本发明涉及了肠道菌群在dcf1相关抑郁行为中的应用，特别是肠道菌群在制备治疗dcf1缺失引起抑郁行为药物中的应用。
发明背景
近年来，抑郁症成为威胁人类健康状况的一种重要精神疾病，以显著而持久的心境低落与意志活动减退为主要临床特征。然而抑郁症的发病机制非常复杂，一般认为遗传、神经生化、神经内分泌、心理与社会环境等诸多因素参与了抑郁症的发病过程，但目前还不清楚其具体病因。目前研究显示，抗抑郁药有效率仅为60%～80%，治愈率也仅为30%，起效时间2～4周。但心理治疗起效更慢，导致很多患者并不接受治疗。因此提高患者依从性很有必要。
树突细胞因子（dcf1），也叫作跨膜蛋白59（tmem59），是一种膜蛋白，早先发现它与神经干细胞的分化有关。新近研究结果表明，aav介导的小鼠模型tmem59l（tmem59为其同源体）的敲低可显着改善半胱氨酸蛋白酶-3激活，增加强制游泳试验期间减少小鼠模型不动时间，导致小鼠模型抑郁类似行为。dcf1缺失引起树突棘发育不良，而树突棘动态平衡的破坏会导致抑郁。dcf1已经被证明可能是一种治疗抑郁症病人的新靶点。
肠道菌群作为一类数量众多、种类丰富的微生物，现有研究表明肠道微生物的改变与许多精神疾病相关，其中与抑郁症的发生发展具有很大的相关性。益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，益生菌在调节肠道微生态方面具有重要作用，补充益生菌可以直接改变肠道菌群的构成和功能。近年来发现乳杆菌和双歧杆菌等常见益生菌能影响抑郁样行为，并与某些神经递质和神经受体的释放和活性密切相关。其中乳杆菌和双歧杆菌的菌种能分泌γ-氨基丁酸（γ－aminobutyricacidgaba），gaba作为一种抑制性神经递质，其在抑郁等相关疾病中会表现出功能的失调。因此肠道菌群可能是一种治疗抑郁症病人的新途径。
粪菌移植（fecalmicrobiotatransplantation，fmt）作为一种历史悠久且可以重建肠道菌群的疗法重新被临床所关注，即将健康人粪便中的功能菌群，通过一定方式移植到病人肠道内，调节肠道菌群失衡，重建具有正常功能的肠道微生态系统，为治疗肠道内及肠道外疾病提供帮助。目前已确定fmt对复发性难辨梭菌感染（rcdi）具有较好的疗效且无不良反应。这就说明了fmt具有作为抑郁症治疗的潜能。
首先对正常小鼠模型和抑郁样小鼠模型的肠道菌群组成进行分析，借助灌胃技术进行粪菌液和菌群移植，研究肠道菌群对抑郁行为的影响，同时探究由于肠道菌群改变引起的抑郁的可能发病机制，为fmt治疗抑郁症奠定理论基础。
技术实现要素：
本发明的目的在于肠道菌群在制备治疗dcf1缺失引起抑郁行为药物中的应用。
技术方案：本发明通过16srrna基因测序对dcf1敲除模型小鼠模型和正常模型小鼠模型的粪便进行检测，比较dcf1敲除小鼠模型模型和正常小鼠模型模型肠道菌群组成差异。采用灌胃技术，向正常小鼠模型模型体内移植dcf1敲除小鼠模型模型的粪便，向dcf1敲除小鼠模型模型体内移植乳杆菌和双歧杆菌。菌群移植后进行强迫游泳行为学，检测菌群移植对dcf1敲除小鼠模型模型和正常小鼠模型模型抑郁行为的影响。此外，使用glu试剂盒和gaba试剂盒检测未进行菌群移植的dcf1敲除小鼠模型模型和正常小鼠模型模型以及菌群移植后dcf1敲除小鼠模型模型和正常小鼠模型模型海马中神经递质glu和gaba含量，以及利用qpcr和westernblot分别在mrna水平和蛋白水平检测四种gaba受体（gabra1\gabra2\gabrb2\gabrg2）的表达情况，对肠道菌群改变引起抑郁的可能机制进行探究。
本发明通过16srrna基因测序方法分析dcf1敲除小鼠模型模型和正常小鼠模型模型肠道菌群的组成差异，继而采用菌群移植、强迫游泳、glu检测、gaba检测、qpcr、westernblot等方法对dcf1敲除诱导抑郁行为的可能机制进行探究。结果表明，dcf1敲除小鼠模型模型和正常小鼠模型肠道微生物的构成存在差异，移植了dcf1敲除小鼠模型模型粪便的正常小鼠模型表现出抑郁样行为。双歧杆菌和乳杆菌灌胃处理后的dcf1敲除小鼠模型抑郁样行为缓解。菌群移植后小鼠模型脑内glu、gaba和gaba受体含量发生改变。因此，dcf1敲除小鼠模型肠道菌群的改变可能是诱发其抑郁样行为的原因，肠道菌群改变导致神经递质如glu和gaba的失衡及gaba受体的功能紊乱可能参与抑郁症发生。
附图说明
图1为：菌群移植前强迫游泳行为学检测结果。菌群移植前wt小鼠模型和ko小鼠模型强迫游泳中保持保持绝望行为的时间；数据以平均值±sem表示，与对照组相比较，*p<0.05；**p＜0.01；***p＜0.001。
将wt小鼠模型和ko小鼠模型逐个放置在盛有清水的透明圆桶中（水深35cm,水温:室温（25±1℃）;透明玻璃圆桶:直径20cm高46cm），计时6分钟，记录后4分钟小鼠模型的活动状态。当观察到小鼠模型身体不动或四肢有轻微划动时，将其行为定义为绝望行为。统计小鼠模型保持绝望行为的时间。
图2为：ko组小鼠模型与wt组肠道微生物群落的α多样性的比较。（a）sorbs指数；（b）辛普森均匀度的upgma分析三维图；（c）ko组与wt组肠道微生物群落差异的upgma分析三维图。
选取spf动物房饲养的成年雄性小鼠模型采集粪便，用无菌镊子将自然排出的新鲜小鼠模型粪便放入无菌干燥收集管内，送至美吉生物测序公司测序。通过illuminamiseq平台测序，利用云平台对测序数据进行α多样性的比较。
图3为：（a）ko组和wt组粪便微生物的out组成；（b）ko组粪便微生物在门（phylum）水平上的群落结构和物种丰度（c）wt组粪便微生物在门（phylum）水平上的群落结构和物种丰度（d）ko组和wt组粪便微生物在科（family）水平上的群落结构组成和物种丰度（e）ko组和wt组粪便微生物在属（genus）水平上的群落结构和物种丰度（f）ko组和wt组粪便微生物在门、纲、目、科、属、种水平（从内到外）的物种差异分析；（g）将ko组和wt组的肠道菌群16srrna测序结果通过云平台进行物种组成分析及物种差异分析。
图4为：菌群移植后小鼠模型强迫游泳行为学检测结果。菌群移植后各组小鼠模型强迫游泳保持绝望行为的时间；数据以平均值±sem表示，与对照组相比较，*p<0.05；**p＜0.01；***p＜0.001。
将菌群移植后的小鼠模型和未进行菌群移植的对照组小鼠模型逐个放置在盛有清水的透明圆桶中（水深35cm,水温:室温（25±1℃）;透明玻璃圆桶:直径20cm高46cm），计时6分钟，记录后4分钟小鼠模型的活动状态。当观察到小鼠模型身体不动或四肢有轻微划动时，将其行为定义为绝望行为。统计小鼠模型保持绝望行为的时间。
图5为：各组小鼠模型海马中神经递质glu和gaba含量。（a）各组小鼠模型海马中glu含量比较；（b）各组小鼠模型海马中gaba含量比较。数据以平均值±sem表示，与对照组相比较，*p<0.05；**p＜0.01；***p＜0.001。
将菌群移植后小鼠模型和未进行菌群移植的对照组小鼠模型分别断颈取脑，在预冷的pbs中分离海马，取各组实验小鼠模型的海马约0.2g，分别加入2ml试剂一（1:10），冰浴匀浆，8000g常温离心10min，取上清保存，利用生化法检测glu含量。
将菌群移植后小鼠模型和未进行菌群移植的对照组小鼠模型分别断颈取脑，在预冷的pbs中分离海马，称重，加入一定量的pbs，冰浴匀浆，2000-3000rpm，离心20min，收集上清保存，酶联免疫吸附分析法检测gaba含量。
图6为：菌群移植后各组小鼠模型海马中gabra1、gabra2、gabrb2、gabrg2表达情况。（a）各组小鼠模型海马组织qpcr电泳图（b）各组小鼠模型海马中gabra1,gabra2,gabrb2,gabrg2的分子表达水平（c）各组小鼠模型海马组织westernblot电泳图（d）各组小鼠模型海马中gabra1,gabra2,gabrb2,gabrg2的蛋白表达水平。数据以平均值±sem表示，与对照组相比较，*p<0.05；**p＜0.01；***p＜0.001。
将菌群移植后小鼠模型和未进行菌群移植的对照组小鼠模型分别将小鼠模型断颈处死，迅速取出小鼠模型的脑组织。冰上分离实验小鼠模型海马组织，转移至玻璃匀浆器研磨破碎后抽提rna,将rna反转录成cdna后进行qpcr检测gaba受体gabra1,gabra2,gabrb2,gabrg2的mrna表达水平；此外，小鼠模型断颈处死后，冰上分离小鼠模型海马组织，转移至玻璃匀浆器研磨破碎后抽提蛋白，利用westernblot检测gaba受体gabra1,gabra2,gabrb2,gabrg2的蛋白表达水平。（图中呈现出中间空白，是因为纵坐标上下两部分的刻度单位不一致，因而在纵坐标设置了断点）。
具体实施方式
实施例一：强迫游泳
在porsolt实验的基础上进行修改，强制游泳实验用于检验dcf1敲除小鼠模型和wt小鼠模型的抑郁行为。将小鼠模型放置在盛有清水的透明圆桶中（水深35cm,水温:室温（25±1℃）;透明玻璃圆桶:直径20cm高46cm），计时6分钟，记录后4分钟小鼠模型的活动。当观察到小鼠模型身体不动或四肢有轻微划动时，将其行为定义为绝望行为。统计小鼠模型保持绝望行为的时间（图1）。
实施例二：粪便收集及检测
粪便样品均来自spf动物房饲养的成年雄性小鼠模型。用无菌镊子将自然排出的新鲜小鼠模型粪便放入无菌干燥收集管内，放置于冰盒上，30min内送回实验室，送至美吉生物测序公司测序。粪便样品测序采用illuminamiseq平台。
实施例三：菌群分析
对测序结果进行了物种多样性分析，物种组成分析，两组样本的比较分析，物种差异分析等分析处理。通过上述分析比较旨在找出dcf1ko小鼠模型和wt小鼠模型粪便中微生物组成的差异及各组样本中的优势物种（图2，3）。
实施例四：菌群移植后强迫游泳
在porsolt实验的基础上进行修改，强制游泳实验用于检验菌群移植后dcf1敲除小鼠模型和wt小鼠模型的的抑郁行为。将小鼠模型放置在盛有清水的透明圆桶中（水深35cm,水温:室温（25±1℃）;透明玻璃圆桶:直径20cm高46cm），计时6分钟，记录后4分钟小鼠模型的活动。当观察到小鼠模型身体不动或四肢有轻微划动时，将其行为定义为绝望行为。统计小鼠模型保持绝望行为的时间（图1）。
实施例五：肠道微生物移植
选取正常健康成年ko小鼠模型粪便，制备粪菌液；按一定浓度分别制备双歧杆菌菌液和乳杆菌菌液。通过灌胃针分别对不同组别实验小鼠模型进行不同菌群定植，连续六天。菌群定植一周后进行一次行为学实验，菌群定植两周后进行第二次行为学实验，随后尽快对小鼠模型进行取材。
实施例六：海马中神经递质glu含量检测
将菌群移植后小鼠模型和未进行菌群移植的对照组小鼠模型分别断颈取脑，在预冷的pbs中分离海马，取各组实验小鼠模型海马约0.2g，分别加入2ml试剂一（1:10），冰浴匀浆，8000g常温离心10min，取上清保存，酶联免疫吸附分析法检测glu含量。
实施例七：菌群移植后海马中gaba含量测定
将菌群移植后小鼠模型和未进行菌群移植的对照组小鼠模型分别断颈取脑，在预冷的pbs中分离海马，称重，加入一定量的pbs，冰浴匀浆，2000-3000rpm，离心20min，收集上清保存，酶联免疫吸附分析法检测gaba含量。
实施例八：rna抽提和反转录及实时荧光定量pcr
实验中所需ep管和枪头均已用depc水处理。按照试剂盒（eastepsuper总rna提取试剂盒）说明操作。将小鼠模型断颈处死，迅速取出小鼠模型的脑组织。冰上分离实验小鼠模型海马组织并放入1.5mlep管内，加入rna裂解液用研磨棒在冰上破碎组织，加入rna稀释液，70℃加热3分钟以提高rna得率，，将上清转移至一新的ep管中，加入50%上清体积的无水乙醇并吹打混匀，转移至吸附柱内，12000rpm离心1min，加入dna酶处理15min，rna洗液洗涤一次，在洗脱管内获得rna，之后逆转录获得cdna。利用荧光实时定量pcr(qpcr)测定gabra1、gabra2、gabrb2、gabrg2基因mrna水平，以gapdh为内参。反应条件：95℃变性15s，60℃延伸1min，40个循环。qpcr结果以2-δδct值表示（图6a,b）。
实施例九：westernblot
分离实验小鼠模型海马并用预冷的pbs洗涤2次，按照蛋白抽提试剂盒的生产说明书步骤抽提全蛋白。用sds-page电泳分离全蛋白，并电转于硝酸纤维素膜上，用5%bsa-pbs室温孵育1h，分别用一抗gapdh(1:1000)、gabra1（1：1000）、gabra2(1:1000)、gabrb2(1:1000)、gabrg2(1:1000)于4℃孵育过夜。然后，用红外染料700通道偶联的亲和纯化的山羊抗鼠igg的二抗和红外染料800通道偶联的亲和纯化的山羊抗兔igg的二抗于室温孵育1h。使用li-corodessey红外成像系统和li-cor软件同时对两种颜色的目的免疫条带进行检测和分析（图6c,d）。