一种新的抗犬新孢子虫药物的制作方法

本发明提供了一种新的抗犬新孢子虫药物，提供了sb203580的新用途，用于新孢子虫病的治疗，属于抗寄生虫药物技术领域。

背景技术：

新孢子虫病（neosporiasis）是由犬新孢子虫（neosporacaninum）寄生于脊椎宿主细胞内所引发的一种致死性原虫病，它是一种新近发现的原虫病。同顶复门的大多数成员一样，新孢子虫专门寄生于宿主有核细胞内，其宿主范围广泛，包括绝大多数哺乳动物。主要导致孕畜的流产和仔畜的死亡及运动神经系统紊乱。据统计，世界上12%-42%的奶牛流产是由新孢子虫感染引起的，因而新孢子虫病被认为是世界性奶牛流产的主要病因，对牛是原发性重要致病原，对畜牧业尤其是养牛业的危害严重，而且目前还不能排除新孢子虫病的人畜共患潜在性。鉴于新孢子虫病在公共卫生的潜在危险和畜牧、养殖业的重要意义，该病逐渐成为近年来兽医学界研究的重要课题。然而，目前为止，尚无防治新孢子虫病的特效药物，乙胺嘧啶、磺胺类、螺旋霉素、克林霉素等药物虽有一定疗效，但耐药性、毒副作用等缺点明显，因此，人们迫切需要寻找新的阻断新孢子虫感染的有效药物。

本发明涉及的sb203580是一种丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivatedproteinkinase，mapk）的特异性抑制剂，它是一种靶向atp结合位点的竞争性抑制剂，能够抑制宿主细胞map激酶的磷酸化；sb203580的分子量为377.43，化学式为c21h16fn3os，结构式：

经检索本发明涉及的sb203580未见在犬新孢子虫方面的医用用途。

技术实现要素：

本发明目的是提供一种新的抗犬新孢子虫药物，用于新孢子虫病的治疗，对于犬新孢子虫感染有明显治疗作用。

本发明抗犬新孢子虫药物的内容，包括：

根据mapk蛋白的分子特征寻找特异性的化学抑制剂，用该抑制剂阻断mapk信号通路后，通过细胞侵入、感染实验，以及小鼠模型的动物实验，观察其对犬新孢子虫侵入宿主细胞、在宿主细胞内增殖和在小鼠脑组织寄生虫感染的阻断效果，同时提供该抑制剂发挥阻断作用的工作浓度以及潜在的作用途径，为抗犬新孢子虫感染提供新的药物，为未来新孢子虫病的治疗提供新的候选药物。

本发明抗犬新孢子虫药物的作用途径，包括以下内容：

首先，通过免疫印迹法对宿主细胞mapk的磷酸化蛋白和总蛋白表达水平进行检测，分析该抑制剂对宿主mapk信号通路的阻断作用，并对阻断宿主mapk通路后，对犬新孢子虫侵入细胞的影响进行证明；其次，通过显微镜法速殖子活力测定和免疫印迹法测定微线蛋白分泌，分析该抑制剂对犬新孢子虫虫体的直接抑制作用。

本发明的积极效果在于：

提供了sb203580的新的医用用途，到了能显著抑制犬新孢子虫细胞感染和小鼠模型脑组织感染的化学药物,其通过同时作用于宿主细胞和寄生虫两方面来发挥阻断作用。本发明为犬新孢子虫的治疗提供了新的候选药物和新的候选药物作用靶标p38mapk，为未来药物干预新孢子虫病奠定基础。

附图说明

图1、本发明sb203580作用于mdbk细胞的途径；

图2、本发明sb203580对速殖子活力的抑制效果；

图3、本发明sb203580对微线蛋白分泌的抑制效果；

图4、本发明sb203580对犬新孢子虫侵入细胞的阻断效果；

图5、本发明sb203580对犬新孢子虫胞内增殖的阻断效果；

图6、本发明sb203580对犬新孢子虫在小鼠脑感染的阻断效果。

具体实施方式

以下描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这仅仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的，本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，这些变更和修改均落入本发明的保护范围。

实施例1

本发明以sb203580为例，证明其对犬新孢子虫侵入细胞、胞内增殖和小鼠脑感染的治疗效果。

作用于mdbk细胞的途径：

用sb203580阻断宿主p38mapk后，观察其对犬新孢子虫侵入宿主细胞的影响，并用spss软件对所得数据进行统计学分析。感染前（速殖子：细胞=10：1）用sb203580（20µm）预孵育宿主细胞1h，然后用pbs清洗除去抑制剂，结果显示：2h时，感染细胞百分比减少了32.8%（p<0.05）；而且1h时通过westernblot检测p38mapk的磷酸化，结果表明sb203580作用细胞使犬新孢子虫诱导的宿主p38mapk的活化显著降低（p<0.05），说明sb203580能作用于宿主细胞发挥部分对犬新孢子虫感染的抑制作用（如附图1所示）。

作用于新孢子虫的途径：

用sb203580阻断寄生虫p38mapk信号通路后，观察其对犬新孢子虫速殖子活力和微线蛋白分泌的影响，并用spss软件对所得数据进行统计学分析。用sb203580（20µm）孵育10⁷个nc-1速殖子2h，结果显示：sb203580处理后，速殖子活力得到显著抑制，活动的速殖子百分比减少了55.3%（p<0.05）（如附图2所示）；而且sb203580能显著抑制微线蛋白ncmic2、ncmic3和ncmic6的胞外分泌（p<0.05）（如附图3所示），说明sb203580能直接作用于寄生虫，抑制犬新孢子虫的活力和微线蛋白分泌；另外，我们对犬新孢子虫虫体上p38mapk蛋白同系物进行了预测，在原虫数据库(www.toxodb.org)上检索与宿主p38mapk同源的激酶同系物，结果搜索到了假定的p38mapk同系物，其中得分最高（expect值最低）的前5个激酶同系物依次列在表1中。

将这些蛋白与鼠p38αmapk蛋白(np_001161980；mapk14，musmusculus)进行序列比对，结果发现：这5个激酶同系物都属于mapk激酶家族和细胞周期素依赖类激酶（cyclindependentlikekinases，cdk）家族，并且与鼠p38αmapk有34%–44%的序列同源性。序列分析鉴定出与哺乳类p38mapk激酶催化结构域有高度保守性的基序：vaxk基序（亚结构域ii）的氨基酸k53、dfglar基序（亚结构域vii）的氨基酸d168及t180xy182txxyxape基序（亚结构域viii）的氨基酸t180。其中txytxxyxape基序的t180和y182是p38mapk的主要磷酸化位点，在同系物蛋白ncliv_032840、ncliv_015030和ncliv_056080中都存在。这些结果表明犬新孢子虫上存在sb203580的作用位点，sb203580可能直接作用于新孢子虫虫体（如附表1所示）。

表1犬新孢子虫mapk同系物与鼠p38αmapk的序列比对结果

表1中列出与鼠p38αmapk同源性最高的前5个新孢子虫假定p38αmapk同系物蛋白，通过序列分析，真核蛋白激酶催化结构域的主要亚结构域基序呈现在上表中，常见的氨基酸显示为粗体，高频率氨基酸显示为斜体。

结论：本发明所述的sb203580通过同时作用于宿主细胞和寄生虫两方面来发挥阻断作用。

实施例2

抗犬新孢子虫药物的用途

1、mapk抑制剂对犬新孢子虫侵入细胞的阻断效果

本发明以sb203580为例，观察其对犬新孢子虫侵入mdbk细胞的阻断效果。

mdbk细胞与sb203580共孵育，然后接种nc-1速殖子（速殖子：细胞=10：1）,通过细胞侵入实验，观察抑制剂对犬新孢子虫侵入细胞的阻断效果，并用spss软件对所得数据进行统计学分析。结果显示：sb203580对犬新孢子虫侵入细胞的阻断呈现浓度依赖性，当sb203580的作用浓度为5µm、10um和20um时，在感染2h时每100个细胞的速殖子数分别减少了21.7%、39.8%和63.5%（均p<0.05）；在感染1h和2h时，sb203580（20µm）均能显著抑制犬新孢子虫侵入细胞，感染细胞百分比分别减少了54.8%和57.3%（p<0.05）（如附图4所示）。

mapk抑制剂对犬新孢子虫胞内增殖的阻断效果

本发明以p38mapk抑制剂sb203580为例，观察其对犬新孢子虫在mdbk细胞内增殖的阻断效果。

mdbk细胞用p38mapk抑制剂sb203580孵育1h，然后接种nc-1速殖子（速殖子：细胞=10：1）,通过细胞感染实验，观察抑制剂对犬新孢子虫细胞内增殖的阻断效果，并用spss软件对所得数据进行统计学分析。结果显示：sb203580对犬新孢子虫胞内增殖的阻断呈现浓度依赖性，当sb203580为5µm、10um和20um时，在感染24h时每100个细胞的速殖子数分别减少了12.1%（p>0.05）、25.6%（p<0.05）和43.5%（p<0.05）；sb203580为20µm时，感染细胞百分比减少了42.5%（p<0.05）。说明sb203580的作用浓度为10µm和20µm时均能显著抑制犬新孢子虫的胞内增殖（如附图5所示）。

sb203580对小鼠模型犬新孢子虫感染的治疗效果

本发明以sb203580为例，观察其对犬新孢子虫小鼠感染模型治疗效果。

给小鼠腹腔接种10⁷个nc-1速殖子，随后每天静脉注射sb203580，连续给药一星期，分别设立pbs组、溶剂dmso组，以及给药5µm、10µm、20组，30天后处死小鼠，采取脑组织，通过荧光定量pcr检测每20ng脑组织dna的速殖子数量，使用nc-5特异性引物：

引物序列为上游引物：5′-tccctcggttcacccgttcacacac-3′；

下游引物：5′-cacgtatcccacctctcaccgctacca-3′；

结果发现：给药后，脑组织寄生虫感染数量的减少呈现药物浓度依赖性，给药5µm、10um和20µm组，速殖子数/20ngdna分别减少了9.4%（p>0.05）、21.5%（p<0.05）和38.3%（p<0.05）。说明sb203580的作用浓度为10µm和20µm时均能显著降低犬新孢子虫在小鼠模型的脑组织感染量（如附图6所示）。

综合上述实验结果，本发明的抗犬新孢子虫药物通过同时作用于宿主细胞和寄生虫的方式，抑制新孢子虫侵入宿主细胞、虫体在宿主细胞内的增殖和脑组织内的新孢子虫感染数量，发挥抗犬新孢子虫感染的效果，可用于动物犬新孢子虫感染的治疗。