色瑞替尼在制备肿瘤化疗药物增敏剂中的应用及抗肿瘤药物组合物的制作方法

本发明涉及医药学领域，特别是涉及色瑞替尼在制备肿瘤化疗药物增敏剂中的应用及抗肿瘤药物组合物。

背景技术：

癌症是严重威胁我国人民生命健康的第一大“杀手”，已成为亟待解决的公共健康问题！最新研究提示我国癌症新发病例和死亡病例逐年增加，其中2015年约有429.2万新发浸润性癌症病例，平均每天新发约12000例；同时，2015年有281.4万癌症死亡病例，平均每天约7500人死于癌症。

目前恶性肿瘤的主要治疗手段有手术治疗、放疗和化疗等。对于被诊断为晚期肿瘤的患者和已经发生转移的患者来说，化疗是一个较好的选择，可能是帮助患者延长生存时间和提高预后生活质量的唯一选择。然而肿瘤耐药往往造成化疗失败，从而导致患者病情恶化甚至死亡。肿瘤耐药分为原发性耐药和获得性耐药。统计数据表明，每年死亡的肿瘤患者中，属原发性耐药的约占61％，属获得性耐药的约占33％。从某种意义上说，90％以上肿瘤患者的死亡与肿瘤耐药相关。因此，肿瘤耐药是成功治疗恶性肿瘤急需解决的关键问题之一。

多年以来，科研工作者对肿瘤耐药的逆转开展了广泛研究。研究证实许多化合物可以在体外有效逆转肿瘤耐药，主要包括钙离子通道拮抗剂(维拉帕米、尼卡地平，满尼地平)，环孢素类衍生物(环孢菌素)，喹啉类衍生物(奎宁、奎尼丁)，黄酮类衍生物(黄酮醇、异黄酮)、雌激素调节剂类(三苯氧胺、托瑞米芬)等等。这些药物主要是以p-gp蛋白为靶点，与mdr类药物竞争性或非竞争性地结合p-gp，减少p-gp与化疗药物结合，抑制药物外排，从而恢复肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。

色瑞替尼(曾用名ldk378，按化学结构命名为5-氯-n2-(2-异丙氧基-5-甲基-4-(哌啶-4-基)苯基)-n4-(2-(异丙基磺酰基)苯基)嘧啶-2,4-二胺)，其结构式如式ⅰ所示：

色瑞替尼是渐变性淋巴瘤激酶(anaplasticlymphomakinase，alk)的第二代抑制剂，能够抑制alk的自身磷酸化以及alk-介导的下游信号蛋白stat3的磷酸化；色瑞替尼也能抑制体外和肿瘤异种移植模型中的alk相关癌症细胞株的增殖。2014年美国fda批准色瑞替尼临床用于治疗克唑替尼耐药的非小细胞肺癌。此后欧盟的ema在2015年，日本的pmda在2016年相继批准色瑞替尼用于临床治疗非小细胞肺癌。目前，没有文献报道色瑞替尼与抗肿瘤化疗药物联合用药，并逆转肿瘤细胞对化疗药物的杀伤。

技术实现要素：

本发明通过研究发现了一种色瑞替尼的新用途，色瑞替尼可以作为抗肿瘤化疗药物的增敏剂，与化疗药物合用能够有效提高化疗药物对耐药肿瘤细胞的杀伤。

色瑞替尼在制备抗肿瘤化疗药物增敏剂中的应用。本发明经实验研究发现，色瑞替尼在与化疗药物联合用药时，能够克服肿瘤细胞对化疗药物的耐药性，显著增强化疗药物对耐药肿瘤细胞的治疗效果。

本发明所适用的肿瘤并没有特殊性，对于一般的肿瘤，本发明增敏剂均具有效果。优选的，所述肿瘤为肝癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌或卵巢癌。

进一步优选的，所述肿瘤为肝癌。

常用化疗药物有：

烷化剂：尼莫司汀、卡莫司汀、洛莫司汀、环磷酰胺、异环磷酰胺、甘磷酰芥。

抗代谢药：去氧氟鸟苷、多西氟鸟啶、5-氟尿嘧啶、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟鸟苷、替加氟、吉西他滨、卡莫氟、羟基脲、甲氨蝶呤、优福定、安西他滨。

抗肿瘤抗生素：放线菌素d、多柔比星、柔红霉素、表柔比星、丝裂霉素、培洛霉素、平阳霉素、吡柔比星。

抗肿瘤动植物成分药：伊立替康、三尖杉酯碱、羟基喜树碱、长春瑞宾、紫杉醇、泰索帝、拓扑替康、长春新碱、长春地辛、长春酰胺、长春碱、替尼泊苷、依托泊苷、榄香烯

抗肿瘤激素类：阿他美坦、阿那曲唑、氨鲁米特、来曲唑、福美坦、甲他孕酮、他莫昔芬。

杂类：门冬酰胺酶、卡铂、顺铂、达卡巴嗪、奥沙利铂、乐沙定、可铂奥沙、米托蒽醌、丙卡巴肼。

优选的，所述化疗药物为紫杉醇、多西紫杉醇、长春瑞滨、长春新碱或阿霉素。

本发明还提供了一种抗肿瘤药物组合物，包括化疗药物和增敏剂，所述增敏剂为色瑞替尼。

本发明抗肿瘤药物组合物对肿瘤的类型并没有特殊性，一般的肿瘤均能适用。优选的，所述肿瘤为肝癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌或卵巢癌。

进一步优选的，所述肿瘤为肝癌。

优选的，所述肿瘤对所述化疗药物产生耐药性。

本发明抗肿瘤药物组合物中化疗药物也并没有特异性，常用的化疗药物均适用，常用的化疗药物种类在上文中已有阐述。优选的，所述化疗药物为紫杉醇、多西紫杉醇、长春瑞滨、长春新碱或阿霉素。

本发明研究发现色瑞替尼能够作为抗肿瘤化疗药物耐药增敏剂，与化疗药物联合用药时，能够克服肿瘤对化疗药物产生的耐药性，显著增强化疗药物对耐药肿瘤细胞的疗效，为有效治疗肿瘤提供新的途径和手段。

附图说明

图1为色瑞替尼对sk-hep-1和sk-cbt-2细胞生存率影响结果图。

图2为多西紫杉醇单独使用和与色瑞替尼合用对sk-cbt-2细胞生存率影响结果图。

图3为紫杉醇单独使用和与色瑞替尼合用对sk-cbt-2细胞生存率影响结果图。

图4为长春瑞滨单独使用和与色瑞替尼合用对sk-cbt-2细胞生存率影响结果图。

图5为阿霉素单独使用和与色瑞替尼合用对sk-cbt-2细胞生存率影响结果图。

具体实施方式

细胞株：肝癌耐药细胞株sk-cbt-2及其亲代细胞sk-hep-1。

试剂耗材：mem培养液(杭州吉诺)，0.25％胰酶(杭州吉诺)，胎牛血清(hyclone)，100mm培养皿(corning)，96孔板(bd)，mtt(sigma)，dmso(上海国药)，紫杉醇(索莱宝)，多西紫杉醇(索莱宝)，长春瑞滨(大连美仑)，阿霉素(大连美仑)，色瑞替尼(selleck)。

仪器：细胞培养箱，超净工作台，酶标仪。

实施例1

化疗药物对耐药细胞株sk-cbt-2与其亲代sk-hep-1杀伤作用。

(1)实验方法

sk-cbt-2接种于100mm培养皿，培养72小时，去除培养液；0.25％胰酶消化，收集细胞，细胞计数，配制20000个/ml浓度的单细胞悬液，分别每孔接种0.2ml单细胞悬液至96孔板，每孔总细胞数为4000个；培养过夜，分别加入相应的化疗药物处理；多西紫杉醇的处理浓度为0、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200nm；紫杉醇处理浓度为0、1、2、5、10、20、50、100、200、500nm；长春瑞滨的处理浓度为0、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000nm；阿霉素处理浓度为0、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10000nm。化疗药物分别处理72h，去上清，加入0.2mldmso，酶标仪570nm波长检测od值。

(2)实验结果

结果见表1，处理72小时后，多西紫杉醇对sk-hep-1和sk-cbt-2细胞的半数致死量(ic50)分别约为5.3和231.7nm，sk-cbt-2的耐药系数为43.7倍左右。

紫杉醇对sk-hep-1和sk-cbt-2细胞的ic50分别约为7.2和421.3nm，sk-cbt-2的耐药系数为57.9倍左右。

长春瑞滨对sk-hep-1和sk-cbt-2细胞的ic50分别约为5.8和164.4nm，sk-cbt-2的耐药系数为27.9倍左右；

阿霉素对sk-hep-1和sk-cbt-2细胞的ic50分别约为78.3和1066.6nm，sk-cbt-2的耐药系数为13.6倍左右。

表1

实施例2

色瑞替尼对sk-cbt-2细胞毒性检测，选择无明显细胞毒性的安全浓度。

(1)实验方法

sk-hep-1和sk-cbt-2接种于100mm培养皿，培养72小时，去除培养液；0.25％胰酶消化，收集细胞，细胞计数，配制20000个/ml浓度的单细胞悬液，分别每孔接种0.2ml单细胞悬液至96孔板，每孔总细胞数为4000个；培养过夜，分别加入色瑞替尼(处理浓度为0、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000nm)处理72h，去上清，加入0.2mldmso，酶标仪570nm波长检测od值。

(2)实验结果

结果见图1，500nm的色瑞替尼处理72小时后，sk-hep-1和sk-cbt-2细胞的存活率都依然大于90％。说明色瑞替尼低于500nm时，处理72小时对sk-hep-1和sk-cbt-2都没有明显的杀伤作用。本发明选择500nm色瑞替尼作为增敏剂的安全作用浓度，分别与多西紫杉醇，紫杉醇、长春瑞滨和阿霉素联合用药，检测色瑞替尼多化疗药物的增敏作用。

实施例3

色瑞替尼显著增强多西紫杉醇对sk-cbt-2细胞的杀伤作用。

(1)实验方法

sk-cbt-2接种于100mm培养皿，培养72小时，去除培养液；0.25％胰酶消化，收集细胞，细胞计数，配制20000个/ml浓度的单细胞悬液，分别每孔接种0.2ml单细胞悬液至96孔板的第2-11列，每孔总细胞数为4000个；培养过夜，第2列不加任何试剂，第3-11列的细胞每孔都加500nm的色瑞替尼，同时分别依次加入5、10、20、50、100、200、500、1000、2000nm)多西紫杉醇，共处理处理72h，去上清，加入0.2mldmso，酶标仪570nm波长检测od值。

(2)实验结果

结果见图2，500nm色瑞替尼与多西紫杉醇联合用药，可以显著增强多西紫杉醇对sk-cbt-2细胞的杀伤作用。

实施例4

色瑞替尼显著增强紫杉醇对sk-cbt-2细胞的杀伤作用。

(1)实验方法

sk-cbt-2接种于100mm培养皿，培养72小时，去除培养液；0.25％胰酶消化，收集细胞，细胞计数，配制20000个/ml浓度的单细胞悬液，分别每孔接种0.2ml单细胞悬液至96孔板的第2-11列，每孔总细胞数为4000个；培养过夜，第2列不加任何试剂，第3-11列的细胞每孔都加500nm的色瑞替尼，同时分别依次加入5、10、20、50、100、200、500、1000、2000nm)紫杉醇，共处理处理72h，去上清，加入0.2mldmso，酶标仪570nm波长检测od值。

(2)实验结果

结果见图3，500nm色瑞替尼与紫杉醇联合用药，可以显著增强紫杉醇对sk-cbt-2细胞的杀伤作用。

实施例5

色瑞替尼显著增强长春瑞滨对sk-cbt-2细胞的杀伤作用。

(1)实验方法

sk-cbt-2接种于100mm培养皿，培养72小时，去除培养液；0.25％胰酶消化，收集细胞，细胞计数，配制20000个/ml浓度的单细胞悬液，分别每孔接种0.2ml单细胞悬液至96孔板的第2-11列，每孔总细胞数为4000个；培养过夜，第2列不加任何试剂，第3-11列的细胞每孔都加500nm的色瑞替尼，同时分别依次加入10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000nm)长春瑞滨，共处理处理72h，去上清，加入0.2mldmso，酶标仪570nm波长检测od值。

(2)实验结果

结果见图4，500nm色瑞替尼与长春瑞滨联合用药，可以显著增强长春瑞滨对sk-cbt-2细胞的杀伤作用。

实施例6

色瑞替尼显著增强阿霉素对sk-cbt-2细胞的杀伤作用。

(1)实验方法

sk-cbt-2接种于100mm培养皿，培养72小时，去除培养液；0.25％胰酶消化，收集细胞，细胞计数，配制20000个/ml浓度的单细胞悬液，分别每孔接种0.2ml单细胞悬液至96孔板的第2-11列，每孔总细胞数为4000个；培养过夜，第2列不加任何试剂，第3-11列的细胞每孔都加500nm的色瑞替尼，同时分别依次加入0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10μm)阿霉素，共处理处理72h，去上清，加入0.2mldmso，酶标仪570nm波长检测od值。

(2)实验结果

结果见图5，500nm色瑞替尼与阿霉素联合用药，可以显著增强阿霉素对sk-cbt-2细胞的杀伤作用。