RS504393在制备治疗吉西他滨化疗中断膀胱癌的药物中的应用的制作方法

本发明涉及医药技术领域，特别涉及rs504393的新用途，具体涉及rs504393在制备治疗吉西他滨化疗中断膀胱癌的药物中的应用。

背景技术：

膀胱癌是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤。世界范围内，每年膀胱癌新发病例多达300000例，且死亡率呈增加趋势，此外，膀胱癌具有高复发率，易侵袭和迁移等特性。手术治疗是膀胱癌的主要治疗手段，化疗也逐渐成为膀胱癌治疗的方式。目前，膀胱癌化疗效果有限，其原因尚待研究。

吉西他滨是一种重要的肿瘤化疗药物，通过转运至细胞内转化为活性成分发挥抑癌作用。吉西他滨因其良好的疗效和较弱的副作用应用于膀胱癌的化疗中，除此之外，研究提示它也具有免疫调控作用，影响着免疫抑制细胞m-mdscs的水平。在临床应用中，吉西他滨常联合顺铂二联用药化疗，具有骨髓抑制，恶心呕吐等副作用，常引起用药中断。吉西他滨用药中断引起的生物学改变目前仍不清楚。

mdscs是一种与肿瘤免疫抑制微环境相关的免疫细胞，研究发现，多种肿瘤中，mdscs大量蓄积。mdscs主要有两种亚型，分别为g-mdscs和m-mdscs，虽然g-mdscs数量较多，但是m-mdscs的免疫抑制作用更强。m-mdscs的蓄积可能是肿瘤预后不良的原因之一。减少mdscs的蓄积，将可能消除mdscs对机体抗肿瘤免疫的抑制，进一步抑制肿瘤的发展，改善肿瘤预后。如专利文献cn103626846a，公开日2014.03.12，公开了一种与mdscs特异性结合的配体多肽及药物输送系统，所述药物输送系统具体为脂质体，包括与mdscs特异性结合的配体多肽、载药系统、至少一种活性或显像物质，该药物输送系统具有很好的mdscs靶向作用，可作为针对肿瘤的靶向药物输送系统。该专利文献即期望通过靶向mdscs治疗肿瘤。

ccl2是一种细胞因子，在m-mdscs向肿瘤微环境趋化的过程中发挥着重要的作用。人类ccl2以包含23个氨基酸组成的信号肽分子的前体蛋白形式分泌，在翻译后加工过程中与信号肽解离，完整的ccl2由76个氨基酸残基构成。人类ccl2由包括正常组织细胞、白细胞及一些肿瘤细胞等多种细胞分泌。在正常组织细胞中，ccl2的主要细胞来源是内皮细胞、成纤维细胞及单核细胞。而在部分肿瘤细胞株，例如前列腺癌细胞、乳腺癌细胞中也发现存在ccl2的表达。ccl2可以结合的趋化因子受体包括ccr2、ccr4、ccr10。

rs504393，化学名称：6-甲基-1′-[2-(5-甲基-2-苯基-4-恶唑基)乙基]螺[4h-3,1-苯并恶嗪-4,4′-哌啶]-2(1h)-酮，分子式：c25h27n3o3，cas号：300816-15-3，是一种选择性的ccr2拮抗剂。

专利文献cn107041954a，公开日2017.08.15，公开了hoxa1在制备抗肿瘤药物中的用途，特别是在制备抑制髓源性抑制细胞mdscs的免疫抑制功能的药物中的应用，该发明证实：hoxa1能够调控肿瘤条件下mdscs的免疫抑制效应，与癌旁组织相比，肺癌患者肿瘤组织来源mdscs中hoxa1的表达显著下调，该发明进一步实验证明当hoxa1过量表达时，可以有效延缓荷瘤小鼠肿瘤生长并促进th1/ctl介导的抗肿瘤免疫应答。

但目前未见通过rs504393治疗肿瘤，尤其是治疗吉西他滨化疗中断膀胱癌的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供rs504393的新的制药用途。

第一方面，本发明提供了rs504393在制备治疗吉西他滨化疗中断膀胱癌的药物中的应用。

第二方面，本发明提供了含有rs504393的组合物在制备治疗吉西他滨化疗中断膀胱癌的药物中的应用。

作为一个优选例，所述的rs504393是作为组合物的活性成分。

作为一个优选例，所述的组合物还包含药学上可接受的载体。

第三方面，本发明提供了rs504393在制备治疗膀胱癌的药物中的应用。

第四方面，本发明提供了含有rs504393的组合物在制备治疗膀胱癌的药物中的应用。

作为一个优选例，所述的rs504393是作为组合物的活性成分。

作为一个优选例，所述的组合物还包含药学上可接受的载体。

第五方面，本发明提供了rs504393在制备延长吉西他滨化疗中断膀胱癌患者的生存期的药物中的应用。

第六方面，本发明提供了rs504393在制备延长膀胱癌患者的生存期的药物中的应用。

本文中，所述的“吉西他滨化疗中断膀胱癌”是指已经给予了吉西他滨化疗，然而在化疗过程中，因接受化疗的个体出现了不能耐受的副反应(如骨髓抑制，恶心呕吐)而导致必须中断化疗的膀胱癌类型，该类型膀胱癌中出现m-mdscs的大量蓄积。

所述的“含有rs504393的组合物”，其可以只含有rs504393一种活性成分，还可以含有除rs504393以外的其他活性成分。该组合物是药剂学上所说的任何一种剂型，包括片剂、胶囊剂、软胶囊、凝胶剂、口服剂、混悬剂、冲剂、贴剂、软膏、丸剂、散剂、注射剂、输液剂、冻干注射剂、静脉乳剂、脂质体注射剂、栓剂、缓释制剂或控释制剂。

所述的“药学上可接受的载体”是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂和水等，填充剂如淀粉、蔗糖，乳糖、微晶纤维素等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；润湿剂如甘油；崩解剂如羧甲基淀粉钠、羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素、琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇、十二烷基硫酸钠；吸附载体如高龄土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、微粉硅胶和聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明优点在于：

1、本发明通过实验研究分析，发现吉西他滨能促进膀胱癌细胞ccl2生成，进而促进m-mdscs的募集。m-mdscs具有很强的免疫抑制作用，能为膀胱癌进展提供有益的免疫环境，rs504393是高效的ccl2受体ccr2的抑制剂，能有效阻断ccl2对m-mdscs的募集作用，从而减少了吉西他滨的副反应，改善预后，显著延长吉西他滨化疗中断膀胱癌动物模型的生存期。吉西他滨是一种重要的肿瘤化疗药物，却具有骨髓抑制、恶心呕吐等副作用，令患者无法耐受，常引起用药中断，造成预后不佳，这是临床肿瘤治疗的一大难题。本发明为膀胱癌的临床治疗提供了新方法和新思路，即通过给予rs504393治疗，延长吉西他滨化疗中断膀胱癌患者生存期，改善预后。

2、本发明的体内实验还证实了rs504393能够延长膀胱癌动物模型的生存期，且作用十分明显，因此rs504393可用于制备治疗膀胱癌的药物。

附图说明

附图1是吉西他滨的化学结构式。

附图2是吉西他滨有效杀伤膀胱癌细胞。其中，gemcitabine：吉西他滨；5637、t24：人膀胱癌细胞系；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；ns：无显著差异。

附图3是吉西他滨促进膀胱癌细胞对m-mdsc的募集。其中，m-mdsc：单核系骨髓来源免疫抑制细胞；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；ns:无显著差异。

附图4是吉西他滨促进膀胱癌细胞ccl2生成。其中，ccl2：单核细胞趋化蛋白-1；mfi：平均荧光密度；***p<0.001。

附图5是rs504393的化学结构式。

附图6是ccr2拮抗剂rs504393抑制膀胱癌细胞对m-mdsc的募集。其中，m-mdsc：单核系骨髓来源免疫抑制细胞；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；ns：无显著差异。

附图7是ccr2拮抗剂抑制吉西他滨处理膀胱癌细胞后m-mdsc的募集。其中，ccr2：cc趋化因子受体2；ccr2antagonist：ccr2拮抗剂；ctrl：对照组。

附图8是实施例4的实验方法示意图。

附图9是ccr2抑制剂延长吉西他滨化疗中断后的生存时间。其中，ctrl：对照组；continuouschemotherapy：持续吉西他滨化疗组；discontinuance：吉西他滨化疗中断组；ccr2antagonist：ccr2拮抗剂组。对于b图中的每幅图，位于上方的标注代表左侧的折线，位于下方的标注代表右侧的折线。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1吉西他滨处理膀胱癌细胞后促进m-mdscs的募集

吉西他滨是一种二氟核苷类抗肿瘤制剂，能破坏细胞复制的二氟核苷类抗代谢物(图1)。不同浓度(0,0.001,0.01,0.1,1,10nm)吉西他滨处理膀胱癌细胞系(t24和5637)48小时和1nm吉西他滨处理膀胱癌细胞系(t24和5637)不同时间(1,2,3,4天)后，cck-8细胞活性实验显示，吉西他滨对膀胱癌细胞系(t24和5637)有较强的抑制作用(图2)。不同浓度(0,0.1,1,10nm)吉西他滨处理膀胱癌细胞系(t24和5637)96小时后，更换细胞培养液，继续培养48小时后，细胞上清用于m-mdscs的趋化实验，随着吉西他滨浓度的增加，细胞上清对m-mdscs的募集作用越强(图3)。

实施例2吉西他滨促进膀胱癌细胞生成ccl2

1nm吉西他滨处理膀胱癌细胞后，收集细胞，运用qrt-pcr检测细胞ccl2的转录水平(图4中a)。收集细胞上清，elisa法检测ccl2蛋白水平(图图4中b)。收集吉西他滨处理后的膀胱癌细胞，流式细胞技术分析ccl2的平均荧光密度(图4中c)。实验发现，吉西他滨处理的膀胱癌细胞中ccl2水平明显增加。

实施例3ccr2拮抗剂rs504393有效阻断吉西他滨引起的m-mdscs募集

rs504393是一种高效的ccr2拮抗剂(图5)。不同浓度rs504393(0,1,10,100nm)加入膀胱癌细胞上清后进行m-mdscs趋化实验，结果显示，随着rs504393水平增加，膀胱癌细胞对m-mdscs的募集作用逐渐减弱(图6)。1nm吉西他滨处理膀胱癌细胞后，100nmrs504393加入细胞上清进行趋化实验，48小时后，m-mdscs募集明显受限(图7)。

实施例4rs504393能提高吉西他滨化疗中断膀胱癌小鼠的预后

10⁷个小鼠膀胱癌细胞系mbt-2皮下注射8周c3h/he小鼠构建小鼠膀胱癌模型。建模1周后，将小鼠随机分组，吉西他滨处理组小鼠每周注射一次吉西他滨(20mg/kg,i.p.)，吉西他滨化疗中断组小鼠在吉西他滨化疗1次后中断化疗(图8)，一半的吉西他滨化疗中断组小鼠接受rs504393(2mg/kg,i.p.)处理，结果显示，吉西他滨化疗能有效改善膀胱癌小鼠的预后，化疗中断小鼠预后不佳，rs504393能有效改善化疗中断小鼠的疾病预后(图9)。

本发明经体外和体内试验结果证实，吉西他滨促进膀胱癌细胞生成ccl2，进而募集m-mdscs。吉西他滨化疗中断会使膀胱癌患者预后不佳，rs504393通过阻断m-mdscs募集，改善患者预后。

目前已知的ccl2可结合的受体有多种，ccr2是其中的一种，ccr2拮抗剂有很多种，其代谢途径以及作用机制不完全相同，本发明则证实了ccr2拮抗剂中的rs504393具有确切的降低膀胱癌对m-mdscs的募集作用，能改善膀胱癌动物模型生存期，其作用机制还有待进一步探讨。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。