一种用于治疗肝癌的药物组合物及其应用的制作方法

本发明涉及医药技术领域，具体地说，是一种用于治疗肝癌的药物组合物及其应用。

背景技术：

肝细胞癌是一种发病率高、恶性程度高、死亡率高的一种恶性肿瘤，2012年全球有超过70万人死于肝癌，仅次于肺癌。我国是一个肝癌大国，2015年有大约46.6万肝癌新发病例，42.2万肝癌死亡病例，发病人数、死亡人数都超过全球的一半。肝癌起病隐匿，早期症状不典型和诊断困难，确诊时大多数患者已达局部晚期或远处转移，无法运用手术切除、动脉栓塞、肝移植等治疗手段，只有大约15％的患者适合手术切除。对于失去手术机会的晚期患者来讲，药物治疗是延长肝癌患者生存时间、改善生活质量的重要方法。即使能够手术切除，术后容易复发，也需要药物辅助治疗。可是，由于患者往往存在基础性肝病，晚期肝癌的治疗非常棘手，介入治疗有效但也有创，应用常常受到限制；系统化疗临床常用，但尚无证据表明可以延长生存，也缺乏公认的有效药物和标准方案，因此晚期患者常常面临无药可医的困境，预后很差。

近年来小分子靶向抗肝癌药物越来越受到人们的关注和青睐。索拉非尼是目前唯一一个被u.s.fda批准用于治疗肝癌晚期的药物，而且具有双重靶向抗肿瘤作用。索拉非尼一方面通过抑制raf-1、b-raf活性，阻断细胞增殖的ras/raf/mek/erk信号传导通路，直接抑制肿瘤生长；另一方面通过抑制血管生长因子受体、血小板衍生生长因子受体等阻断肿瘤新生血管的形成，间接抑制肿瘤细胞的生长。自一项随机试验证实索拉非尼具有生存优势以来，索拉非尼已经成为晚期肝癌患者的一线标准治疗。虽然索拉非尼单药有很强的抗肝癌作用，但肝癌细胞很容易对其产生耐药性，严重影响其疗效，给肝癌的药物治疗带来困难。同时由于索拉非尼的售价高达2.5万元/盒，使很多肝癌患者望而却步，所以联合用药不失为一种有效的肝癌治疗方案。

本发明是将索拉非尼与丙戊酸联合作用于肝癌细胞和肝癌裸鼠体内移植瘤模型上，研究发现，二者联合给药能产生协同抑制肝癌细胞生长作用。丙戊酸是一种酸性小分子化合物，具有广谱抗癫痫作用，已在临床使用多年，疗效肯定，不良反应少，安全性高，且价格低廉。近年来，由于其广泛的抗肿瘤活性而再次受到人们的关注。二者联合给药的方案不仅能提高肝癌细胞对索拉非尼的敏感性，增加对肝癌细胞的抑制作用，还能减少索拉非尼的用药剂量，直接降低每个肝癌患者的治疗成本，让更多的肝癌患者获益于此，它所带来的市场前景以及经济和社会收益将无法估量。

中国专利文献cn104496896a公开了一种含磺酰脲结构的索拉非尼衍生物、其几何异构体及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或前药，及其在制备治疗和/或预防增生性疾病药物中的应用，在制备治疗和/或预防癌症的药物中的应用、在制备治疗和/或预防肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌的药物中的应用。中国专利文献cn103933039a公开了一种含水飞蓟宾和索拉非尼的药物组合物，其中，所述药物组合物中水飞蓟宾和索拉非尼的质量比例为1：1～1：5。该药物组合物在提高肿瘤抑制效果的同时，有效地改善了水飞蓟宾的溶解度以及索拉非尼的副作用，且两者的联合用药表现出了较好的协同作用。中国专利文献cn101940569a公开了一种含有索拉非尼与青蒿素及青蒿素类衍生物的药物组合物及其在制备治疗肺癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌、前列腺癌、肾癌、胃癌、脑瘤、肉瘤、卵巢癌或乳腺癌的药物中的应用。但是关于本发明一种用于治疗肝癌的药物组合物及其应用目前还未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种用于治疗肝癌的药物组合。

本发明的另一目的是，提供一种用于治疗肝癌的药物组合的应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种用于治疗肝癌的药物组合，所述的药物组合的组分摩尔浓度比为：丙戊酸：索拉非尼1：500～1：2000。

所述的药物组合的组分摩尔浓度比为：丙戊酸：索拉非尼1：600～1：1900。

所述的药物组合的组分摩尔浓度比为：丙戊酸：索拉非尼1：600。

所述的药物组合的组分摩尔浓度比为：丙戊酸：索拉非尼1：1000。

所述的药物组合的组分摩尔浓度比为：丙戊酸：索拉非尼1：1800。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：所述的药物组合在制备治疗肝癌药物中的应用。

本发明优点在于：

1、本发明的药物组合能产生协同抗肝癌的作用，二者联合给药的方案不仅能提高肝癌细胞对索拉非尼的敏感性，增加对肝癌细胞的抑制作用，还能减少索拉非尼的用药剂量，直接降低每个肝癌患者的治疗成本，让更多的肝癌患者获益于此。

2、本发明的药物组合价格低廉，安全性高，疗效肯定。

3、本发明的药物组合生产方便，便于大规模投入生产，良好的疗效、低廉的成本也有益于社会公共利益。

发明内容

附图1是索拉非尼单药对肝癌细胞株sk-hep1的抑制曲线图。

附图2是索拉非尼单药对肝癌细胞株hepg2的抑制曲线图。

附图3是丙戊酸单药对肝癌细胞株sk-hep1的抑制曲线图。

附图4是丙戊酸单药对肝癌细胞株hepg2的抑制曲线图。

附图5是索拉非尼单药、丙戊酸单药、索拉非尼联合丙戊酸对肝癌细胞株sk-hep1的抑制作用对比图。

附图6是索拉非尼单药、丙戊酸单药、索拉非尼联合丙戊酸对肝癌细胞株hepg2的抑制作用对比图。

附图7是细胞生长曲线图。

附图8是肝癌细胞株sk-hep1凋亡的散点图。

附图9是肝癌细胞株hepg2凋亡的散点图。

附图10是肝癌细胞株sk-hep1凋亡率统计的柱状图。

附图11是肝癌细胞株hepg2凋亡率统计的柱状图。

附图12是蛋白质印迹图。

附图13是裸鼠肿瘤图。

附图14是裸鼠肿瘤体积曲线图。

附图15是裸鼠体重曲线图。

附图16是谷丙转氨酶对比图。

附图17是血清尿素氮对比图。

具体实施方式

下面通过实施例并结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

本发明的药物组合组分的摩尔浓度比为：丙戊酸：索拉非尼1：500～1：2000。

实施例1药物组合物

本发明的药物组合的组分摩尔浓度配比为：丙戊酸：索拉非尼1：500。

实施例2药物组合物

本发明的药物组合的组分摩尔浓度配比为：丙戊酸：索拉非尼1：600。

实施例3药物组合物

本发明的药物组合的组分摩尔浓度配比为：丙戊酸：索拉非尼1：700。

实施例4药物组合物

本发明的药物组合的组分摩尔浓度配比为：丙戊酸：索拉非尼1：800。

实施例5药物组合物

本发明的药物组合的组分摩尔浓度配比为：丙戊酸：索拉非尼1：900。

实施例6药物组合物

本发明的药物组合的组分摩尔浓度配比为：丙戊酸：索拉非尼1：1000。

实施例7药物组合物

本发明的药物组合的组分摩尔浓度配比为：丙戊酸：索拉非尼1：1500。

实施例8药物组合物

本发明的药物组合的组分摩尔浓度配比为：丙戊酸：索拉非尼1：2000。

实施例9实验一

1.实验目的：采用sk-hep1和hepg2肝癌细胞株，检测索拉非尼单药和丙戊酸单药对肝癌细胞的抑制作用。

2.实验方法：将sk-hep1和hepg2细胞株，铺到96孔板中，24h后分别加入不同浓度的索拉非尼(0.0625μm、0.125μm、0.25μm、0.5μm、1μm、2μm、4μm、8μm、16μm)和丙戊酸(0.0625mm、0.125mm、0.25mm、0.5mm、1mm、2mm、4mm、8mm、16mm)，浓度培养48h后用cck-8法测定细胞存活率，绘制细胞生长曲线。

3.cck-8法测定细胞存活率具体步骤：

(1)细胞生长至对数期，0.05％胰酶消化、离心后用含10％胎牛血清的新鲜培养基重悬，全自动细胞计数仪计算细胞浓度，调整细胞浓度至3×10⁴/ml，铺到96孔板中，100μl/孔；5％二氧化碳的37℃培养箱孵育24小时。

(2)梯度稀释法配置索拉非尼和丙戊酸溶液，小心弃去上层培养基，加入含药物索拉非尼和丙戊酸的培养基，用100μl不含细胞的新鲜培养基作为空白孔，100μl含细胞不加药物的培养基作为对照孔，37℃培养箱继续孵育72小时。

(3)每孔加入10μlcck-8溶液，37℃培养箱孵育1小时；用酶标仪测定450nm吸光度，计算细胞存活率，细胞存活率＝[(as-ab)/(ac-ab)]/100％。

注：as：实验孔吸光度；ac：对照孔吸光度；ab：空白孔吸光度。

4.实验结果：

见附图1、附图2、附图3、附图4。

结果表明索拉非尼单药和丙戊酸单药对肝癌细胞株sk-hep1和hepg2有抑制作用。

实施例10实验二

1.实验目的：采用sk-hep1和hepg2肝癌细胞株，检测索拉非尼联合丙戊酸对肝癌细胞的抑制作用。

2.实验方法：将sk-hep1和hepg2细胞株，铺到96孔板中，24h后加入不同浓度的索拉非尼和丙戊酸(固定比例1:1000)，培养48h后用cck-8法测定细胞存活率，绘制细胞生长曲线。

3.cck-8法测定细胞存活率具体步骤：

(1)细胞生长至对数期，0.05％胰酶消化、离心后用含10％胎牛血清的新鲜培养基重悬，全自动细胞计数仪计算细胞浓度，调整细胞浓度至3×10⁴/ml，铺到96孔板中，100μl/孔；5％二氧化碳的37℃培养箱孵育24小时。

(2)梯度稀释法配置索拉非尼和丙戊酸溶液，小心弃去上层培养基，加入含药物索拉非尼和丙戊酸的培养基，用100μl不含细胞的新鲜培养基作为空白孔，100μl含细胞不加药物的培养基作为对照孔，37℃培养箱继续孵育72小时。

(3)每孔加入10μlcck-8溶液，37℃培养箱孵育1小时；用酶标仪测定450nm吸光度，计算细胞存活率，细胞存活率＝[(as-ab)/(ac-ab)]/100％。

注：as：实验孔吸光度；ac：对照孔吸光度；ab：空白孔吸光度。

4.实验结果：

见附图5、附图6、附图7；

索拉非尼联合丙戊酸能产生协同抗肝癌作用，丙戊酸和索拉非尼联合给药物组比丙戊酸单药组和索拉非尼单药组有更强的抗肝癌作用。

实施例11实验三

1.实验目的：采用流式细胞术检测索拉非尼联合丙戊酸对肝癌细胞sk-hep1和hepg2凋亡的影响。

2.实验方法：在6孔板上接种对数期的肝癌细胞sk-hep1和hepg2，培养24h以后加入索拉非尼和丙戊酸；实验分组为：control组、丙戊酸(2mm)组、索拉非尼(2μm)和丙戊酸(2mm)+索拉非尼(2μm)组；加药12h后收集细胞，按照annexin-fitc试剂盒说明操作，常温避光30min后上机检测。

3.流式细胞术检测具体步骤：

(1)对数期细胞，0.05％胰酶消化、离心后用含10％胎牛血清的新鲜培养基重悬，全自动细胞计数仪计算细胞浓度，调整细胞浓度至2*10⁶/ml，铺到6孔板中，2ml/孔；5％二氧化碳的37℃培养箱孵育24小时。

(2)梯度稀释法配置索拉非尼和丙戊酸溶液，小心弃去上层培养基，加入含药物索拉非尼和丙戊酸的培养基，对照孔为含0.1％dmso的培养基，37℃培养箱继续孵育72小时。

(3)细胞用0.05％胰酶消化，800rpm离心5分钟，冷pbs缓冲液洗两次，再用1×bindingbuffer缓冲液重悬，制成1×10⁶/ml的悬液。

(4)取100μl细胞悬液到标记好的ep管中，加入5μl的annexinv-fitc和5μl的pi，室温避光孵育15分钟。

(5)各ep管中加入400μl的1×bindingbuffer，1小时内上流式细胞仪检测。

4.实验结果：

见附图8、附图9、附图10、附图11；

丙戊酸和索拉非尼联合组比索拉非尼单药组能更加促进肝癌细胞株sk-hep1和hepg2的凋亡。

实施例12实验四

1.实验目的：采用蛋白质印迹法检测索拉非尼联合丙戊酸对肝癌细胞sk-hep1和hepg2凋亡的影响。

2.实验方法：采用sk-hep1和hepg2肝癌细胞株，加入索拉非尼4μm和丙戊酸4mm，实验分组为：control组、丙戊酸(4mm)组、索拉非尼(4μm)和丙戊酸(4mm)+索拉非尼(4μm)组。用蛋白质印迹法比较凋亡相关蛋白(bcl-xl、bax、parp)的表达量。

3.蛋白质印迹法具体步骤：

(1)吸去细胞培养基，细胞用预冷的pbs洗一遍，吸去pbs，按每60mm培养皿加200μl的量加入ripa裂解液(含有1mm的pmsf和1％蛋白酶抑制剂)，并将培养皿置于冰上裂解10分钟。用细胞刮刮下细胞裂解物，置灭菌的ep管中，用超声仪裂解样品，再放冰上继续裂解10分钟。

(2)将细胞裂解物离心，离心力13000g，4℃离心10分钟，取上清至新的ep管中。

(3)bca法测定蛋白样本浓度，样本中加入上样缓冲液，98℃煮10分钟，置冰上冷却。

(4)将样本加到sds-page胶中，电泳分离后转膜到pvdf膜上。将pvdf膜用脱脂奶粉室温封闭1小时，再用相应的一抗孵育，4℃过夜。

(5)pvdf膜用tbst洗膜3次，每次5分钟。再用相应的二抗室温孵育1小时。

(6)tbst洗膜3次，每次5分钟，用ecl化学发光底物显影。

4.实验结果：

见附图12；

丙戊酸联合索拉非尼能减少抗凋亡蛋白bcl-xl的表达、增加细胞凋亡蛋白bax的表达以及增加parp蛋白剪切段的表达(细胞凋亡的一个重要指标)。

实施例13动物实验

1.实验材料：

动物：balb/c(nu/nu)裸鼠，鼠龄5周，体重15-18g，雄性。

2.分组：空白对照组、索拉非尼20mg/kg、丙戊酸200mg/kg、索拉非尼20mg/kg+丙戊酸200mg/kg。

3.实验步骤：

3.15周龄雄性裸鼠，腋下注射肝癌细胞株sk-hep1细胞悬液，5×10⁷个/ml，100μl/只。

3.2待肿瘤长出后，用游标卡尺测量肿瘤体积(v＝0.5×ab²，a，b分别为肿瘤最长径和最短径的长度)，筛选出肿瘤大小相近的裸鼠，分为4组(对照组、索拉非尼20mg/kg、丙戊酸200mg/kg、索拉非尼20mg/kg+丙戊酸200mg/kg)，每组6只。

3.3肿瘤长至约100mm³时开始给药，灌胃给药，0.1ml/只，每天灌胃一次，连续给药21天，每3天测量裸鼠体重、肿瘤体积一次。

3.4给药21天后，5％水合氯醛麻醉裸鼠，取血、肿瘤、肝肾等组织，进行后续实验。

4.实验结果：

丙戊酸和索拉非尼联合组比索拉非尼单药组和丙戊酸单药组能更加减少肝癌裸鼠皮下移植瘤的体积，且安全性良好；

见附图13、附图14、附图15、附图16、附图17。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。