专利名称：一种预防和/或治疗黑色素瘤的药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种预防和/或治疗黑色素瘤的药物。
背景技术：
黑色素瘤是一种来源于皮肤组织的恶性肿瘤，约占所有肿瘤的3 %，位于皮肤癌症的第三位。黑色素瘤具有转移性强，死亡率高等特点，是恶性程度最高的一类实体肿瘤。目前，除了达卡巴嗪之外，几乎没有治疗黑色素瘤的有效药物。研究表明，细胞中内质网(ER)的功能障碍和多种人类疾病(包括癌症)有关，肿瘤细胞的发生过程中经常长期伴随着内质网压力等微环境的存在。特殊的微环境因素可能为肿瘤细胞提供了一个“避难所”，介导了肿瘤获得性耐药和细胞凋亡抗性的发生，而目前最重要的新观念就是通过瞄准肿瘤微环境来治疗肿瘤。复制缺陷型腺病毒介导的基因治疗目前在国际具有广阔的应用前景，其生物安全性和治疗效果均被广泛证实。我国自主开发的国家一类新药——人重组P53腺病毒注射液 (商品名今又生)作为世界首个基因治疗药物已获准上市。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种RNA及其编码基因。本发明的RNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。表达上述RNA的重组载体，表达上述RNA的重组病毒，含有上述编码基因的重组载体、含有上述编码基因的重组菌、含有上述编码基因的重组病毒或含有上述编码基因的转基因细胞系也属于本发明的保护范围。所述重组载体按照如下方法制备得到将SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示DNA 分子退火，将退火产物连接到慢病毒载体LentiLox 3. 7上，得到的重组载体即为所述重组载体。本发明的另一个目的是提供一种具有如下1)至5)中任一所述功能的产品。本发明所提供的具有如下1)至5)中任一所述功能的产品，其活性成分为上述 RNA、上述RNA的编码基因、表达上述RNA的重组载体，表达上述RNA的重组病毒，含有上述编码基因的重组载体、含有上述编码基因的重组菌、含有上述编码基因的重组病毒或含有上述编码基因的转基因细胞系；1)预防和/或治疗肿瘤的功能；2)促进肿瘤细胞凋亡的功能；3) TM作用下促进肿瘤细胞凋亡的功能；4)降低肿瘤细胞成瘤能力的功能；5)抑制microRNA149*表达的功能。上述产品中，所述肿瘤为黑色素瘤；所述microRNA149*的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
上述RNA、上述RNA的编码基因、表达上述RNA的重组载体，表达上述RNA的重组病毒，含有上述编码基因的重组载体、含有上述编码基因的重组菌、含有上述编码基因的重组病毒或含有上述编码基因的转基因细胞系在如下1)至5)中任一所述中的应用也属于本发明的保护范围1)制备预防和/或治疗肿瘤的产品；2)制备促进肿瘤细胞凋亡的产品；3)制备TM作用下促进肿瘤细胞凋亡的产品；4)制备降低肿瘤细胞成瘤能力的产品；
5)制备抑制microRNA149*表达的产品。上述应用中，所述肿瘤为黑色素瘤；所述microRNA149*的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。microRNA149*作为靶点在开发预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用也属于本发明的保护范围。该应用中，所述肿瘤为黑色素瘤；所述micr0RNA149*的核苷酸序列如SEQ ID NO 1 所示。本发明的最后一个目的是提供一种开发预防和/或治疗肿瘤的药物的方法。本发明所提供的开发预防和/或治疗肿瘤的药物的方法，包括如下步骤以 microRNA149*为靶点，开发具有如下1) _3)中的至少一种功能的物质，进而得到预防和/或治疗肿瘤的药物；1)抑制 microRNA149* 表达；2)抑制 microRNA149* 功能；3)抑制microRNA149*介导的信号通路；上述方法中，所述肿瘤为黑色素瘤；所述microRNA149*的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。在黑色素瘤生存的过程中长期伴随内质网压力的环境，只有适应这种环境不死亡，才能继续成瘤，而我们发现的micr0RNA149*就是促进其适应内质网环境的因子，抑制掉其之后，就会更容易凋亡。实验证明，micr0RNA149*与黑色素瘤的形成有关，它的高表达能促进黑色素瘤适应内质网压力，从而有利于黑色素瘤的形成；而且在内质网压力刺激下， microRNA149*在其它肿瘤中表达量并不升高，说明microRNA149*具有黑色素瘤特异性。本发明进一步开发了一种抑制microRNA149*的分子，实验证明，将microRNA149*作为靶点， 抑制microRNA149*的表达，逆转了黑色素瘤细胞对内质网压力微环境的耐受性，减弱了黑色素瘤的成瘤效应。因此，micr0RNA149*可以作为一个新的靶点，用于开发治疗黑色素瘤的新的药物。并且本发明的抑制分子可以作为一种治疗黑色素瘤的药物。
图1为黑色素瘤细胞和黑素细胞对内质网压力的响应。图2为TM作用下多种黑色素瘤细胞中microRNA149*表达情况。图3为TM作用下不同组织肿瘤细胞中microRNA149*表达情况。图4为新鲜的黑色素瘤病例与正常的黑色素细胞中microRNA149*表达情况。图5为TM作用下检测黑色素瘤细胞中caSpaSe3/7活性水平。
图6为抑制microRNA149*对黑色素瘤细胞拮抗内质网压力的影响。图7为microRNA149的抑制效果。
图8为抑制microRNA149*对裸鼠体内移植成瘤的影响。图9为裸鼠体内成瘤实验中，肿瘤的重量统计情况(η = 6)。图10为裸鼠体内成瘤实验中，肿瘤细胞的microRNA149*表达情况(η = 6)。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。结肠癌HCTl 16细胞株购自ATCC，产品目录号为CCL-247 。骨肉瘤U20S细胞株购自ATCC，产品目录号为ΗΤΒ-96 。肺癌Η1299细胞株购自ATCC，产品目录号为CRL-5803 。黑色素瘤细胞株Mel-RM和正常黑色素细胞(Melanocyte)文献出处Apoptosis of human melanoma cells induced by inhibition of B-RAFV600E involves preferential splicing of bimS. Cell Death and Disease (2010) 1, e69。公众可从中国科学技术大学获得。实施例1、microRNA149*的发现及功能一、黑色素瘤细胞和黑色素细胞对内质网压力的响应方法衣霉素(Timicamycin，简写TM)是常见的诱导内质网压力的药物，用其模拟肿瘤内部的内质网压力微环境。随着3μ M衣霉素作用时间的延长，收集细胞，用Trizol 试剂(美国Invitrogen公司)抽提总RNA，逆转录试剂盒(中国Tiangen公司)逆转录小 RNA,并通过实时荧光定量PCR方法检测黑色素瘤细胞及黑色素细胞中microRNA149*的表达量。逆转录引物 miR-149* :5’ > GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACG ACGCACAGC < 3，；检测引物上游引物 miR-149* :5，> GTTAGGGAGGGACGGG < 3，；下游引物 miR-149* 5' > CAGTGCGTGTCGTGGAGT < 3。结果如图1所示。结果表明，随着药物作用时间延长(即内质网压力的刺激增强)， 实时荧光定量PCR结果显示该小分子microRNA149*仅在黑色素瘤细胞株Mel-RM中高表达，而在正常的黑色素细胞中含量很低，且不响应内质网压力的刺激。图2是不同的黑色素瘤细胞株在衣霉素作用12小时后，通过同样的方法检测 microRNA149*的表达情况。结果标明除了 ME4405细胞株外，其他6株黑色素瘤细胞株中 microRNA149*表达均响应内质网压力的刺激。microRNA149氺的序歹Ij 5' > agggagggacgggggcugugc < 3， (SEQ ID NO 1) 0二、microRNA149*(miRNA)的组织特异性( 一 )不同肿瘤细胞中microRNA149*表达情况方法用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取不同肿瘤细胞中的总RNA，逆转录试剂盒(中国Tiangen公司)逆转录小RNA，并通过荧光定量PCR方法检测microRNA149*表达。DMSO组指细胞用DMSO(二甲基亚砜)溶剂处理12h。TM组指细胞用浓度为3 μ M(TM) 的衣霉素处理12h。细胞如下=Mel-RM细胞株(黑色素瘤)，B组为HCTl 16细胞株(结肠癌)，C组为U20S细胞株(骨肉瘤)，D组为H1299细胞株(肺癌)。结果如图3所示，显示在不同组织来源的肿瘤细胞中，内质网压力仅使Mel-RM(黑色素瘤)和HCTl 16 (结肠癌)中microRNA149*水平发生上调。 ( 二)新鲜的黑色素瘤病例与正常的黑色素细胞中microRNA149*表达情况正常的黑色素细胞和新鲜的黑色素瘤组织均来自医院检查后剩余的组织，均经过患者的同意。方法用Trizol试剂(invitrogen公司)提取新鲜的黑色素瘤组织和正常的黑色素细胞中的总RNA，逆转录试剂盒(中国Tiangen公司)逆转录小RNA，并通过荧光定量PCR 方法检测microRNA149*表达。结果如图4所示(图4中，1表示正常的黑色素细胞，2-61表示新鲜的黑色素瘤病例)。在新鲜的黑色素瘤病例中(2-61)microRNA149*的表达水平明显比正常的黑色素细胞中(1)高，可以提高肿瘤适应内质网压力微环境的能力。在正常的黑色素细胞中该小分子表达量很低，说明该小分子RNA microRNA149*具有肿瘤特异性。三、microRNA149*的功能及抑制 microRNA149* 的片段对照分子(Scramble):5，> CAGUACUUUUGUGUAGUACAA < 3，；人工合成得到。抑制分子(抑制microRNA149* 的分子)5，> GCACAGCCCCC⑶CCCUCCCU < 3，(SEQ IDNO 2)；人工合成得到。转染 Mel-RM 方法按照 Thermo Scientific DharmaFECT Duo Transfection Reagent for miRIDIAN microRNA Mimics/Inhibitors and Plasmid Co-Transfection转染试剂标准步骤转染。Mel-RM细胞的培养基DMEM+10%胎牛血清；培养条件37°C，5%二氧化碳。衣霉素(TM)购自Sigma公司。( 一 )抑制 microRNA149* 能增强 TM 作用下 Caspase3/7 活性方法将对照分子和抑制分子分别转染进Mel-RM细胞，转染24h后，分别用DMSO 和3 μ M的TM处理36h，收集细胞，使用Caspase3/7活性检测试剂盒(Promega公司)检测其活性。结果如图5所示，A组为对照组，B组为抑制组。结果表明，抑制microRNA149*的表达，在内质网压力下，细胞凋亡的重要指标CaSpaSe3/7活性有明显增强。Mel-RM细胞对内质网压力变得敏感，肿瘤细胞易于死亡。( 二 )抑制microRNA149*(miR-149*)可以促进TM作用下黑色素瘤细胞的死亡方法将对照分子和抑制分子分别转染进Mel-RM细胞，转染24h后，分别用10 μ M 的衣霉素处理36h，在显微镜下观察细胞形态，对死亡细胞计数，用(细胞总数_死亡细胞数)/细胞总数*100%的公式计算细胞存活率。结果如图6所示，A组为对照组(TM作用下存活率为76. 9% )，B组为抑制组(TM 作用下存活率为36. 5% )。当抑制了 micr0RNA149*后，细胞在衣霉素作用下的存活能力明显减弱，说明microRNA149*本身对黑色素瘤细胞的存活起着重要的作用。图7中检测的是实验中对照组(A 1. 00倍)和⑶抑制组细胞(B 0. 16倍)中 microRNA 149*的表达情况，说明转入anti-miR-149*后，抑制组内的microRNA149*表达明显下降。
四、抑制microRNA149*从而抑制黑色素瘤细胞的成瘤能力慢病毒(Lentivirus)作为基因药物载体携带抑制microRNA149*序列(序列信息 5’ > gcacagcccccgtccctccct < 3’)，将其带到靶位逆转黑色素瘤对内质网压力的不敏感性。黑色素瘤处于内质网压力下microRNA149*高表达，携带抑制microRNA149*的腺病毒进入细胞后，可使黑色素瘤中的microRNA149*的表达水平下降，从而使黑色素瘤失去适应内质网压力而生存的能力，达到治疗肿瘤的效果。 慢病毒空载体LentiLox 3. 7购自上海吉玛公司。pCMV-VSV-G 和 pCMV-dR8. 91 购自上海吉玛公司。HEK-293T细胞购自ATCC，产品目录号为CRL-11268 。培养HEK-293T的培养基DMEM+10%胎牛血清。转染HEK-293T的方法按照Invitrogen公司的Lipofectamine2000转染试剂标准步骤转染。对照组的实验方法将慢病毒空载体LentiLox 3. 7、pCMV_VSV_G和pCMV_dR8. 91 三质粒系统共转染HEK-293T细胞，36h后，收集上清，经过0. 45um 一次性滤器过滤后，4°C， 70000g离心2小时，收集到的病毒根据所需量，在终浓度6-lOng/ul polybrene存在下加入到70%左右目的细胞的6孔板中，感染Mel-RM细胞36h后，挑选荧光表达的克隆，并扩大培养。抑制组的实验方法合成上游引物5’ -TGGCACAGCCCCCGTCCCTCCCTTTT TTTC-3，(SEQ ID NO 3)；下游引物 5，-TCGAGAAAAAAAGGGAGGGACGGGGGCTGTGCCA-3，(SEQ ID NO :4)，退火后，将退火产物连接到Hpa I/Xho I双酶切的慢病毒载体LentiLox 3.7 上，测序鉴定挑选阳性克隆，将得到的阳性质粒记作lentiL0X3· 7-anti-miR-149*。用 lentiLox3. 7-anti-miR-149*.pCMV-VSV-G 和 pCMV_dR8. 91 三质粒系统共转染 HEK-293T 细胞，36h后，收集上清，即包装生产慢病毒。用上清感染Mel-RM细胞36h后，挑选荧光表达的克隆，并扩大培养。对照组和抑制组的Mel-RM细胞(约1*107个细胞量)，分别接种于裸鼠背部左右两侧皮下，36天后进行检测。通过荧光定量PCR方法，结合对照组共同检测micr0RNA149* 的表达抑制情况。检测引物上游引物miR-149* :5，> GTTAGGGAGGGACGGG < 3，；下游引物 miR-14肿5’ > CAGTGCGTGTCGTGGAGT < 3。结果如下肿瘤形态结果如图8，裸鼠右侧(抑制组)皮下成瘤大小明显小于左侧(对照组) 皮下，说明了抑制microRNA149*以后，能明显抑制黑色素瘤细胞株Mel-RM在裸鼠体内的成瘤能力。瘤重取出六组实体瘤进行称重，所得平均统计结果(*，ρ值< 0. 05)。结果如图 9(A为对照组，B为抑制组)，对照组瘤重0. 215g，抑制组瘤重0. 099g，抑制组平均重量明显小于对照组。实体瘤中microRNA149*表达量六组实体瘤中microRNA149*的平均表达情况结果如图10 (A为对照组，B为抑制组)，可以发现抑制组中microRNA149*的表达确实是受到了抑制作用。对照组空载体不含有抑制序列，不会降低miR-149*表达，而在抑制组中含有抑制序列，会降低miR-149*的 表达，两者的差别就是多了一段该抑制序列，应该可以说明这段抑制序列起了作用。
权利要求
1.一种RNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示。
2.权利要求1所述RNA的编码基因。
3.表达权利要求1所述RNA的重组载体，表达权利要求1所述RNA的重组病毒，或含有权利要求2所述编码基因的重组载体、重组菌、重组病毒或转基因细胞系。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于所述重组载体按照如下方法制备得到将SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示DNA分子退火，将退火产物连接到慢病毒载体 LentiLox 3. 7上，得到的重组载体即为所述重组载体。
5.一种具有如下1)至5)中任一所述功能的产品，其活性成分为权利要求1所述RNA、 权利要求2所述编码基因、权利要求3或4所述重组载体、重组菌、重组病毒或转基因细胞系；1)预防和/或治疗肿瘤的功能；2)促进肿瘤细胞凋亡的功能；3)TM作用下促进肿瘤细胞凋亡的功能；4)降低肿瘤细胞成瘤能力的功能；5)抑制microRNA149*表达的功能。
6.权利要求1所述RNA、权利要求2所述编码基因、权利要求3或4所述重组载体、重组菌、重组病毒或转基因细胞系在如下1)至5)中任一所述中的应用1)制备预防和/或治疗肿瘤的产品；2)制备促进肿瘤细胞凋亡的产品；3)制备TM作用下促进肿瘤细胞凋亡的产品；4)制备降低肿瘤细胞成瘤能力的产品；5)制备抑制microRNA149*表达的产品。
7.根据权利要求5所述的产品或根据权利要求6所述的应用，其特征在于 所述肿瘤为黑色素瘤；所述microRNA149*的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
8.microRNA149*作为靶点在开发预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
9.一种开发预防和/或治疗肿瘤的药物的方法，包括如下步骤以microRNA149*为靶点，开发具有如下1)_3)中的至少一种功能的物质，进而得到预防和/或治疗肿瘤的药物；1)抑制microRNA149* 表达；2)抑制microRNA149* 功能；3)抑制microRNA149*介导的信号通路。
10.根据权利要求8所述的应用或根据权利要求9所述的方法，其特征在于 所述肿瘤为黑色素瘤；所述microRNA149*的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
全文摘要
本发明公开了一种预防和/或治疗黑色素瘤的药物。该药物为RNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。实验证明，本发明的miRNA与黑色素瘤的形成有关，具有促进肿瘤细胞抗凋亡的功能，它的高表达能促进黑色素瘤适应内质网压力，从而有利于黑色素瘤的形成；而且在内质网压力刺激下，本发明的miRNA在其它肿瘤中表达量并不升高，说明本发明的miRNA具有黑色素瘤特异性；将本发明的miRNA作为靶点，抑制microRNA149*的功能，逆转了黑色素瘤细胞对内质网压力微环境的耐受性，减弱了黑色素瘤的成瘤效应。因此，本发明的miRNA可以作为一个新的靶点，用于开发治疗黑色素瘤的新的药物。
文档编号A61K48/00GK102250904SQ201110195430
公开日2011年11月23日 申请日期2011年7月13日 优先权日2011年7月13日
发明者吴缅, 张旭东, 金雷 申请人:中国科学技术大学