本发明属于海洋药源鱼类的疾病防控技术领域，具体涉及一种预防海马腐皮病的中草药复方制剂。
背景技术：
海马隶属于海龙科、海马属(hippocampus)，广泛分布于大西洋、太平洋等海域。作为一种名贵的海洋药源动物，由于过度捕捞和生态环境的严重破坏，许多种类已成为濒危品种，迫切需要人工养殖来满足市场需求和恢复自然资源。但是，随着海马人工养殖规模的不断扩大，海马病害问题也日趋严重。其中以海马腐皮病危害最大，该病在海马育苗、养成期间均会大规模爆发，是制约我国海马产业持续发展的瓶颈问题。
腐皮病或被称为、打印病、溃烂病、溃疡病、溃疡综合症、流行性溃疡综合征。腐皮病在水产养殖行业中是一种常见多发性疾病，其危害淡海水鱼类、甲壳类、贝类、两栖爬行类、棘皮动物类等，通常发病后短时间内能造成大面积死亡，且该病治愈率低。在海马养殖产业中，腐皮病主要表现的症状为：离群独游、厌食、吻部或尾部溃疡、鱼体腹部两侧凹陷、脱肛等，其传染性强，通常被感染鱼类死亡率高达95％。该病病原具有多样性，通常由多种细菌共同致病，微生物实验中分离出，鰤诺卡氏菌(nocardiaseriolae)、哈维式弧菌(vibrioharveyi)、副溶血弧菌(vibrioparahaemolyticus)、塔式弧菌(vibrotubiashii)、创伤弧菌(vibriovulnificus)5种主要致病菌，其发病症状和主要病原详见表1。
表1海马腐皮病的发病症状及主要病原菌：
目前海马腐皮病主要抗生素进行治疗，抗生素滥用情况十分严重，使得海马患病后治疗难度加大。海马作为一种药源动物，抗生素的滥用导致养殖海马的药物残留安全问题并影响其药效价值，势必将会造成海马养殖业的窘境。
中草药属于天然药物，具有无抗药性、无药残等特点，因此利用中草药对水产动物进行疾病防治受到人们重视和青睐。中草药来源于动植物本身，保持了各组分的自然状态和生物活性，其包括具有抗菌作用的鞣质、生物碱、甙类、挥发油、多糖等；具有增强免疫作用的皂苷类、木脂素、黄酮类等多种成分对养殖动物进行全方面的调理，这是化学合成物所不能及的。由于海马作为一种名贵药源动物，在疾病防控上应避免抗生素类药物的使用，其迄今为止国内外并没有关于治疗海马腐皮病的中草药制剂，所以对中草药进行合理配伍得到一种具有抗毒驱邪、疏肝利胆、健脾和胃之功效的复方制剂用于海马腐皮病的防治，将具有非常重要的实践意义。
技术实现要素：
本发明提供一种预防海马腐皮病的中草药复方制剂，旨在针对引发海马腐皮病的病菌进行生理生化、药理研究，开发出一种具备抑制多种海马腐皮病病原菌，且能同时提高海马免疫力，养殖成活率的中草药复方制剂。
一种防治海马腐皮病的中草药复方制剂，由如下质量份数的原料制备而成，五倍子15-25份、龙胆15-25份、大黄10-20份、黄芩10-20份、鱼腥草8-15份、黄芪10-20份、白芍8-15份、布渣叶10-20份。
五倍子为同翅目蚜虫科的角倍蚜或倍蛋蚜雌虫寄生于漆树科植物“盐肤木”及其同属其他植物的嫩叶或叶柄，刺伤而生成一种囊状聚生物虫瘿，经烘焙干燥后所得。又名文蛤、百虫仓，含五倍子鞣质。还含没食子酸、脂肪、树脂及腊质等。因其对蛋白有凝固作用，所以显示出其对绿脓杆菌、痢疾杆菌、变形杆菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、肠炎杆菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、金黄色葡萄球菌、多种弧菌均有抑制作用。此药味酸性寒，有收敛生津之功效。
龙胆味苦微酸性寒，具有清热解毒、疏肝利胆之功效。龙胆主含有龙胆苦苷、龙胆碱、龙胆糖等。龙胆苦苷具有保肝、降低谷丙转氨酶及利胆的作用，可促进胃液和胃酸分泌。同时其对多种细菌具有不同程度的抑制作用。
黄芪味甘性微温，具有补中益气、增强免疫之功效。其主要含有黄芪苷、胆碱、甜菜碱、香豆素、黄酮化合物、皂苷、氨基酸及微量的叶酸等。其具有增强特异性和非特异性免疫、增强抗自由基损伤和抗脂质过氧化的作用。
白芍含有药苷、氧化芍药苷、苯甲酸、β-谷甾醇、鞣质及挥发油等。白芍的水煎剂对巨噬细胞的吞噬能力具有明显的促进作用。对多种细菌、真菌均有不同程度的抑制作用。该药味苦微酸、性寒，具有增强免疫的功效。
布渣叶即为椴树科植物破布树的叶，又称蓑衣子、破布叶、麻布叶、烂布渣、布包木、破布树、薢宝叶。该药味酸性平，具有清热利湿，健胃消滞之功效。
本中草药复方制剂符合中医配伍中同气相求、性味归经以及十八反、十九畏之原则，不仅防治海马腐皮病，还提高机体免疫力，避免了抗生素在海马养殖中的使用。该配方主以五倍子、龙胆，清热解毒、疏肝利胆；辅以大黄、黄芩助主药抗毒驱邪；佐以黄芪、白芍、布渣叶，补中益气、健脾和胃，从而有效防治海马腐皮病，提高海马成活率。
本中草药复方制剂的制备方法是：将海马腐皮病的中草药复方制剂按照各组分重量比称取即五倍子15-25份、龙胆15-25份、大黄10-20份、黄芩10-20份、鱼腥草8-15份、黄芪10-20份、白芍8-15份、布渣叶10-20份。将称取药物粉碎呈粉末状，粒度200目。
本中草药复方制剂的使用方法及用量是：将海马腐皮病的中草药复方制剂按照10-35‰的重量比例用于活体饵料(丰年虫)的强化，强化时间8-12h，以饵料强化水体呈透明为宜。或将海马腐皮病的中草药复方制剂按照8-12‰的比例混入饲料(海马需经过饲料摄食驯化)中，制成药饵料进行投喂。若发现腐皮病爆发，可将海马腐皮病的中草药复方制剂水煎剂按照每方水体10-50克的浓度全池泼洒，控制病情。水煎剂的制备方法是：将海马腐皮病的中草药复方制剂根据养殖水体体积称取一定重量，将称取后的中草药浸泡1h，用大火煮至沸腾，再小火熬制90min后用多层纱布去除中药残渣。
具体实施方式
为了理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但不限制本发明。
实施例1
本中草药复方制剂对海马腐皮病多种病原菌的抑菌能力
药物敏感试验(ast)是指在体外测定药物抑菌或杀菌能力的试验。药物敏感试验能准确的显示药物抑制细菌或杀灭细菌的能力，能引导生产中准确有效的利用药物进行疾病控制与预防。
本实施例采用纸片扩散法进行ast试验，并将目前养殖中常用且列入国标兽药(水产用)的部分抗生素类药物(氟苯尼考、诺氟沙星、恩诺沙星、复方新诺明、强力霉素、新霉素)与本发明中草药复方制剂进行药物敏感程度对比。ast试验的基本方法和原理是将含有一定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了病原菌的培养基表面上，滤纸片周围抑菌浓度范围内的病原菌不能生长，而抑菌范围外的菌株则可以生长，从而在滤纸片的周围形成抑菌圈，抑菌圈的直径可以直观的反映出病原菌对该种药物的敏感程度。
制备药敏纸片：取新华1号(11μm)定性滤纸，用打孔机制成直径为6mm的圆形小纸片。将制得药敏纸片放入玻璃容器内并将瓶口用单层报纸包扎，放入高压蒸汽灭菌锅内灭菌15-20min，完成后将所制药敏纸片放入烘箱中烘干，使其干燥待用。
制备中草药复方制剂：将海马腐皮病的中草药复方制剂按照各组分重量比称取五倍子20份、龙胆20份、大黄15份、黄芩15份、鱼腥草10份、黄芪15份、白芍10份、布渣叶15份。将称取后的中草药粉碎，粒度200目，加入蒸馏水，浸泡1h后熬制90min，得中草药原液，浓度为0.5g/ml。
中草药复方制剂药敏纸片的制备：将所制得的药敏纸片放入稀释至50μg/ml的中草药药液中，轻轻翻动纸片，使各纸片充分浸透中草药药液，翻动纸片时不能将纸片捣烂。将制备好的中草药复方制剂药敏纸片备注标记待用。
抗生素类药物，均使用市场购买的商品药敏纸片。选用药敏纸片抗生素如下：氟苯尼考(30μg)、诺氟沙星(30μg)、恩诺沙星(5μg)、复方新诺明(1.25/23.75μg)、强力霉素(30μg)、新霉素(30μg)。
具有5种病原菌的培养基的制备：用液体培养基在29℃恒温下分别培养鰤诺卡氏菌(使用改良诺卡氏菌培养基且培养时间较长)、哈维式弧菌、副溶血弧菌、塔式弧菌、创伤弧菌5种病原菌菌悬液，采用麦氏比浊法调整病原菌菌液的浓度为1.0×107cfu/ml。用移液枪吸取200μl新鲜菌悬液至培养基上，使用玻璃涂布棒将菌悬液涂布均匀。
药物敏感试验：将7种药物的药敏纸片依次贴于病原菌培养基上，然后将培养基置于30℃恒温培养箱中培养24h(鰤诺卡氏菌培养时间为4-10d)后量取抑菌圈直径，每一种病原菌的药敏试验均做两个平行组，取结果平均值以消除试验误差。
通过海马腐皮病的中草药复方制剂与多种国标兽药(水产用)抗生素类药物进行药物敏感性对比试验，证明该中草药复方制剂具有对多种腐皮病病原菌的杀灭和抑制作用。在多种国标兽药(水产用)抗生素类药物中，尚无一种抗生素能同时抑制多种海马腐皮病病原菌，而该中草药复方制剂对多种病原菌均显示出敏感和中度敏感即病原菌对其不呈现耐药性。试验证明在由多种病原菌引起的海马腐皮病的治疗中由于抗生素类药物的限制使用而采用海马腐皮病的中草药复方制剂具有积极的作用。药敏试验结果见表2
实施例2
本中草药复方制剂在工厂化养殖中对海马腐皮病的防治
通过对本中草药复方制剂的药敏性试验获得的结果，开展了工厂化养殖中对海马腐皮病的防治试验。
试验海马挑选：2016年4月初在天津地区开展海马繁殖育苗工作，在5月中旬海马达1月龄左右。挑选体长4-5cm，体重1.8-2.5g的海马8000尾进行试验。
高密度海马养殖：使用高1m，容积为6m3的养殖池进行养殖，每个养殖池投放2000尾4-5cm海马，养殖4月后海马体长达15-17cm。养殖期间共设4个养殖池，两个试验池、2个对照池。每日投喂三次，投喂时间及饵料为7点投喂糠虾、12点投喂丰年虫、17点投喂丰年虫，每日投喂饵料总重量为海马体重的10％-12％，每日换水一次。
试验组每隔7d使用经本中草药复方制剂15‰强化10h后的丰年虫投喂海马，连续投喂2日，每日投喂2次，且投喂期间使用本中草药复方制剂水煎剂泼洒全池，使药物浓度达20ppm(即按照每方水体20克的浓度全池泼洒)。对照组不使用药物进行养殖。
2016年5月17日开始记录养殖数据，2016年9月20日完成试验，进行数据总结分析。试验结束后，每组随机抽取200尾海马测量体长、体重，最后取其平均值。结果见表3：
通过临床试验证明，在海马养殖期间，定期以15‰的中药草复方制剂强化丰年虫投喂海马和全池泼洒药物后，可以有效预防海马腐皮病发生；在试验组2中海马虽然出现腐皮病，但经投喂74日30‰的中草药复方制剂强化丰年虫后，可完全控制腐皮病爆发。试验显示，本发明中草药制剂不仅可完全代替抗生素防止海马腐皮病使用，还能起到增重、增产的作用，对解决海马腐皮病难题，提高海马成活率及其药用价值具有非常重要的意义。
表2海马腐皮病中草药复合制剂、抗生素类药物对腐皮病病原菌的药敏试验结果
注：r表示耐药；i表示中度敏感；s表示敏感
表3中草药复合制剂在海马养成期对海马腐皮病防治临床试验结果
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。