本发明属于生物制品制备
技术领域：
，具体地说，涉及一种含有寨卡病毒和黄热病毒的联合灭活疫苗。
背景技术：
：目前全球广泛使用的黄热疫苗均为使用17d减毒株接种鸡胚组织制备的。我国自1953年开始生产黄热疫苗，至今已有50余年。多年临床应用表明，减毒黄热疫苗较安全有效，但也有因注射减毒黄热疫苗引起的严重副反应，主要是与黄热病毒有关的嗜内性疾病(yellowfeverassociatedviscerotropicdisease,yel-avd)和嗜神经性疾病(yellowfeverassociatedneurotropicdisease,yel-and)。yel-avd是一种引发肝脏和其它脏器急性爆发的感染，可导致60％的死亡率。而yel-and引发神经性疾患，可导致1-2％死亡率。从安全角度出发，本发明人利用细胞培养黄热病毒17d株，制备灭活疫苗，可杜绝yel-and和yel-avd的发生，并且避免了受试者因鸡胚导致的过敏反应。寨卡病毒自20世纪中期发现，主要在南美、非洲以及东南亚等热带地区流行，尚无疫苗保护。而2015年至2016年，在巴西由寨卡病毒引起的新生儿小头病多达上千例，引起巨大恐慌。随着我国经济水平的提高，人民群众出游前述地区商务及旅行的机会越来越多，亟需开发寨卡疫苗为国民健康保驾护航。目前还没有黄热病毒和寨卡病毒的联合灭活疫苗研制的报道。技术实现要素：本发明的目的是提供一种安全、有效预防寨卡病毒和黄热病毒感染的二联灭活疫苗。本发明提供的一种寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗含有寨卡病毒和黄热病毒，且两者病毒均灭活。进一步，本发明的寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗含有0.5-10ug/ml黄热病毒和0.5-10ug/ml寨卡病毒。优选地，本发明的寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗含有1-8ug/ml黄热病毒和1-8ug/ml寨卡病毒。更优选地，本发明的寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗含有3-6ug/ml黄热病毒和3-6ug/ml寨卡病毒。本发明的联合疫苗还含有0.25％-1％谷氨酸钠、0.5％-1％甘露醇、0.5％-1％甘氨酸氧化三甲胺及0.2％-0.62％氢氧化铝，所述％均为质量体积比。最终ph调节到7.0-8.0。本发明实施例所用的黄热病毒为黄热病毒17d，用于培养黄热病毒17d的宿主细胞为vero细胞。本发明提供一种寨卡病毒与黄热病毒联合灭活疫苗的制备方法，包括制备黄热病毒灭活液、制备寨卡病毒灭活液、将两种病毒灭活液按照蛋白含量进行稀释后混合，添加添加剂，使联合疫苗中含有0.5-10ug/ml黄热病毒和0.5-10ug/ml寨卡病毒。本发明的制备方法中，制备黄热病毒灭活液的方法包括以下步骤：(1)黄热病毒按照分种或混种的方式接种宿主细胞moi为0.01-1pfu/ml，培养温度25-37℃，细胞病变60％-100％时收获病毒液；(2)黄热病毒收获液澄清、超滤后得到浓缩液，采用两步层析法纯化浓缩液，得到黄热病毒纯化液；(3)黄热病毒纯化液过滤，调节ph值7.5-8.5，灭活即得。其中，步骤(1)中步骤(1)中黄热病毒按照分种或混种的方式接种宿主细胞moi为0.1-1pfu/ml；培养温度为33-37℃，细胞病变60％-85％时收获病毒液；步骤(3)中灭活是向黄热病毒纯化液中添加0.05-0.2％β丙内酯，于4℃下搅拌灭活20-26小时后，37℃水解2小时，得到黄热病毒灭活液。所述黄热病毒为黄热病毒17d，所述宿主细胞为vero细胞。本发明的联合灭活疫苗的制备方法中，制备寨卡病毒灭活液的方法包括以下步骤：(1)寨卡病毒接种宿主细胞moi为0.001-0.1ccid50/ml，培养温度25-35℃，待细胞病变25-35％收获80％的上清液，补加新鲜病毒培养液，继续培养至细胞病变45-55％，收获80％的上清液，补加新鲜病毒培养液，继续培养至细胞病变70-80％，收获80％的上清液，补加新鲜病毒培养液，继续培养至细胞病变90-100％，收获全部上清液；将前述4批上清液合并即为寨卡病毒的收获液；或待细胞病变45-55％，收获80％的上清液，补加新鲜病毒培养液，继续培养至细胞病变70-80％，收获80％的上清液，补加新鲜病毒培养液，继续培养至细胞病变90-100％，收获全部上清液；将前述3批上清液合并即为寨卡病毒的收获液；(2)寨卡病毒的收获液澄清、超滤，得到寨卡病毒浓缩液；采用两步层析法纯化浓缩液，得到寨卡病毒纯化液；(3)将寨卡病毒纯化液经0.22μm过滤，将ph调节至7.5-8.5之间，灭活即得。步骤(3)中灭活是向过滤后的寨卡病毒纯化液添加0.05-0.2％的β丙内酯在4℃下灭活20-26小时后水解，或向过滤后的寨卡病毒纯化液添加30-180ug/ml甲醛在22-28℃灭活96小时，去除甲醛，即为寨卡病毒灭活液。本发明的联合灭活疫苗的制备方法还包括将两种病毒灭活液按照蛋白含量进行稀释后混合，添加终浓度为0.2％-0.62％的氢氧化铝佐剂，0.5-1％谷氨酸、0.5-1％甘露醇、0.5-1％甘氨酸氧化三甲胺，调节ph到7.0-8.0。本发明的疫苗稳定性较好，理化性质稳定，两种免疫原无互相干扰，能够同时免疫寨卡病毒和黄热病毒，避免了减毒疫苗导致的感染和过敏反应，接种本发明的疫苗可以减少接种针次，简化免疫程序，操作上更加简洁，大大提高接种的覆盖率。同时可有效预防人及动物因上述病毒所致的疾病，覆盖更加广泛，免疫效果更好，具有良好的防控寨卡病毒和黄热病毒引起疾病的能力。本发明制备联合疫苗的方法简便，成本低，便于工业化大规模生产。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。如下所采纳的实施例使用了标准的技术，除非另有详细描述，为本领域技术人员众所周知且为常规技术。实施例是例证性的，但并不限制本发明。实施例1黄热病毒17d在vero细胞挑斑与适应性培养为了使黄热病毒17d更好地在vero细胞上适应生长，使用黄热病毒减毒活疫苗在vero细胞上挑斑培养。经冻干的黄热病毒17d减毒活疫苗用注射水恢复原体积。根据已知疫苗的病毒滴度，用无血清199培养液系列稀释病毒。将每一个稀释度的病毒接种在已形成单层细胞的6孔板中，每孔接种0.4ml，在37℃，5％co2培养箱中吸附1小时，然后加入无血清羧甲基纤维素工作液。培养一段时间后，在显微镜下选取蚀斑数少于3个的培养孔。用吸管吸取蚀斑，接种至单层的vero细胞上培养。待到细胞病变为60-100％时，收获病毒培养液，离心去细胞碎片，得到蚀斑第一代病毒种子。向蚀斑第一代病毒种子加入一定量的病毒保护剂，检测病毒滴度，保存于-80℃冰箱。将蚀斑第一代病毒种子依照上法进行第二次蚀斑筛选。经过三次蚀斑筛选，挑选出适用于疫苗生产的黄热病毒株。将黄热病毒17d按照0.01pfu/cell接种至已经单层的vero细胞表面。待细胞病变为75-85％时收获上清，分装冻存。记为p1代。将p1代按照0.01pfu/细胞接种至新鲜的单层vero细胞表面。待细胞病变为65-90％时收获上清，分装冻存。记为p2代。如此进行黄热病毒在vero细胞上的适应性培养，在vero细胞上共适应培养15代。实施例2黄热病毒17d在vero细胞上不同代次的滴度和免疫原性比较1、挑选在vero细胞上适应性传代的第1、4、7、10、13、15代进行病毒滴定试验。用199细胞维持液体系列稀释病毒，选择3个适宜稀释度的病毒液，接种至细胞已形成单层的6孔板中。每个稀释度病毒接种2孔，设立2孔细胞对照。在37℃、5％co2培养箱内吸附1小时，然后每孔添加羧甲基纤维素使用液4ml，继续在培养箱中培养。6天后取出培养板，倒掉覆盖物，加入1％结晶紫染液染色，用自来水漂洗、晾干。对蚀斑数少于30个的孔内的蚀斑计数，计算出pfu。病毒滴度的单位为lgpfu/ml。病毒滴度结果如表1所示，使用vero细胞连续传代培养的黄热病毒滴度远高于在黄热病毒在vero细胞上适应第一代病毒的滴度。表1黄热病毒传代滴度(lgpfu/ml)2、对黄热病毒的免疫原性研究分别采用家兔和小鼠来评价(1)家兔免疫原性实验将黄热病毒在vero细胞上传代的第1、4、7、10、13、15代稀释至6.50lgpfu/ml,将vero细胞悬液加入病毒保护剂，作为阴性对照，将2批鸡胚疫苗作为阳性对照(批号分别为10140101，10140102)，稀释至6.50lgpfu/ml，分别免疫家兔(皮下免疫2次，每次1ml，间隔1周)，即采用0，7天免疫程序，分别于免前和第二次免疫后28天采血，黄热病毒疫苗免疫前的兔血清稀释度为1:5，免疫后的兔血清的起始稀释度为1:10，然后进行倍比稀释。免疫前及免疫后的阴性对照兔血清稀释度均为1:5。将稀释后的兔血清于65℃灭活30分钟。用prnt法测定血清中和抗体效价。将灭活的兔血清分别于3批稀释至4000pfu/ml的鸡胚疫苗等量混合，同时设立病毒对照，并将黄热病毒(17d)猴免疫血清系列稀释后与病毒混合，作为质量控制血清对照。37℃中和后接种vero细胞和bhk-21细胞，吸附后添加羧甲基纤维素。6天后染色计数。与病毒对照相比，蚀斑数减少50％以上的抗血清最高稀释度为血清中和抗体效价。结果显示vero细胞传代的黄热病毒17d株第1、4、7代免疫家兔后，其免疫血清可中和源于同一工作种子批的3批鸡胚黄热减毒活疫苗，不同代次病毒免疫的血清中和抗体效价均高于1:1280。随着代次的增加，中和抗体效价逐渐升高，最高升至1:5120。经vero细胞传代的第10代黄热疫苗病毒与统一批号的鸡胚黄热疫苗病毒免疫家兔后，二者血清中和抗体效价无显著差异(p＞0.05)，10代之后逐渐趋于稳定。结果如表2所示。表2家兔免疫原性试验(2)黄热病毒小鼠免疫原性试验将第1、4、7、10、13、15代黄热病毒疫苗和2批鸡胚疫苗稀释至6.50lgpfu/ml，后者作为阳性对照。将vero细胞悬液，vero细胞培养液上清、疫苗稀释液各加入病毒保护剂，作为阴性对照。分别免疫小鼠，每组10只，免疫2次，每次腹腔注射0.5ml，皮下0.1ml，间隔1周，即采用0，7天免疫程序。另外设立未免疫的小鼠作为空白对照。上述实验组和对照组分别于免疫前和第2次免疫后4周采血。由结果可知，黄热疫苗病毒17d株第1、4、7代免疫小鼠后，其免疫血清可中和源于同一工作种子批的3批鸡胚黄热减毒活疫苗病毒，不同代次的vero细胞黄热疫苗中和抗体效价均高于1：640。随着代次的增加，中和抗体效价逐渐升高，最高升至1:2560。但是与免疫家兔产生的中和抗体相比，小鼠血清中和抗体效价略低，这可能与不同种属动物对黄热病毒的敏感性不同有关。结果如表3所示。表3小鼠免疫原性实验实施例3黄热病毒17d在vero细胞上的培养优化为确定黄热病毒在vero细胞上的最佳培养条件，发明人依据接种方式、接种moi、培养温度以及收获时间，采用jmp10软件进行试验设计。各个因子的水平分别如下，接种方式为分种和混种，接种moi为1、0.1、0.01pfu/ml，病毒培养温度为33-37℃，收获时间为病变25％、50％、75％、100％。采用黄热病毒的病毒滴度结果，确定最优的试验条件。试验设计及结果如表4所示：表4黄热病毒培养条件优化结果温度(℃)moi(pfu/ml)病变程度病毒滴度330.010.256.993310.57.6437117.2370.010.57.273310.757.68330.0116.47330.117.47370.010.757.963310.256.99370.10.257.6837117.23710.257.38经jmp10计算得出，cpe是关键工艺参数，最适合收获为细胞病变60-85％之间。33℃和37℃培养无明显区别。接种moi在0.01-1pfu/ml之间区别不大。故本实验条件为按照moi为0.01-1pfu/ml将黄热病毒接种至单层的vero细胞上，33-37℃培养至细胞病变为60-85％时收获培养上清。实施例4黄热病毒灭活疫苗的纯化将vero细胞在cytodex1上培养至单层后，在moi为0.01-1pfu/ml的范围内接种黄热病毒工作种子，37℃培养至细胞病变80％，收获细胞上清作为病毒收获液。病毒收获液经过澄清、超滤浓缩后采用0.1％β丙内酯在室温条件下灭活16小时，水解β丙内酯之后得到黄热病毒灭活液。将黄热病毒灭活液经过两步纯化法，分别去除杂质蛋白和宿主细胞核酸后，得到黄热病毒纯化液。实施例5寨卡病毒的筛选将寨卡病毒种子在vero细胞上适应生长至第15代，挑选第1、4、7、10、13、16代分别进行病毒滴度测定，分别用细胞法和elisa法测定小鼠中和抗体滴度。结果采用spss17.0软件进行数据分析，计量资料以(x±s)表示，根据需要采用方差分析和t检验，p＜0.05，具有统计学意义。结果如表5所示，根据结果，本发明选择第10代寨卡病毒的原始种子，并建立主病毒种子和工作病毒种子，主病毒种子代次为13代，工作病毒种子代次为15代。表5寨卡病毒z-3各代次病毒滴度(lgccid50/ml，x±s，n＝3)和中和抗体滴度实施例6寨卡病毒疫苗的培养工艺1、在cytodex1上培养vero细胞单层后，按照moi为0.001-0.1ccid50/ml接种寨卡病毒工作种子，培养至细胞出现30％病变后，收获上清，置于2-8℃。补加新鲜病毒培养液，继续培养24-60小时，待细胞出现50％病变后，再次收获上清，置于2-8℃。补加新鲜病毒培养液，继续培养至细胞出现75％病变后，收获上清，置于2-8℃。补加新鲜病毒培养液，至细胞出现病变达到85-100％，收获上清。合并上述多次收获的上清液，即为寨卡病毒收获液，放置于2-8℃暂存，即为001批。2、在cytodex1上培养vero细胞单层后，按照moi为0.001-0.1ccid50/ml接种寨卡病毒工作种子，培养至细胞出现30-40％病变，收获80％上清，置于2-8℃。补加新鲜病毒培养液。继续培养至细胞出现病变达到60-75％病变，收获80％上清，置于2-8℃。补加新鲜培养液，继续培养至细胞出现85-100％病变，收获全部上清。合并上清液，即为寨卡病毒收获液，放置于2-8℃暂存，即为002批。3、在cytodex1上培养vero细胞单层后，按照moi为0.001-0.1ccid50/ml接种寨卡病毒工作种子，培养至细胞出现50％病变，收获80％的上清，置于2-8℃。补加新鲜病毒培养液，继续培养至细胞出现病变达到85-100％，收获上清，合并收获液。即为寨卡病毒收获液，放置于2-8℃暂存，记为003批。4、在cytodex1上培养vero细胞单层后，按照moi为0.001-0.1ccid50/ml接种寨卡病毒工作种子，培养至细胞出现85-100％病变，收获上清，即为寨卡病毒收获收获液，放置于2-8℃暂存，记为004批。比较上述四种方法获得的病毒收获液的病毒滴度(重复三次)，确定最佳培养方法。如表6所示，001批和002批的收获液的滴度最高，同时收获液的体积也最大，故选择四次收获或三次收获的方法均能达到较好的结果。表6不同收获方式的寨卡病毒滴度比较(lgccid50/ml)批次病毒滴度(lgccid50/ml)收获液体积(一个发酵罐体积)0018.1±0.09≈40028.25±0.12≈30047.8±0.17≈20037.7±0.191本发明选择第002批的寨卡病毒培养工艺，根据不同的细胞病变程度共收获4次，最大程度上提高了收获体积，并保证了收获液单位体积内病毒滴度的含量。实施例7寨卡病毒疫苗的纯化工艺寨卡病毒培养液经澄清和超滤后得到寨卡病毒超滤浓缩液，后经两步层析得到寨卡病毒纯化液。第一步层析为去除杂质蛋白的凝胶过滤层析，第二步层析为去除杂质核酸的离子交换层析。凝胶过滤层析可选用的填料为gesepharose4fastflow、sepharose4fastflow、sephacryls-300hr、sephacryls-400hr和sephacryls-500hr等分离范围合适、易于放大的高通量高载量填料。离子交换层析可选用的填料为gedeae、cm以及anx等填料。具体操作如下所示。(1)首先将寨卡病毒疫苗浓缩液经过层析柱过滤层析，紫外检测波长为280nm，流速为6cm/h，流动相为ph7.4的10mmol/lpbs(nacl0.2-0.6mol/l)，收集第一个吸收峰，即寨卡病毒蛋白初纯液。(2)用10mmol/lpbs(nacl0.2-0.6mol/l)平衡阴离子层析柱至紫外、电导平衡，流速3cm/h。(3)将寨卡病毒初纯液按2被柱床体积加载到离子交换层析介质中，宿主核酸牢固吸附在阴离子层析介质上，而寨卡病毒蛋白于离子交换介质的结合点被缓冲液中的离子取代，直接穿透，紫外检测波长为280nm，收集吸收峰。(4)当样品全部加载后，继续用10mmol/lpbs(nacl0.2-0.6mol/l)缓冲液洗涤离子交换层析柱2倍柱床体积，知道紫外吸收值降到基线，收集的流传峰为最终纯化液。经两步层析法后，蛋白去除率平均大于99.9％dna去除率平均大于99.9％。时间结果如表6所示。表6杂质蛋白和宿主dna去除率实施例8寨卡病毒疫苗的灭活工艺采用两种灭活方法灭活寨卡病毒超滤浓缩液，一种为终浓度0.025％β丙内酯4℃灭活，另一种为30-180ug/ml甲醛25±3℃灭活，分别于0、6、12、24、36、48、72、96小时取样，检测病毒滴度，结果采用spss17.0软件进行数据分析，以(x±s)表示，根据需要采用方差分析和t检验，以p＜0.05为差异有统计学意义。结果如表7所示，甲醛灭活6小时后，病毒滴度开始下降，24小时后大多数病毒已经被灭活，48小时后未检测出病毒滴度。β-丙内酯灭活12小时后即检不出病毒。取β丙内酯灭活24小时，甲醛灭活96小时的样品，接种vero细胞，盲传三代，验证病毒灭活效果。结果显示两种灭活方法灭活的病毒均不会引起vero细胞病变效应。将甲醛和β丙内酯灭活的寨卡病毒(含有5μg蛋白)，同时设立未灭活的寨卡病毒超滤浓缩液(含有5μg蛋白)和pbs阴性对照，按照0，14天免疫，28天采血的程序免疫小鼠，通过检测elisa血清抗体滴度来确定灭活寨卡病毒诱发小鼠产生抗体的水平。灭活的寨卡病毒的免疫原性检测结果如表8所示，甲醛、β丙内酯和灭活前超滤液引发小鼠的抗体滴度相当，无显著差异。3次重复结果相似。表7甲醛和β丙内酯灭活不同时间寨卡病毒滴度(lgccid50/ml，x±s，n＝3)注:“-”表示未检测出感染性滴度表8甲醛和β丙内酯灭活诱发小鼠抗体滴度比较灭活方法抗体滴度甲醛18066.67±6609.86β丙内酯21500.00±13063.87超滤液22533.33±14368.89实施例9灭活寨卡疫苗的攻毒保护为评价寨卡疫苗的有效性，将实施例8制得的寨卡疫苗接种免疫缺陷小鼠，免疫程序为0，14免疫，28天后并用106tcid50的zikv/homosapiens/pri/prvabc59/2015株腹腔攻击，观察小鼠的存活情况。本次试验设置为阴性对照组、供试品1组和供试品2组，阴性对照组采用氢氧化铝溶液3mg/ml，供试品1组含有2ug/ml的寨卡疫苗，供试品2组含有1ug/ml的寨卡疫苗，每组10只免疫缺陷小鼠。实验结果如表9所示。表9灭活寨卡疫苗的攻毒保护实验设计攻毒后，观察12天小鼠的体重变化及存活状况，供试品1组和2组全部存活，对照组第8天死亡6只，第9天全部死亡。本实验证明，本发明创造的寨卡病毒灭活疫苗可以保护免疫缺陷的小鼠免受寨卡病毒的攻击，具有良好的保护性。实施例10联合疫苗配比工艺实施例8制得的寨卡病毒灭活液和实施例4制得的黄热病毒灭活液按照蛋白含量进行稀释后，混合、添加稳定剂后，使得寨卡病毒蛋白含量为4ug/ml，黄热病毒蛋白含量为4ug/ml，添加0.2％((w/v)的氢氧化铝佐剂以及0.5％-1％谷氨酸、0.5％-1％甘露醇、0.5％-1％甘氨酸氧化三甲胺，调节ph到7.5。以上％均为质量体积比。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12