一种多细胞靶向脂质体的制作方法

本发明属于药物制剂、脂质体药物载体和抗体靶向
技术领域：
，具体涉及一种与免疫效应细胞和靶细胞同时作用的多细胞靶向脂质体药物制剂。
背景技术：
：脂质体是一种基于磷脂和/或胆固醇构成的具有双分子层囊泡状结构的药物载体。脂质体是人工制备的由脂质分子形成的双分子层囊泡。由于脂质分子具有亲水头部和疏水尾部，其可以在内部水相中(内水相)包载亲水性药物，在脂质双层膜中则可以嵌入疏水性药物。此外，由于脂质体具有良好的组织相容性，毒性低、生物安全，使其在药物输送体系领域得到了广泛的关注与应用。尤其是脂质体靶向技术的发展，赋予了脂质药物载体独特的体内行为，使其具有向靶点部位富集，进而与靶细胞特异性相互作用的能力。人们希望，通过优化靶点的选择，以及通过改进靶向配体的结构及性能，能够转化成脂质体药物临床疗效的改善，包括降低药物系统毒性、提高治疗指数等。靶向脂质体药物输送系统的研发思路是，针对以肿瘤细胞表面高表达或特异性表达的受体为靶标，设计各种类型的主动靶向配体和药物载体。根据这一设计思路开发而来的主动靶向药物具有相比于无靶向载体输送的游离药物更优化的病灶部位靶向能力，例如靶部位药物浓度的提高、药效学的改善等。然而，由于这一类靶向给药系统的只作用于某一特定种类的肿瘤细胞，因此不但不足以有效清除肿瘤，反而可能诱发微小残留病变、肿瘤多药耐药等问题的产生。近年来，得益于人们对肿瘤异质性的认识的提升，单细胞靶向局限性背后的机理得以阐明。比如，不同患者间肿瘤分子标记的差异，同一患者同一肿瘤内的不同肿瘤细胞间分子标记的差异，同一肿瘤内存在不同的细胞种类及其相互作用等。针对肿瘤异质性的特点，研究人员将靶向输送的设计思路进行了扩展。比如，双靶点脂质体能够增强载体和细胞间的结合能力，促进细胞对药物的摄取；靶向肿瘤相关细胞的药物载体可通过其它机制抑制肿瘤生长，如作用于肿瘤新生血管、成纤维细胞、肿瘤干细胞等。虽然这类靶向输送技术带来一定程度的治疗改善，其设计思路仍然没有跳出单细胞靶向的既定框架。肿瘤内部不同细胞间存在着广泛的动态相互作用，例如淋巴细胞浸润、巨噬细胞吞噬、抗原递呈、基于细胞因子和外泌体的细胞间通讯等，这些相互作用既包括抑制肿瘤生长的免疫监视和清除，也包括促进肿瘤生长的微环境。并且，阻断或促进这些细胞间相互作用已在临床实践中证明是可行且有效的，例如基于抗原特异性t细胞的疫苗疗法、依赖于nk细胞细胞毒性作用的抗体疗法、阻断肿瘤免疫逃逸作用的免疫哨卡抑制剂疗法等。相比之下，单一细胞靶向的药物输送系统只能通过针对特定靶细胞调节生理过程，却无法利用肿瘤组织内细胞间的相互作用而实现有效治疗。由此，将针对不同细胞的抗体修饰在单个脂质体上，通过分子自组装构成具有稳定结构和体内长循环特性的脂质体，通过抗体的作用序贯或者同时结合多个不同的细胞，从而实现促进或阻断细胞间相互作用，以调节不同细胞间的识别、通讯、细胞毒性、促凋亡或清除等作用。并且，利用脂质药物载体，实现针对多细胞的靶向药物输送，改善药理作用的同时，避免组合疗法中可能出现的药物相互作用等问题。技术实现要素：为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种能够序贯或者同时结合多种不同细胞的多细胞靶向脂质体药物制剂及其制备与应用。为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：本发明的第一方面，提供一种多细胞靶向脂质体，其结构中包括脂质体、修饰于脂质体表面的主要抗体和辅助抗体，所述主要抗体特异性结合靶细胞表面的靶分子，所述辅助抗体特异性结合于免疫效应细胞。进一步地，所述多细胞靶向脂质体能够同时或序贯结合免疫效应细胞和靶细胞，从而实现免疫效应细胞对靶细胞识别和免疫效应的激活。进一步地，每个脂质体上主要抗体和辅助抗体的摩尔比例在100/1到1/1之间。进一步地，每个脂质体表面有1-1000个主要抗体和1-1000个辅助抗体。进一步地，所述主要抗体和辅助抗体分别通过共价连接或者疏水亲水相互作用而展示在脂质体表面。如本发明一些实施方式中所例举的，所述主要抗体和辅助抗体分别与所述脂质体中的脂质分子连接。所述脂质分子带有马来酰亚胺基团。所述主要抗体和辅助抗体分别与脂质分子的马来酰亚胺基团连接。所述主要抗体和辅助抗体分别与脂质分子通过硫醚键连接。进一步地，所述靶细胞选自肿瘤细胞、微生物或微生物感染的细胞。因此，所述主要抗体针对的抗原选自微生物抗原、肿瘤相关抗原、肿瘤细胞表面特异性抗原、肿瘤细胞表面高表达的抗原、肿瘤组织或肿瘤血管中高表达的抗原。也就是所述靶分子选自微生物抗原、肿瘤相关抗原、肿瘤细胞表面特异性抗原、肿瘤细胞表面高表达的抗原、肿瘤组织或肿瘤血管中高表达的抗原。进一步地，所述主要抗体的特异性靶分子选自cd19，cd20，psma，her2/neu，egfr，lgr5或pdl1。本发明一些实施方式中，列举了所述主要抗体的特异性靶分子为cd19。所述cd19为人b淋巴细胞白血病或人b细胞淋巴瘤的人cd19抗原。进一步地，所述免疫效应细胞为能够对靶细胞产生细胞毒性、促凋亡或清除作用的效应细胞。所述免疫效应细胞选自t淋巴细胞、nk细胞、nkt细胞、巨噬细胞或中性粒细胞。因此，所述辅助抗体针对的抗原选自肿瘤细胞、淋巴细胞或髓系细胞所表达的抗原。所以，所述多细胞靶向脂质体可以同时或序贯结合肿瘤细胞、淋巴细胞、或髓系细胞。即同一个脂质体先结合肿瘤细胞再结合淋巴细胞，或反之。本发明一些实施方式中，列举了所述所述免疫效应细胞为t淋巴细胞。本发明的一些实施方式列举了所述免疫效应细胞的效应抗原为cd3，所述辅助抗体为cd3抗体。进一步地，所述辅助抗体选自cd3抗体及片段，pd1抗体及片段，ctla4抗体及片段，cd40l抗体及片段。所述t淋巴细胞可以是未经激活的t细胞，也可以是经体外活化或扩增的t细胞，例如，抗原特异性t淋巴细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、细胞毒t细胞、辅助性t细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞(lak细胞)、γδt细胞、嵌合抗原受体t细胞、t细胞受体嵌合型t细胞。所述t淋巴细胞是未经激活的t细胞，或是经体外活化或扩增的t细胞。所述活化或扩增可以是经抗原、抗体、多肽、多肽-主要组织相容复合物、小分子、细胞因子、免疫检查点抑制剂、基因编辑而活化或扩增。进一步地，所述主要抗体和辅助抗体的形式选自igg，fab’片段、f(ab’)2片段、fab片段、单链fv片段、微抗体(minibody)、纳抗体(nanobody)、单域抗体(unibody)、或双域抗体(diabody)。本发明的一些实施方式中例举了：所述抗体为抗体的fab’片段，为抗体去除fc片段并还原后获得。包括轻链可变区和重链可变区。本发明的一些实施方式中例举了所述主要抗体为cd19抗体的fab‘片段，其轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.1所示，具体为：diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdirnylnwyqqkpdgtvklliyytsrlhsgvpskfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpwtfaggtkleik。重链可变区的氨基酸序列如seqidno.2所示，具体为：evqlqqsgpelvkpgasmkisckasgysftgytmnwvkqshgknlewmglinpykgvstynqkfkdkatltvdkssstaymellsltsedsavyycarsgyygdsdwyfdvwgqgttltvfs。此外，主要抗体可以是her2抗体，所述her2抗体的lc序列如seqidno.3所示，具体为：mdmrvpaqllgllllwlrgarcdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdvntavawyqqkpgkapklliysasflysgvpsrfsgsrsgtdftltisslqpedfatyycqqhyttpptfgqgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec。所述her2抗体的hc序列如seqidno.4所示，具体为：mefglswvflvailkgvqcevqlvesggglvqpggslrlscaasgfnikdtyihwvrqapgkglewvariyptngytryadsvkgrftisadtskntaylqmnslraedtavyycsrwggdgfyamdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkv。所述主要抗体还可以是egfr抗体的scfv片段，所述egfr抗体scfv的vh序列如seqidno.5所示，具体为：qvqlkqsgpglvqpsqslsitctvsgfsltnygvhwvrqspgkglewlgviwsggntdyntpftsrlsinkdnsksqvffkmnslqsndtaiyycaraltyydyefaywgqgtlvtvsa。所述egfr抗体的vl序列如seqidno.6所示，具体为：dilltqspvilsvspgervsfscrasqsigtnihwyqqrtngsprllikyasesisgipsrfsgsgsgtdftlsinsvesediadyycqqnnnwpttfgagtklelk。所述主要抗体还可以是psma抗体，所述psma抗体的vh序列如seqidno.7所示，具体为：qvqlvesggglvkpgeslrlscaasgftfsdyymywvrqapgkglewvaiisdggyytyysdiikgrftisrdnaknslylqmnslkaedtavyycargfpllrhgamdywgqgtlvtvss。所述psma抗体的vl序列如seqidno.8所示，具体为：diqmtqspsslsasvgdrvtitckasqnvdtnvawyqqkpgqapksliysasyrysdvpsrfsgsasgtdftltissvqsedfatyycqqydsypytfgggtkleik。所述主要抗体还可以是pdl1抗体，所述pdl1抗体的重链序列如seqidno.9所示，具体为：evqllesggglvqpggslrlscaasgftfssyimmwvrqapgkglewvss50iypsggitfyadtvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarik100lgtvttvdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvk150dyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqt200yicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkp250kdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyn300styrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepq350vytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppv400ldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk450。所述pdl1抗体的轻链序列如seqidno.10所示，具体为：qsaltqpasvsgspgqsitisctgtssdvggynyvswyqqhpgkapklmi50ydvsnrpsgvsnrfsgsksgntasltisglqaedeadyycssytssstrv100fgtgtkvtvlgqpkanptvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtv150awkadgspvkagvettkpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvt200hegstvektvaptecs。本发明的一些实施方式中例举了所述辅助抗体为cd3抗体的fab‘片段，所述cd3抗体的vh序列如seqidno.11所示，具体为：diklqqsgaelarpgasvkmscktsgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvss。所述cd3抗体的vl序列如seqidno.12所示，具体为：diqltqspaimsaspgekvtmtcrasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtskvasgvpyrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqwssnpltfgagtklelk。或者，所述cd3抗体的vh序列如seqidno.13所示，具体为：evqlvesggglvqpggslklscaasgftfnkyamnwvrqapgkglewvarirskynnyatyyadsvkdrftisrddskntaylqmnnlktedtavyycvrhgnfgnsyisywaywgqgtlvtvss。所述cd3抗体的vl序列如seqidno.14所示，具体为：qtvvtqepsltvspggtvtltcgsstgavtsgnypnwvqqkpgqaprgliggtkflapgtparfsgsllggkaaltlsgvqpedeaeyycvlwysnrwvfgggtkltvla。所述辅助抗体还可以是pd-1抗体，所述pd-1抗体的vh序列如seqidno.15所示，具体为：qvqlvesgggvvqpgrslrldckasgitfsnsgmhwvrqapgkglewvaviwydgskryyadsvkgrftisrdnskntlflqmnslraedtavyycatnddywgqgtlvtvss。所述pd-1抗体的vl序列如seqidno.16所示，具体为：lemaeivltqspatlslspgeratlscrasqsvssylawyqqkpgqaprlliydasnratgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqssnwprtfgqgtkveik。本发明对于脂质体的成分没有特殊的限制，只要是脂质体即可。所述脂质体的组成成分可选自蛋磷脂、氢化大豆磷脂酰胆碱、氢化蛋磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-亚油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、氢化二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二硬脂酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、脑磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、蛋磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、脑鞘磷脂、二棕榈酰鞘磷脂或二硬脂酰鞘磷脂、胆固醇、二油氧基丙基三甲基氯化铵(dotap)、二油酰氯丙基氯化三甲铵(dotma)、双十八烷基二甲基溴化铵(ddab)、二甲基胺乙基胺基丙酰基-胆固醇(dc-chol)、精胺-5-羧基氨基乙酸二十八烷基酰胺(dogs)、二油酰琥珀酰甘油胆碱酯(dosc)、二油酰氯精胺羧基酰胺乙基二甲基丙基三氟乙酸铵(dospa)、中的任一种或它们的两种或两种以上的组合。如本发明的一些实施方式中所列举的，所述脂质体的组成成分包括磷脂酰胆碱，胆固醇、连接主要抗体的脂质和连接辅助抗体的脂质分子。进一步地，所述脂质体可以是空白脂质体，也可以是载药脂质体。本发明的第二方面，提供前述多细胞靶向性脂质体的制备方法，为采用后插入法制备，包括如下步骤：(1)分别将主要抗体和辅助抗体与脂质分子连接，获得主要抗体-脂质分子和辅助抗体-脂质分子；(2)将获得的主要抗体-脂质分子和辅助抗体-脂质分子与已构建好的脂质体混合、孵育，获得混合溶液；(3)将所得混合溶液经透析或超滤去除未载入的抗体和抗体脂质复合物，得多细胞靶向脂质体。优选地，所述主要抗体与脂质分子的摩尔比范围是：(0.1-5):1000。优选地，所述辅助抗体与脂质分子的摩尔比范围是：(0.1-5):1000。本发明的第三方面，提供前述多细胞靶向脂质体在制备免疫治疗药物、抗肿瘤药物中的应用。本发明的第四方面，公开了一种治疗肿瘤的方法，包括步骤：将前述多细胞靶向脂质体施用于肿瘤患者。所述方法可以是体外的。所述方法可以是非治疗目的的。所述肿瘤可以为细胞表面为cd19阳性的肿瘤。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明的多细胞靶向脂质体具备与多靶向抗体类似的作用机制，但进一步地提出了通过主要抗体和辅助抗体的密度和相对比例的调整，优化针对不同靶细胞和靶分子的效应细胞激活效应；更进一步地，通过脂质体中装载的药物对靶细胞和效应细胞的作用进一步加强；最后，多细胞脂质体的生产、制备和质量控制也较多靶向抗体而言更为可行。附图说明图1a：cd3全长抗体、纯化抗cd3抗体f(ab’)2片段、抗cd3抗体fab’片段-高分子-dspe连接产物的还原型和非还原型sds-page图，考马斯亮蓝染色。图1b：cd19全抗体、纯化抗cd19抗体f(ab’)2片段、抗cd19抗体fab’片段-高分子-dspe连接物的sds-page图，考马斯亮蓝染色。图1c：抗cd3单链抗体(scfv)片段、抗cd3单链抗体(scfv)片段-高分子-dspe连接物的sds-page图，考马斯亮蓝染色。图2：为多细胞靶向、单靶向、无靶向脂质体的粒径分布。图3a：cd3及cd19多细胞靶向和单靶向脂质体的靶细胞jurkat特异性结合。图3b：cd3及cd19多细胞靶向和单靶向脂质体的靶细胞raji特异性结合。图4：为多细胞靶向、单靶向、无靶向脂质体介导cd3+和cd19+靶细胞的细胞间结合。图5a：多细胞靶向脂质体介导预先激活的效应细胞对靶细胞raji的细胞杀伤作用，以ldh法检测加药24小时后的细胞毒性，效应细胞为经过cd3和cd28抗体激活扩增3天后的t细胞。图5b：多细胞靶向脂质体介导预先激活的效应细胞对靶细胞raji的细胞杀伤作用，以ldh法检测加药24小时后的细胞毒性，效应细胞为经过人il-2激活扩增的lak细胞。图6a：为多细胞靶向脂质体介导预先激活的效应细胞对靶细胞raji的细胞杀伤作用，效应细胞为经过唑来膦酸扩增的人γδt细胞，以ldh法检测加药24小时后的细胞毒性，不同效应细胞/靶细胞比例的细胞杀伤情况。图6b：为多细胞靶向脂质体介导预先激活的效应细胞对靶细胞raji的细胞杀伤作用，效应细胞为经过唑来膦酸扩增的人γδt细胞，以ldh法检测加药24小时后的细胞毒性，为不同剂量、靶向的脂质体介导细胞杀伤的情况。图6c：为多细胞靶向脂质体介导预先激活的效应细胞对靶细胞raji的细胞杀伤作用，效应细胞为经过唑来膦酸扩增的人γδt细胞，以ldh法检测加药24小时后的细胞毒性，为不同剂量、靶向的脂质体介导细胞杀伤的情况。图7a：为多细胞靶向脂质体介导未刺激的效应细胞对靶细胞raji的细胞杀伤作用，效应细胞为未激活的人淋巴细胞；以pi染色法检测加药5小时后的细胞毒性，亦即，加药5小时后的靶细胞杀伤情况。图7b：为多细胞靶向脂质体介导未刺激的效应细胞对靶细胞raji的细胞杀伤作用，效应细胞为未激活的人淋巴细胞；以pi染色法检测加药24小时后的细胞毒性，亦即，加药24小时后的靶细胞杀伤情况。图8a：为多细胞靶向脂质体介导未刺激淋巴细胞对靶细胞raji细胞的杀伤作用，效应细胞为未激活的人淋巴细胞；不同效应细胞/靶细胞比例的细胞杀伤情况(pi染色法)。图8b：为多细胞靶向脂质体介导未刺激淋巴细胞对靶细胞raji细胞的杀伤作用，效应细胞为未激活的人淋巴细胞；为不同剂量、靶向的脂质体介导细胞杀伤的情况(ldh法)。图8c：为多细胞靶向脂质体介导未刺激淋巴细胞对靶细胞raji细胞的杀伤作用，效应细胞为未激活的人淋巴细胞；为不同剂量、靶向的脂质体介导细胞杀伤的情况(ldh法)。图9a：为多细胞靶向脂质体介导未刺激淋巴细胞的靶细胞杀伤作用，效应细胞为未激活的淋巴细胞，靶细胞为靶细胞raji细胞细胞；以ldh法检测加药5小时后的细胞毒性。其中，多细胞靶向脂质体的主要抗体不再是抗cd3抗体ucht1克隆的fab’2片段，而更换为不同克隆的抗cd3igg单克隆抗体(2c11)。图9b：为多细胞靶向脂质体介导未刺激淋巴细胞的靶细胞杀伤作用，效应细胞为未激活的人淋巴细胞，靶细胞为cd19+人b淋巴细胞白血病sup-b15细胞；以ldh法检测加药24小时后的细胞毒性。图9c：为多细胞靶向脂质体介导未刺激淋巴细胞的靶细胞杀伤作用，效应细胞为未激活的cd4+t淋巴细胞，靶细胞为lgr5+人非小细胞肺癌a549细胞；以ldh法检测加药5小时后的细胞毒性。其中，多细胞靶向脂质体的辅助抗体为lgr5抗体。图10：为多细胞靶向脂质体介导未刺激淋巴细胞对靶细胞raji细胞杀伤作用下的ifn-γ分泌情况，效应细胞为未激活的人淋巴细胞，其中，pxp是指不靶向脂质体组，hxp是指cd19单靶向脂质体组，uxp是指cd3单靶向脂质体组，uxh是指cd19及cd3多细胞靶向脂质体组。图11：为多细胞靶向脂质体介导未刺激淋巴细胞对靶细胞raji细胞杀伤作用下，不同浓度egta的影响，效应细胞为未激活的人淋巴细胞。图12：为多细胞靶向脂质体介导未刺激淋巴细胞的靶细胞杀伤作用，效应细胞为未激活的人淋巴细胞，靶细胞为cd19+raji细胞；以ldh法检测加药24小时后的细胞毒性，uxh-lipo是指多细胞靶向空白脂质体组，uxh-das-lipo是指多细胞靶向达沙替尼脂质体组。具体实施方式脂质体(liposomes)是人工制备的由脂质分子形成的双分子层囊泡。脂质分子的结构通常由亲水头部、疏水尾部及连接部分三个部分组成。在水的介质中，由于疏水相互作用，脂质分子的疏水尾部相互靠近，亲水头部面向水相定向排列，形成双分子层。基于这样的结构，既可以在脂质体内部水相中(内水相)包载亲水性药物，也可以在脂质双层膜中嵌入疏水性药物。靶向脂质体的靶向作用则是通过在表面修饰配体而实现的。配体可以是抗体、多肽、小分子等，通过配体与靶细胞特异性受体的相互作用。其中将抗体及其片段修饰在脂质体表面，相对于小分子和多肽配体具有更好的结合活性和特异性。应用脂质分子自组装原理，在一个脂质体表面修饰两个以上不同的配体，也具有较好的可行性。本发明在抗体修饰脂质体技术的基础上，一方面通过针对靶细胞的主要抗体和针对效应细胞的辅助抗体的巧妙组合，获得了新颖和独特的脂质体针对肿瘤细胞的杀伤机理和效果。目前已知的多靶向脂质体制剂技术都是应用不同配体组合，通过同时结合不同的抗原以提高对特定细胞的靶向输送效率和选择性。本发明提出的多细胞靶向脂质体，通过促进或阻断多种细胞间的相互作用，从而调节不同细胞间的识别、结合和激活等生理功能。因此，为配体靶向脂质体技术提出了一个全新的方向。另一方面，在脂质药物载体表面构建多细胞靶向性，不仅比在同一抗体结构上构建两种不同靶向性的抗体序列简便的多，还可以通过调节脂质体表面主要抗体和辅助抗体的密度及其比例，优化了抗肿瘤效果。此外，这种多细胞靶向脂质体的构建和制备方法也会避免抗体错配等问题，克服在生产和疗效上的缺陷。特别是脂质体在体内还有独特的药代动力学和组织分布特性，能够大大改善目前多靶向抗体的体内作用半衰期短暂的缺陷。进一步地，本发明所得到的多细胞靶向脂质体，还可以与脂质体载药技术结合，相比较临床上已有的多靶向抗体与其他药物的联合治疗方案，将更加便捷、多样和可控。通过将药物包载在脂质体中，可以实现药物的靶向输送和释放，即提高药物的选择性，改变药物的释放部位和时间。比如，肿瘤免疫疗法的不良反应包括使患者产生细胞因子风暴，因此临床上会要求患者预先服用地塞米松以抑制该不良反应。再比如，部分免疫药物需要同时系统给予il-2等细胞因子药物才能达到理想的免疫激活作用。脂质体作为药物输送载体，可以通过包载药物，利用主要抗体和辅助抗体实现药物的靶向输送。由此，本发明通过制备包含针对靶细胞的主要抗体和针对效应细胞的辅助抗体的多细胞靶向脂质体，可以实现促使免疫细胞结合并识别肿瘤细胞，并进而激活免疫细胞的效应功能。这种多细胞靶向脂质体具备独特的体内作用机制，而且相对于临床上应用的多靶向抗体具有生产制备和体内作用多方面的实质性进步。此外，可以利用载药脂质体制备多细胞靶向制剂，实现更好的治疗效果。如本发明一些实施方式所列举的，本发明的技术方案具有如下优势：(1)、本发明从多细胞靶向脂质体的制备出发，在同一个脂质体上修饰两种不同特异性的靶向抗体或抗体片段。脂质体制备和表面靶向修饰技术成熟，设计简单，易于大规模生产制备及分离纯化，靶向基团可以根据临床需要作出调整，有利于根据疾病开发设计出各种不同特异性的多细胞靶向组合；(2)、本发明的与cd19和cd3抗原特异性结合的两种抗体片段-脂质连接物，与荧光标记脂质体制备的多细胞靶向和单靶向脂质体，与cd19阳性和cd3阳性的细胞分别孵育，都表现出很强的结合活性，并且这种结合是特异性的；(3)、本发明的cd19和cd3抗原特异性结合的多细胞靶向脂质体与不同荧光标记的cd19阳性和cd3阳性的细胞共孵育，经流式细胞仪检测出现两种荧光双阳性的信号，表现出多细胞靶向脂质体能够有效介导细胞间结合，即促使免疫效应细胞识别靶细胞的能力；(4)、本发明的cd19和cd3抗原特异性结合的多细胞靶向脂质体与免疫效应细胞和肿瘤细胞共孵育，表现出免疫效应细胞对肿瘤细胞很强的杀伤能力，并且这种杀伤是穿孔素-颗粒酶途径介导的；(5)、本发明的cd19和cd3抗原特异性结合的多细胞靶向脂质体与免疫效应细胞和肿瘤细胞共孵育，经elisa检测，表现出多细胞靶向脂质体能有效刺激免疫效应细胞ifn-γ细胞因子的分泌；(6)、本发明的cd19和cd3抗原特异性结合的多细胞靶向脂质体，通过调节表面抗体的密度，经ldh检测，表现出多细胞靶向脂质体具有可控的细胞相互作用的调节能力；(7)、本发明的cd19和cd3抗原特异性结合的多细胞靶向脂质体，不但具有多靶向抗体的优点，而且可以利用载药脂质体制备多细胞靶向药物输送系统。以cd19和cd3抗原特异性结合的两种抗体片段-脂质连接物和载有免疫调节药物达沙替尼的载药脂质体为原料，制备成的载药多细胞靶向脂质体，在高载药量下，表现出对于免疫效应细胞介导的细胞杀伤的有效抑制能力。载药多细胞靶向脂质体可以作为靶向药物载体，发展为针对疾病的靶向药物输送系统，实现更好的治疗效果。在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本
技术领域：
技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本
技术领域：
的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本
技术领域：
常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见sambrook等molecularcloning：alaboratorymanual，secondedition，coldspringharborlaboratorypress，1989andthirdedition，2001；ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1987andperiodicupdates；theseriesmethodsinenzymology，academicpress，sandiego；wolffe，chromatinstructureandfunction，thirdedition，academicpress，sandiego，1998；methodsinenzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarmananda.p.wolffe，eds.)，academicpress，sandiego，1999；和methodsinmolecularbiology，vol.119，chromatinprotocols(p.b.becker，ed.)humanapress，totowa，1999等。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实验试剂和细胞卵磷脂(epc)、氢化大豆磷脂(hspc)、二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(dspe-peg2000-mal)购自日本nof公司(tokyo,japan)；胆固醇(chol)、二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dspe-peg2000)、购自美国avantipolarlipids公司(al,us)。dii购自sigma公司、cfse购自invitrogen公司。rpmi-1640培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素双抗试剂(100×)购于gibico公司。raji人淋巴瘤细胞、jurkat人淋巴瘤细胞购自中国科学院细胞所。实施例1、多细胞靶向脂质体的制备1、抗cd19及抗cd3抗体f(ab’)2片段的制备通过固定化酶胃蛋白酶(pepsin)或无花果蛋白酶(ficin)作酶切反应，将igg的fc段切除制备f(ab’)2片段；其中人源、鼠源igg采用酶胃蛋白酶(pepsin)作酶切反应，鼠源igg1采用无花果蛋白酶(ficin)。具体步骤为：将500ul抗体离心通过脱盐柱；将流穿液加入至固定化酶中，37℃恒温混匀；胃蛋白酶(pepsin)孵育4h或无花果蛋白酶(ficin)孵育24h后，以5,000g、1min离心收集流穿液，以proteinabindingbuffer洗涤固定化酶、收集流穿液，合并流穿液即得到酶切产物。将酶切产物在proteinacolumn中恒温混匀10min，然后以离心收集流穿液，并以proteinabindingbuffer洗涤proteina柱并收集流穿液，合并流穿液即获得经proteina柱纯化、除去igg和fc大片段的酶切产物。将上述酶切产物经过50kd透析袋透析，透析介质ph＝7.0pbs溶液，以2h,2h,16h顺序进行透析，获得除去fc片段的纯化抗体f(ab’)2片段。采用现有技术进行确认，所获得的抗cd19抗体f(ab’)2片段为全长抗cd19抗体去除fc片段获得。采用现有技术进行确认，所获得的抗cd3抗体f(ab’)2片段，为全长抗cd3抗体去除fc片段后获得。包括轻链可变区和重链可变区。轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.1所示，具体为：diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdirnylnwyqqkpdgtvklliyytsrlhsgvpskfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpwtfaggtkleik。重链可变区的氨基酸序列如seqidno.2所示，具体为：evqlqqsgpelvkpgasmkisckasgysftgytmnwvkqshgknlewmglinpykgvstynqkfkdkatltvdkssstaymellsltsedsavyycarsgyygdsdwyfdvwgqgttltvfs。2、抗cd19及抗cd3抗体的fab’片段-高分子-脂质连接物的制备通过β-巯基乙胺作还原剂，将抗体f(ab’)2片段还原为fab’、并化学连接到dspe-peg2000-mal的马来酰亚胺基团上，具体步骤为：将抗体f(ab’)2片段(1-10mg/ml)与50mm含edtaβ-巯基乙胺混合，n2保护下37℃恒温震荡反应90min；之后离心通过脱盐柱，收集流穿液。得到去除β-巯基乙胺的抗体f(ab’)2片段的还原产物fab’。之后加入600umdspe-peg2000-mal胶束的30mmhepes溶液，使fab’与dspe-peg2000-mal的摩尔比为1:1，n2保护下10℃恒温震荡反应16h。得到抗体的fab’片段-高分子-脂质连接物dspe-peg2000-mal-fab’胶束。获得的连接产物通过sds-page考察连接情况。结果，如图1a和图1b所示。3、抗cd3抗体的fab’片段-高分子-脂质连接物的制备通过三羧乙基膦(tcep)作还原剂，将抗体scfv片段及其多聚体还原为含有游离巯基的scfv、并化学连接到dspe-peg2000-mal的马来酰亚胺基团上，具体步骤为：将800ul抗体scfv片段(1-10mg/ml)与含1.2mm的tcep的hepes溶液混合，使scfv与tcep的摩尔比为1:5，之后立即加入600umdspe-peg2000-mal胶束的30mmhepes溶液，n2保护下10℃恒温震荡反应16h。得到抗体的scfv片段-高分子-脂质连接物dspe-peg2000-mal-scfv胶束。获得的连接产物通过sds-page考察连接情况。结果，如图1c所示。4、抗cd19及抗cd3单靶向和多细胞靶向脂质体的制备通过后插法制备单靶向和多细胞靶向脂质体；对于多细胞靶向脂质体，将制备的抗cd19及抗cd3fab’片段-高分子-脂质连接物dspe-peg2000-mal-fab’或scfv片段-高分子-脂质连接物与脂质体按照摩尔比(0.1-5):(0.1-5):1000混合，n2保护下37℃恒温震荡反应24h，然后通过300kd超滤洗涤脂质体5次除去未结合抗体fab’片段，得到抗cd19及抗cd3多细胞靶向脂质体。对于抗cd3单靶向脂质体，将抗cd19fab’片段-高分子-脂质连接物dspe-peg2000-mal-fab’等摩尔替换成dspe-mpeg2000；对于抗cd19单靶向脂质体，将抗cd3fab’片段-高分子-脂质连接物dspe-peg2000-mal-fab’等摩尔替换成dspe-mpeg2000。结果如图2和表1所示：制备的靶向脂质体的粒径在80-90nm左右，pdi约为0.1。表1z-ave(nm)pdiblank80.3±1.50.06±0.01acd3xacd1989.0±2.30.08±0.01acd3xmpeg84.1±3.20.11±0.04acd19xmpeg83.2±0.80.08±0.02mpegxmpeg82.8±3.60.10±0.01实施例2、多细胞靶向脂质体体外特异性结合作用评价以cd19阳性raji细胞和cd3阳性jurkat细胞为代表，考察多细胞靶向脂质体体外特异性结合作用。jurkat,clonee6-1人t淋巴细胞白血病细胞系及raji人b细胞淋巴瘤细胞系购自中国科学院细胞库。细胞株通过完全培养基含1％pls双抗+10％fbs的rpmi-1640(gibco)。通过流式细胞仪分析cd3阳性细胞株jurkat细胞、cd19阳性细胞株raji细胞和人外周血淋巴细胞考察多细胞靶向脂质体体外特异性结合能力。1×106个raji或jurkat细胞以400ul完全培养基重悬，加入48孔板中，每孔加入1ug单靶向或多细胞靶向dii标记脂质体。37℃细胞培养箱中孵育2h。然后将细胞取出置于流式管中，500×g，5min离心，弃去上清，然后以pbs洗涤细胞两次。之后以400ulpbs重悬细胞，并以流式细胞仪bectondickinsonfacslsrii上样检测。结果如图3a和图3b所示。实施例3、多细胞靶向脂质体介导靶细胞间结合作用评价以cd19阳性raji细胞和cd3阳性jurkat细胞为代表，证明多细胞靶向脂质体可以介导不同靶细胞之间的细胞-细胞结合。通过cfse染色jurkat细胞，dii染色raji细胞。1.25×105个raji-dii和1.25×105个jurkat-cfse细胞以400ul无酚红完全培养基重悬并混合，加入48孔板中，每孔加入1ug单靶向或多细胞靶向脂质体。37℃细胞培养箱中孵育30min。通过流式细胞仪分析cfse阳性jurkat细胞、dii阳性raji细胞及cfse/dii双阳性细胞簇，考察多细胞靶向脂质体介导靶细胞间结合作用。结果如图4所示。实施例4、多细胞靶向脂质体介导效应细胞对肿瘤细胞杀伤作用评价细胞培养基配方为在无酚红rpmi-1640培养基中加入5％fbs、1％双抗、100iu/mlhil-2。1、ldh法评价肿瘤细胞杀伤作用通过promega公司cytotox非放射性细胞毒性检测试剂盒检测多细胞靶向脂质体介导效应细胞对肿瘤细胞杀伤作用。将效应细胞(未刺激的人淋巴细胞、cd3/cd28抗体扩增活化的人t细胞、γδt细胞、lak细胞)和靶细胞(raji细胞、sup-b15细胞、a549细胞)以无酚红完全培养基重悬，细胞浓度分别为1*10^6个/ml和，1.11*10^5个/ml。以100ul效应细胞和90ul靶细胞加至96孔板中并吹打混匀进行细胞铺板，此时靶细胞与效应细胞比例为1:10。每孔中加入不同浓度、靶向的脂质体10ul，吹打混匀。将96孔板放于细胞培养箱中24小时孵育。孵育结束前45分钟向体积校正对照孔和靶细胞最大裂解孔中加入10ul裂解液。孵育结束后，以250g，4min离心96孔板，离心后吸取50ul上清液至新96孔板，再向新孔板中加入50ulldh底物，22℃孵育15分钟。孵育结束后在酶标仪中以490nm波长下检测吸光度。结果如图5a、图5b、图6a、图6b、图6c、图8b、图8c、图9所示。通过这些实验数据充分说明：本发明的多细胞靶向脂质体可以有效介导效应细胞对靶细胞的有效杀伤，其中的效应细胞可以包括未刺激淋巴细胞、体外扩增的淋巴细胞、体外激活的淋巴细胞、体外诱导分化的淋巴细胞，并且这种细胞杀伤作用依赖于细胞裂解作用，且具有剂量依赖关系。2、pi染色法评价肿瘤细胞杀伤作用将效应细胞(未刺激的人淋巴细胞、cd3/cd28抗体扩增活化的人t细胞、γδt细胞、lak细胞)和cfse标记的靶细胞(raji细胞)以无酚红完全培养基重悬，细胞浓度分别为1*10^6个/ml和，1.11*10^5个/ml。以100ul效应细胞和90ul靶细胞加至96孔板中并吹打混匀进行细胞铺板，此时靶细胞与效应细胞比例为1:1、1:5、1:10。每孔中加入不同浓度、靶向的脂质体10ul，吹打混匀。将96孔板放于细胞培养箱中24小时孵育。孵育结束后，收集细胞液于流式管，加入5ul1mg/mlpi后孵育15分钟，再加入流式缓冲液200ul并上样。结果如图7a、图7b、图8a、图9b所示。通过这些实验数据充分说明：本发明的多细胞靶向脂质体可以有效介导效应细胞对靶细胞的有效杀伤，其中的效应细胞可以包括未刺激淋巴细胞、体外扩增的淋巴细胞、体外激活的淋巴细胞、体外诱导分化的淋巴细胞，并且这种细胞杀伤作用依赖于细胞裂解的膜裂解作用，且具有剂量依赖关系。此外，多靶向抗体对于表达相同抗原的不同靶细胞，都可有效介导效应细胞的杀伤(图9acd19+sup-b15细胞)。更换不同抗体分子或靶细胞的结果如图9a、图9b、图9c所示。其中，图9a的主要抗体更换为抗cd3抗体的不同克隆(2c11)和不同抗体形式(igg)；图9b为相同主要抗体和辅助抗体的多细胞靶向脂质体，但是靶细胞更换为cd19+人白血病sup-b15细胞；图9c的辅助抗体更换为靶向不同抗原(lgr)的不同靶向分子(rspo-1蛋白)，靶细胞更换为非小细胞肺癌a549细胞(实体瘤模型)。通过这些实验数据充分说明：本发明的多细胞靶向脂质体的第一和辅助抗体可以是靶向任何抗原的任何形式和结构的靶向分子，靶细胞和效应细胞可以为任何能被主要抗体和辅助抗体结合的细胞。由于多细胞靶向脂质体基于靶向性而介导免疫效应细胞和靶细胞相互作用这一独特的机制，我们可以根据不同的疾病类型，通过更换任何靶向分子(主要抗体和辅助抗体)，都可以起到有效介导效应细胞对靶细胞的作用。实施例5、多细胞靶向脂质体刺激效应细胞激活作用评价将效应细胞(未刺激的人淋巴细胞)和靶细胞(raji细胞)以无酚红完全培养基重悬，细胞浓度分别为1*10^6个/ml和，1.11*10^5个/ml。以100ul效应细胞和90ul靶细胞加至96孔板中并吹打混匀进行细胞铺板，此时靶细胞与效应细胞比例为10:1。每孔中加入不同浓度、靶向的脂质体10ul，吹打混匀。将96孔板放于细胞培养箱中24小时孵育。孵育结束后，以250g，4min离心96孔板，离心后吸取50ul上清液至新96孔板。以elisa法检测上清液中的ifn-γ。结果如图10所示，充分说明：本发明的多细胞靶向脂质体在有效介导未刺激淋巴细胞、体外扩增的淋巴细胞、体外激活的淋巴细胞、体外诱导分化的淋巴细胞对靶细胞的有效杀伤的同时，促进效应细胞的活化，促进细胞因子的产生和释放，并且产生的细胞因子具有抗肿瘤活性，且具有剂量依赖关系。实施例6、多细胞靶向脂质体作用机制研究将效应细胞(未刺激的人淋巴细胞)和靶细胞(raji细胞)以无酚红完全培养基重悬，细胞浓度分别为1.11*10^6个/ml和，1.11*10^5个/ml。以90ul效应细胞和90ul靶细胞加至96孔板中并吹打混匀进行细胞铺板，此时靶细胞与效应细胞比例为10:1。每孔中加入多细胞靶向脂质体10ul，吹打混匀。每孔加入10ulegta/mgcl2，终浓度为0、0.1、1、10mm，吹打混匀。将96孔板放于细胞培养箱中24小时孵育。孵育结束前45分钟向体积校正对照孔和靶细胞最大裂解孔中加入10ul裂解液。孵育结束后，以250g，4min离心96孔板，离心后吸取50ul上清液至新96孔板，再向新孔板中加入50ulldh底物，22℃孵育15分钟。孵育结束后在酶标仪中以490nm波长下检测吸光度。结果如图11所示，充分说明：本发明的多细胞靶向脂质体介导的效应细胞对靶细胞的杀伤作用，是基于效应细胞的钙离子依赖的颗粒酶/穿孔素途径。实施例7、多细胞靶向脂质体靶向药物输送作用评价通过后插法制备载药的多细胞靶向脂质体；对于多细胞靶向载药脂质体，将制备的抗cd19及抗cd3fab’片段-高分子-脂质连接物dspe-peg2000-mal-fab’与达沙替尼载药脂质体按照摩尔比0.1-5:0.1-5:1000混合，n2保护下37℃恒温震荡反应24h，然后通过300kd超滤洗涤脂质体5次除去未结合抗体fab’片段，得到多细胞靶向达沙替尼脂质体。将效应细胞(未刺激淋巴细胞)和靶细胞(raji细胞)以无酚红完全培养基重悬，细胞浓度分别为1*10^6个/ml和，1.11*10^5个/ml。以100ul效应细胞和90ul靶细胞加至96孔板中并吹打混匀进行细胞铺板，此时靶细胞与效应细胞比例为1:10。每孔中加入不同达沙替尼浓度、相同脂质浓度的多细胞靶向载药脂质体10ul，吹打混匀。将96孔板放于细胞培养箱中24小时孵育。孵育结束前45分钟向体积校正对照孔和靶细胞最大裂解孔中加入10ul裂解液。孵育结束后，以250g，4min离心96孔板，离心后吸取50ul上清液至新96孔板，再向新孔板中加入50ulldh底物，22℃孵育15分钟。孵育结束后在酶标仪中以490nm波长下检测吸光度。结果如图12所示，充分说明：通过将主要抗体和辅助抗体连接在载药脂质体上，可以在多细胞靶向作用机制的基础上，充分发挥荷载药物的作用。以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。序列表<110>上海交通大学<120>一种多细胞靶向脂质体<130>171715<160>16<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>107<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1aspileglnmetthrglnthrthrserserleuseralaserleugly151015aspargvalthrilesercysargalaserglnaspileargasntyr202530leuasntrptyrglnglnlysproaspglythrvallysleuleuile354045tyrtyrthrserargleuhisserglyvalproserlysphesergly505560serglyserglythrasptyrserleuthrileserasnleuglugln65707580gluaspilealathrtyrphecysglnglnglyasnthrleuprotrp859095thrphealaglyglythrlysleugluilelys100105<210>2<211>122<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gluvalglnleuglnglnserglyprogluleuvallysproglyala151015sermetlysilesercyslysalaserglytyrserphethrglytyr202530thrmetasntrpvallysglnserhisglylysasnleuglutrpmet354045glyleuileasnprotyrlysglyvalserthrtyrasnglnlysphe505560lysasplysalathrleuthrvalasplysserserserthralatyr65707580metgluleuleuserleuthrsergluaspseralavaltyrtyrcys859095alaargserglytyrtyrglyaspserasptrptyrpheaspvaltrp100105110glyglnglythrthrleuthrvalpheser115120<210>3<211>236<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>3metaspmetargvalproalaglnleuleuglyleuleuleuleutrp151015leuargglyalaargcysaspileglnmetthrglnserproserser202530leuseralaservalglyaspargvalthrilethrcysargalaser354045glnaspvalasnthralavalalatrptyrglnglnlysproglylys505560alaprolysleuleuiletyrseralaserpheleutyrserglyval65707580proserargpheserglyserargserglythraspphethrleuthr859095ileserserleuglnprogluaspphealathrtyrtyrcysglngln100105110histyrthrthrproprothrpheglyglnglythrlysvalgluile115120125lysargthrvalalaalaproservalpheilepheproproserasp130135140gluglnleulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasn145150155160phetyrproargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleu165170175glnserglyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysasp180185190serthrtyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyr195200205glulyshislysvaltyralacysgluvalthrhisglnglyleuser210215220serprovalthrlysserpheasnargglyglucys225230235<210>4<211>237<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>4metglupheglyleusertrpvalpheleuvalalaileleulysgly151015valglncysgluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalgln202530proglyglyserleuargleusercysalaalaserglypheasnile354045lysaspthrtyrilehistrpvalargglnalaproglylysglyleu505560glutrpvalalaargiletyrprothrasnglytyrthrargtyrala65707580aspservallysglyargphethrileseralaaspthrserlysasn859095thralatyrleuglnmetasnserleuargalagluaspthralaval100105110tyrtyrcysserargtrpglyglyaspglyphetyralametasptyr115120125trpglyglnglythrleuvalthrvalserseralaserthrlysgly130135140proservalpheproleualaproserserlysserthrserglygly145150155160thralaalaleuglycysleuvallysasptyrpheprogluproval165170175thrvalsertrpasnserglyalaleuthrserglyvalhisthrphe180185190proalavalleuglnserserglyleutyrserleuserservalval195200205thrvalproserserserleuglythrglnthrtyrilecysasnval210215220asnhislysproserasnthrlysvalasplyslysval225230235<210>5<211>119<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>5glnvalglnleulysglnserglyproglyleuvalglnprosergln151015serleuserilethrcysthrvalserglypheserleuthrasntyr202530glyvalhistrpvalargglnserproglylysglyleuglutrpleu354045glyvaliletrpserglyglyasnthrasptyrasnthrprophethr505560serargleuserileasnlysaspasnserlysserglnvalphephe65707580lysmetasnserleuglnserasnaspthralailetyrtyrcysala859095argalaleuthrtyrtyrasptyrgluphealatyrtrpglyglngly100105110thrleuvalthrvalserala115<210>6<211>107<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>6aspileleuleuthrglnserprovalileleuservalserprogly151015gluargvalserphesercysargalaserglnserileglythrasn202530ilehistrptyrglnglnargthrasnglyserproargleuleuile354045lystyralasergluserileserglyileproserargphesergly505560serglyserglythraspphethrleuserileasnservalgluser65707580gluaspilealaasptyrtyrcysglnglnasnasnasntrpprothr859095thrpheglyalaglythrlysleugluleulys100105<210>7<211>121<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>7glnvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvallysproglyglu151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheserasptyr202530tyrmettyrtrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045alaileileseraspglyglytyrtyrthrtyrtyrseraspileile505560lysglyargphethrileserargaspasnalalysasnserleutyr65707580leuglnmetasnserleulysalagluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargglypheproleuleuarghisglyalametasptyrtrpgly100105110glnglythrleuvalthrvalserser115120<210>8<211>107<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>8aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcyslysalaserglnasnvalaspthrasn202530valalatrptyrglnglnlysproglyglnalaprolysserleuile354045tyrseralasertyrargtyrseraspvalproserargphesergly505560seralaserglythraspphethrleuthrileserservalglnser65707580gluaspphealathrtyrtyrcysglnglntyraspsertyrprotyr859095thrpheglyglyglythrlysleugluilelys100105<210>9<211>450<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>9gluvalglnleuleugluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr202530ilemetmettrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045serseriletyrproserglyglyilethrphetyralaaspthrval505560lysglyarg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