TNFSF15蛋白在制备治疗黑色素瘤药物中的用途的制作方法

本发明涉及医药领域，特别涉及tnfsf15蛋白在制备治疗黑色素瘤药物中的用途，以及与顺铂联用制备治疗黑色素瘤药物中的用途。

背景技术：

恶性黑色素瘤(malignantmelanoma,mm)是由于遗传因素、环境因素共同影响而引起的一种发生在皮肤或者其他器官黑色素细胞的肿瘤。本病临床表现为压痛、瘙痒、出血、溃疡等，老年人症状较年轻人为重。这种恶性肿瘤的增长速度要比其他类型的快很多，在过去的30年中，美国恶性黑色素瘤的发生率增长了一倍。世界卫生组织报道，每年在全世界范围内有132,000例此类的恶性肿瘤被确诊。如果恶性黑色素瘤可以在早起被诊断出来，可以通过外科手术切除肿瘤，有80％的病例通过此方式治疗。然而对于现有的治疗手段来说转移性黑色素瘤是十分顽固难以治疗的，病人的预后也会很差，这部分病人的六个月及5年的平均存活率都低于5％。因此新的治疗策略亟待开发。

化疗在恶性黑色素瘤治疗中占有重要的地位。对于病程中晚期或具有高危因素的早期病变应予以区域性或者全身性化学药物治疗。化疗可用于手术前后，放疗前后，或与放疗同时进行，从而提高疗效。目前化疗药物主要有达卡巴嗪(dacarbazine，氮烯咪胺，dtic)、卡莫司汀(sarmustine，bcnu)、长春新碱(vincristine，vcr)、美法兰(melphalan，mel)、放线菌素d和顺铂(cisplatin，ddp)等。顺铂(ddp)是目前临床上多种化疗方案中的主要药物之一，可通过与癌细胞脱氧核糖核酸(dna)发生交叉联结，诱导肿瘤细胞的凋亡而起抗癌作用。黑色素瘤细胞对于化疗药物相对不敏感，联合化疗方案反应率优于单一药物。所以寻找与ddp联用的药物，可以增强ddp对于黑色素瘤细胞的杀伤作用，并且减少ddp带来的毒副作用，对于黑色素瘤的治疗有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供了tnfsf15蛋白在制备治疗黑色素瘤药物中的用途。

本发明的另一目的是提供了tnfsf15蛋白和顺铂联用在制备治疗黑色素瘤药物中的用途。

本发明采用的技术方案为：

本发明提供了tnfsf15蛋白在制备治疗黑色素瘤药物中的用途。

进一步，在该用途中，将治疗有效量的tnfsf15蛋白与药学上可接受的载体和/或赋形剂混合制成组合物。

本发明还提供了tnfsf15蛋白和顺铂联用在制备治疗黑色素瘤药物中的用途。

进一步，在该用途中，将治疗有效量的tnfsf15蛋白、顺铂与药学上可接受的载体和/或赋形剂混合制成组合物。

优选地，上述用途中，所述的tnfsf15蛋白是由包括如下步骤的纯化方法制备得到的：

(1)表达诱导

a)将表达菌株在含有氨苄抗性的lb平板上划线，在37℃下培养12h；

b)接种环挑取单克隆，在5ml含有氨苄抗性的lb培养基中37℃，220rpm在扩增12h。

c)将扩增所得菌液1:100加入到含有氨苄抗性的lb培养基中，37℃，220rpm条件下使细菌生长至对数生长期，od值0.6～0.8；

d)将菌液置于4℃静置30min；

e)静置后加入终浓度为50μm的iptg，16℃，220rpm诱导24h。

(2)菌体裂解

a)4℃，8000rpm离心10min收集菌体；

b)每200ml菌液加25ml裂解液，用630-0561号探头，超声1s，暂停1s，30％的功率冰上超声1min，共2次；

c)再加入5ml10％tritonx-100，同样的时间间隔和功率冰上超声1min，共2次；

d)将菌液置于冰上静置30min；

e)静置后的菌液4℃，5000rpm离心30min分离获得裂解上清液；

(3)上柱洗脱

a)10倍柱体积ddh2o冲洗镍柱，5倍柱体积平衡液平衡镍柱；

b)将裂解上清液和ni-agarose以体积比为2:1的比例4℃100rpm充分混合2h；

c)将混合好的溶液上柱，4℃收集流出液；

d)流出液全部流出后，加入8倍柱体积的清洗液4℃洗涤杂蛋白；

e)用4倍柱体积的洗脱液4℃洗脱，分别收集前2体积和后2体积的洗脱液。

(4)除盐分装

a)采用以下两种方式中的一种进行除盐：

方式一：将收集到的蛋白装入透析袋，蛋白和透析液以1:100的体积比在4℃进行透析，磁子的搅拌速度为200rpm，每次透析3h，透析2次；

方式二：将收集到的蛋白与换盐液以1:1的比例混合，加入换盐柱，4℃，5000rpm离心15min。收集换盐柱上层的溶液，重复上述操作10次。

b)所得蛋白使用0.22μm滤膜过滤除菌，分装，-80℃保存。

进一步，所述的步骤(1)中的表达菌株为：表达目的蛋白为vegi-192亚型，含有192个氨基酸，采用的载体质粒为pet-21b(+)，表达感受态为bl21(de3)，所得表达菌株为氨苄抗性。

进一步，所述的步骤(2)中的裂解液为nacl20mm，tris-cl10mm，十二烷基肌氨酸钠50mm，ph7.9。

进一步，所述的步骤(3)中平衡液为50mmnah2po4，300mmnacl，ph8.0；清洗液为50mmnah2po4，300mmnacl，20mm咪唑，ph8.0；洗脱液为50mmnah2po4，300mmnacl，250mm咪唑，ph8.0。优选地，所述平衡液、清洗液、洗脱液均在使用前预冷到4℃，所有操作过程也在4℃冰箱内进行。

进一步，所述的步骤(4)中透析液和换盐液均为pbs缓冲液，ph8.0，预冷到4℃使用。

本发明纯化方案通过低温诱导的方式，并且以很低的iptg诱导浓度，降低蛋白在包涵体中的表达，提升可溶性蛋白的含量，并用较为温和的裂解纯化方式，提高蛋白的稳定性和活性。并且操作简便，制作周期短，消耗资源少，方便放大生产。

本发明所具有的有益效果：

本发明发现tnfsf15可以抑制小鼠黑色素瘤细胞b16的生长和迁移，诱导细胞凋亡。

本发明发现应用tnfsf15联合化疗药物治疗黑色素瘤时，tnfsf15不但可以通过抑制肿瘤血管的生成来抑制肿瘤的生成，而且可以通过诱导黑色素瘤细胞凋亡，增强化疗药物对于黑色素瘤细胞的杀伤作用。最后，我们发现tnfsf15在与常用于治疗黑色素瘤的化疗药物顺铂的联合应用时，可以增强顺铂治疗黑色素瘤的效果。

附图说明

图1左图是b16细胞在不同浓度tnfsf15影响下划痕实验的结果，右图是对此次实验中细胞迁移距离的统计结果。

图2是不同浓度tnfsf15刺激下b16细胞cleaved-caspase3蛋白表达情况。

图3左图是浓度为5μg/ml的tnfsf15蛋白对于b16细胞的生长抑制检测，右图是ddp与ddp+5μg/mltnfsf15对于b16细胞生长抑制曲线。

图4左图是ddp组/tnfsf15组/ddp+tnfsf15组/buffer组c57bl/6j黑色素瘤荷瘤小鼠肿瘤体积统计结果。右图是开始注射药物7天后处死小鼠取出黑色素瘤，检测其重量所得统计结果。

具体实施方式

为了理解本发明，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。

实施例1：tnfsf15抑制小鼠黑色素瘤细胞b16的迁移能力

a)b16细胞在37℃，5％co2的条件下培养生长到对数期，消化，计数，铺到6孔板中，每孔5x10⁵个细胞，贴壁12h，使细胞的融合度接近100％；

b)用黄色枪头垂直于孔板沿着尺子划线，每孔每隔0.5cm一条线，每孔三条，用pbs冲洗两次，冲洗掉未贴壁细胞；

c)每孔加入2ml无血清培养基，白光下用10x物镜10x目镜拍照，记录下0h下划痕宽度；

d)加入终浓度分别为0，10，25，50μg/ml的tnfsf15，在37℃，5％co2的条件下培养24h；

e)白光下用10x物镜10x目镜拍照，记录下24h下划痕宽度。

结果如图1所示，通过图1可以看到tnfsf15浓度从10μg/ml开始，就可以明显抑制b16细胞在孔板上的迁移能力，细胞的迁移距离降低了16.08％。提高蛋白浓度，tnfsf15对于b16细胞的迁移能力的抑制更是有显著提升，25μg/ml和50μg/ml浓度下的迁移抑制率分别为75.11％和78.37％。证明tnfsf15可以显著抑制小鼠黑色素瘤细胞b16的迁移能力。

实施例2tnfsf15诱导小鼠黑色素瘤细胞b16凋亡

a)b16细胞在37℃，5％co2的条件下培养生长到对数期，消化，计数，铺到12孔板中，每孔2.5x10⁴个细胞，贴壁12h。

b)加入终浓度分别为0，1，5，10μg/ml的tnfsf15，在37℃，5％co2的条件下培养48h。

c)提取细胞总蛋白：去掉细胞培养基，快速将细胞用预冷的pbs洗3次；加入每孔预冷的蛋白裂解缓冲液100μl(50mmtris-hcl.ph7.4,1％np-40,150mmnacl,1mmedta,1mmpmsf)，用细胞刮刀辅助裂解细胞；收集液体混合物离心管中，冰上孵育30分钟；4℃，20000g离心30min；取上清，用bca法测定蛋白浓度，使用westernblotting法检测细胞中cleaved-caspase3的蛋白水平。

d)westernblotting法为：1)取每个样品10μg蛋白，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(分离胶浓度12％)；电压60v，0.5小时压平条带，升高电压至120v，电泳1.5h；2)电泳后，拆卸凝胶装置，并取出凝胶，放置在转膜缓冲液中浸泡1分钟；3)取甲醇激活后的pvdf膜，将浸泡后的凝胶、pvdf膜、支撑滤纸、海绵等贴合压紧，装入转膜装置中；4)100v恒压，4℃转膜2小时；5)转膜结束后，取出pvdf膜，用tbst缓冲液振荡洗涤3次，每次5分钟；6)使用含5％脱脂奶粉的tbst溶液封闭，常温，1小时；7)加入caspase3抗体(1:2000)，4℃，过夜反应；8)吸去抗体，用tbst清洗6次，每次5分钟；9)加入hrp标记的抗兔第二抗体(1:5000)，37℃，1小时；10)吸去抗体，用tbst清洗6次，每次5分钟；11)在天能凝胶成像仪上将荧光显色底物混合液加到pvdf膜上孵育30s，选取适宜的曝光时间，保存曝光结果。(β-actin作为内参，操作过程相同)

结果如图2所示，可以看到在加入了tnfsf15后，b16细胞cleaved-caspase3蛋白表达显著升高。caspase3是一个重要的凋亡执行蛋白，在很多关键性蛋白的酶切过程中它都有或多或少的参与，cleaved-caspase3是caspase3的经过剪切后获得的活性状态。所以tnfsf15可以上调b16细胞cleaved-caspase3的表达，证明tnfsf15可以诱导b16细胞的凋亡。

实施例3tnfsf15可以抑制b16细胞生长，并且提高顺铂对于b16细胞生长的抑制能力

a)b16细胞在37℃，5％co2的条件下培养生长到对数期，消化，铺到96孔板中，每孔10³个细胞，贴壁12h。

b)ddp组/ddp+tnfsf15组分别加入不同浓度的ddp和终浓度为5μg/ml的tnfsf15蛋白。ddp具体浓度如下表，每个浓度梯度4个复孔。

37℃，5％co2的条件下刺激72h。

c)弃去孔板内的培养基，pbs清洗2次，每孔加入含有终浓度为0.5μg/mlmtt的无血清培养基。37℃5％co2孵育6h。

d)弃去含有mtt的培养基，pbs清洗2次，每孔加入150μl的dmso。在37℃的摇床上200rpm溶解10min。

e)96孔板在酶标仪上检测其在570nm下的吸光度，制作细胞生存曲线，计算ic50。

结果如图3所示，左图是浓度为5μg/ml的tnfsf15蛋白对于b16细胞的生长抑制检测，该浓度的tnfsf15对于b16细胞生长的抑制程度为12.01％。右图是ddp与ddp+5μg/mltnfsf15对于b16细胞生长抑制曲线，ddp组ic50为22.88μm，ddp+5μg/mltnfsf15组ic50为6.763μm。证明了tnfsf15可以抑制b16细胞的生长，并且使用了tnfsf15蛋白后可以显著提高顺铂对于b16细胞的生长抑制作用。

实施例4tnfsf15与顺铂的联合应用，增强顺铂对于小鼠黑色素瘤的杀伤能力

a)b16细胞在37℃，5％co2的条件下培养生长到对数期，消化，稀释到无血清的dmem培养基中，浓度为5x10⁶/ml。

b)8周c57bl/6j雌鼠分为4组(ddp组/tnfsf15组/ddp+tnfsf15组/buffer组)，每组7只。

c)每只小鼠皮下注射100μl5x10⁵的b16细胞。

d)接种细胞后第10天，肿瘤大于100mm³，开始每2天进行一次腹腔注射给药，给药剂量为：

ddp组：顺铂5mg/kg

tnfsf15组：tnfsf155mg/kg。

ddp+tnfsf15组：顺铂溶解于tnfsf15溶液中，顺铂5mg/kg，tnfsf155mg/kg。

buffer组：按照与以上三组同样的计算方式注射一定体积的buffer液。

e)每2天检测肿瘤的长与宽，肿瘤体积计算方式为：长x宽²/2。

f)给药后第7天，取出小鼠肿瘤，检测肿瘤体积和质量。

结果如图4所示，无论是从肿瘤体积还是从肿瘤的质量上来看，tnfsf15可以都可以在一定程度上抑制小鼠黑色素瘤的生长，并且可以显著增加顺铂对于小鼠黑色素瘤生长的抑制效果。