氧化能力；甘露糖具有增强面膜粘附能力的作用。添加的量为毫克级到克级。

进一步地，通过加入edta水解液进行解絮后测量培养液中酵母的od600值，当其达到2.0±0.1时说明絮凝酿酒酵母达到生长中期。edta去除溶液中ga²⁺，使得絮凝蛋白不能绑定细胞表面甘露糖残基，絮凝现象消失。

当面膜的形式是细胞干粉时，本发明还公开了一种如上所述的酵母活细胞面膜的使用方法，将细胞干粉与改良的发酵培养液以质量比1：20-50搅拌均匀，于20-30℃下放置培养1-4h后，收集絮凝酿酒酵母细胞制成泥面膜进行使用。

从另一角度来说，本发明公开了一种菌株在制备面膜方面的应用，其特征在于，所述菌株为能发生絮凝的酿酒酵母。

进一步地，所述菌株选自酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)spsc01、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)6525flo1和酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)4126flo1中的一种或者多种。

进一步地，所述面膜的有效成分是所述菌株的活细胞。

有益效果有：

1、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)spsc01、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)6525flo1和酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)4126flo1能够自发絮凝，细胞收集过程耗能低，环境友好。这三株菌是目前构建出的能够用于工业生产的絮凝酿酒酵母，优势在于菌株的絮凝特性稳定，能够用于工业生产，获取大量的酵母细胞。

2、絮凝酿酒酵母的表面粗糙，与游离酿酒酵母细胞相比有更大的比表面积，从而使得表面羟基团越多，表面能也越高。因而与游离酿酒酵母细胞相比，絮凝酿酒酵母细胞的表面产生更高的热力学反应潜力，更有利于酵母细胞黏附其他的物质，可以增大使用时吸收化妆品残留的功能。

3、本发明使用活性酵母细胞而非细胞提取液，在降低提取有效物质过程成本的同时，消除提纯过程可能引入的有毒有害提取液的潜在威胁。

4、絮凝酿酒酵母细胞表面富含羟基、醛基等还原性基团，能够结合并还原皮肤表面上高价态的重金属离子，起到吸附和降解的双重功效。

5、由絮凝酿酒酵母细胞制成的面膜纸、泥面膜，使得细胞富集，从而使絮凝酿酒酵母细胞的清洁、保湿、抑菌等作用增强；

6、将细胞干粉与改良的培养基按一定比例混合培养约2h后达到生长中期，使得在使用时细胞的活性能更好的发挥。而平时保持干粉形态，有利于保存更长时间。

7、利用活细胞在指数生长中期快速生长的过程中持续高效产生的还原力，以帮助皮肤细胞对抗活性氧自由基带来的氧化损伤，减缓皮肤细胞衰老。

8、改良的ypd发酵培养基，具有无菌、随取随用的特点。

直接利用酵母细胞制作面膜来使用，不仅可以大大降低提取过程的成本，而且能够借助酵母本身的粘附特性，更好地去除皮肤表面的化学品残留，达到更好的护肤效果。综上，利用活性酵母细胞制作的低成本面膜能够有效降低成本，给需要护肤的广大人群带来福音。本发明中酵母细胞的抗氧化能力、抑菌能力和重金属离子去除能力有实验数据进行证明。

附图说明

图1是本发明所涉及的酵母活细胞面膜的制备及使用工艺流程图。

图2是絮凝酿酒酵母spsc01的扫描电镜拍摄图。

图3是游离酿酒酵母by4741的扫描电镜拍摄图。

图4是酵母细胞对氧化还原电位(oxidation-reductionpotential，orp值)的影响曲线图。

图5是铬离子浓度随时间的变化曲线。

图6是铅离子浓度随时间的变化曲线。

图7是镉离子浓度随时间的变化曲线。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的描述。

图1示出了，本发明所涉及的面膜的制备及使用过程。絮凝酿酒酵母通过发酵罐进行工厂生产，发酵罐的罐体上设置有挡板、通气和搅拌桨。发酵好的絮凝酿酒酵母可以制备成三种形式的面膜，分别是面膜纸形式、泥面膜形式和细胞干粉形式。当细胞经过沉降，并与载体压合、切割载体为模拟脸部的形状，则得到面膜纸形式的面膜；当细胞经过沉降，可制成泥面膜形式的面膜；当细胞制成干粉后，需要通过活化才能使用。具体通过实施例1-3来详细说明。

实施例1、面膜纸形式的面膜的制备

从-80℃冰箱中挑取絮凝酿酒酵母冻存液，接种到ypd种子培养液(1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖，121℃灭菌20min)中进行活化；

当酵母细胞生长达到中后期时，1％转接活化的种子培养液至改良的ypd发酵培养液中(在ypd种子培养液中额外添加芳香族氨基酸、维生素、甘露糖，并灭菌，其中维生素采用过滤方式除菌)培养；

在酵母细胞达到生长中期(换用edta水解液解絮后测得的od600值约为2.0)时收集发酵罐下层的絮凝酿酒酵母细胞；

收集酵母细胞并将其用模拟脸部形状的载体制成面膜。

实施例2、泥面膜形式的面膜的制备

与上述实例基本相同，只是将收集的酵母细胞制成泥面膜而非面膜纸使用。

实施例3、细胞干粉形式的面膜的制备和使用方法

从-80℃冰箱中挑取絮凝酿酒酵母冻存液，接种到ypd种子培养液(1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖，121℃灭菌20min)中进行活化；

当酵母细胞生长达到中后期时，1％转接活化的种子培养液至ypd发酵培养液(1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖，121℃灭菌20min)中培养；

在酵母细胞达到生长中期(换用edta水解液解絮后测得的od600值约为2.0)时收集发酵罐下层的絮凝酿酒酵母细胞，使用冻干机将酵母制成干粉；

将絮凝酿酒酵母细胞干粉与改良的ypd干粉(额外添加芳香族氨基酸、维生素、甘露糖等物质，无菌处理)以质量比1：20至1：50搅拌均匀，于室温(20-30℃)下放置2h；收集酵母细胞制成泥面膜使用。

实施例4、面膜所含的絮凝酿酒酵母细胞性能检测

如图2和3所示，与游离酿酒酵母by4741(201388d-5^tm)相比，絮凝酿酒酵母的表面粗糙，有较多的凸起和凹渠，长径(10.69±0.15)μm，短径(5.26±0.26)μm，黏附在基质上，结合比较稳固，且有芽体附着在表面。游离型酵母细胞表面光滑，长径(8.97±0.23)，短径(5.78±0.21)，表面同样也有芽体。两者比较可以发现，絮凝酿酒酵母的表面粗糙程度远远大于游离型酵母，而粗糙的表面会影响到接触表面的比表面积比值以及与之相关的特性，如强度，密度，湿润度，孔隙率以及透气性和浸透性等。在与蛋白质作用时，粗糙的形貌可以暴露更多的表面积区域。而理论上，表面越粗糙，比表面积越大，表面羟基团越多，表面能也越高，因而可以与游离酿酒酵母细胞相比，絮凝酿酒酵母细胞的表面产生更高的热力学反应潜力，更有利于酵母细胞黏附其他的物质，可以增大使用时吸收化妆品残留的功能。

此外，活性酵母细胞对于活性氧的代谢能力(以orp值代表，图4)、对皮肤表面有害微生物(以大肠杆菌为代表，表1、2)的抑制效果和对重金属的吸附能力(以铬离子、铅离子和镉离子为代表，图5-7)已经有实验证明。

如图4所示，向三瓶ypd培养基中分别加入等量的10ml絮凝酿酒酵母培养液、游离酿酒酵母培养液(阴性对照)和无菌水(印象对照)，调整初始orp为305±5mv，之后每隔1.5h测定一次培养液的orp值。由图可知，相较于无菌水，酵母的存在可以有效提供还原力，降低orp值；且与游离酿酒酵母相比，絮凝酿酒酵母降低orp的能力更为稳定。

表1.酵母抑制大肠杆菌生长体系设定

表2.酵母对大肠杆菌生长抑制结果

如图5-7所示，酵母细胞对于重金属有一定的吸附能力，而且，絮凝酿酒酵母对于重金属离子的吸附能力显著强于游离酿酒酵母(p<0.05)，在28h时对铬离子、铅离子和镉离子的吸附率分别达到了71.1％、83.7％和85.3％，这进一步印证了对于酵母细胞扫面电镜观测结果的猜想，即相对于游离酿酒酵母而言，絮凝酿酒酵母较大的比表面积更易结合化学品残留，达到清洁皮肤的目的。

实施例4中所用的絮凝酿酒酵母均为酿酒酵母spsc01，即以酿酒酵母spsc01为例对絮凝酿酒酵母的形态特征与性能进行说明。酿酒酵母6525flo1和酿酒酵母4126flo1的电镜图片与图2相似，也是表面粗糙程度远远大于游离型酵母，其性能也与酿酒酵母spsc01类似。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。