本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种丝素蛋白基自愈合水凝胶及其制备方法。
背景技术：
近年来，水凝胶在生物医学领域的研究日益受到关注。高含水量、可注射微创的递送过程以及在任意尺寸和形状的空间内均匀分布的特征赋予水凝胶独特的优势。更重要的是，水凝胶模拟人体组织细胞外基质的三维空间结构，为细胞的生长提供良好的微环境。丝素蛋白是最具中国特色的天然高分子，同胶原、明胶、透明质酸、壳聚糖等相比，具有制备工艺温和、力学性能优异、炎症反应较低等优点。多种细胞的体内外实验均表明丝素蛋白材料能够显著增强细胞的粘附、迁移和生长，具有良好的生物相容性。同时，丝素蛋白还具有优异的可加工性和性能的可控性，通过改变其二级结构组成还可以实现对丝素蛋白材料力学性能、降解性能等的调控，以满足不同组织工程对材料性能的需要。基于丝素蛋白的上述性能，丝素蛋白水凝胶在组织修复与再生医学领域具有潜在的应用前景，受到科研人员的广泛研究。如公开号cn101502670a的中国专利，公开了一种丝素蛋白水凝胶的制备方法，该专利将丝素蛋白溶液进行超声波处理，制备丝素蛋白水凝胶。再如公开号cn102220017a的中国专利，公开了一种可注射成型的丝素蛋白水凝胶及其制备方法，该专利将丝素蛋白溶液和表面活性剂溶液混合，得到一种可注射成型的丝素蛋白水凝胶。然而，这些水凝胶都是通过丝素蛋白疏水端的物理交联和氢键作用形成的，交联结构不具有动态自愈性能，导致水凝胶容易受损断裂并产生凝胶碎片，不仅会破坏原有的结构和功能，而且会造成包埋于内部的活性物质逸散损失和活性降低。因此，开发新型的丝素蛋白水凝胶并能够自主修复裂缝、维持材料的结构性能的完整性是有必要的。
众所周知，人体组织受损时会主动发生复杂而高效的自我修复过程，如皮肤、血管等组织的自我愈合。模仿此过程构建的水凝胶即为自愈性水凝胶，能够自主修复断缝、维持凝胶的网络结构和性能的稳定性。目前，研究人员研究了各式各样的自愈性水凝胶体系，如主客体相互作用、配位相互作用、亚胺键、酰腙键等都常被应用于其中。如公开号cn103910894a的中国专利，公开了一种天然多糖自愈合水凝胶的制备方法，该专利通过亚胺键和酰腙键，制备得到具有自愈合性能的多糖高分子水凝胶。再如公开号cn107118357a的中国专利，公开了一种儿茶酚壳聚糖自愈合水凝胶材料及其制备方法，该专利通过配位作用以及diels-alder反应，制备儿茶酚壳聚糖自愈合水凝胶。考虑到医用水凝胶需要在生理条件下使用的特点，医用自愈性水凝胶倾向于不借助外界刺激（如光、热等），自适性地实现动态修复。主客体相互作用是生物体系中最常见的非共价键作用，生物体利用该非共价键作用组装形成的超分子聚合物具有分子级别的可逆性和动态的自我修复能力。受此启发，考虑到丝素蛋白良好的生物相容性、优异的可加工性、可控的力学性能以及适当的生物降解速率，利用主客体单元之间的可逆性结合作用构建自愈性丝素蛋白水凝胶，将会为药物递送、组织的缺损修复与功能再生等提供一种新型有效的材料载体。目前基于主客体相互作用的自愈性丝素蛋白水凝胶的研究还未见报道。
技术实现要素：
本发明公开一种丝素蛋白基自愈合水凝胶及其制备方法，目的在于解决现有丝素蛋白水凝胶存在受损断裂后产生凝胶碎片从而破坏凝胶网络结构和功能的稳定性。本发明以丝素蛋白为原料，对丝素蛋白的氨基酸侧链进行化学修饰，在其氨基酸侧链引入环糊精和胆固醇，通过主客体单元之间的可逆性结合作用，构建具有自愈合性能的丝素蛋白水凝胶，在生物医学领域具有重要的应用价值。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种丝素蛋白基自愈合水凝胶，以丝素蛋白分子为骨架，在丝素蛋白的氨基酸侧链引入主体—环糊精和客体—胆固醇，通过主客体单元之间的可逆性结合作用，所构建的丝素蛋白基自愈合水凝胶。
一种丝素蛋白基自愈合水凝胶的制备方法，具体步骤为：
1．制备丝素蛋白样品：
（1）蚕丝经脱胶、溶解、透析、过滤，制备成质量浓度为1%～10%的丝素蛋白水溶液；将丝素蛋白溶液在硼砂缓冲液中处理，获得硼砂改性的丝素蛋白溶液；
（2）再将丝素蛋白溶液与重氮盐反应，对丝素蛋白的酪氨酸残基进行羧基化修饰；然后与氯乙酸反应，对丝氨酸残基进行羧基化修饰；
（3）经透析后冷冻干燥，得到羧基化处理的丝素蛋白粉末；
2.制备丝素蛋白-环糊精溶液：
（1）将环糊精溶于二甲基亚砜溶液中，配成浓度为100mg/ml的环糊精溶液；
（2）将edc•hcl溶于二甲基亚砜溶液中，配成浓度为100mg/ml的edc•hcl溶液；
（3）将nhs溶于二甲基亚砜溶液中，配成浓度为50mg/ml的nhs溶液；
（4）将羧基化处理的丝素蛋白、环糊精溶液按照羧基与氨基的摩尔比为1:10的比例混合，待上述样品完全溶解后，向上述混合溶液中加入nhs和edc•hcl反应24h，透析冷冻干燥，制备丝素蛋白-环糊精粉末；
（5）将丝素蛋白-环糊精粉末溶于水，制备成质量浓度为1%～20%的丝素蛋白-环糊精溶液。
3.制备丝素蛋白-胆固醇溶液：
（1）将胆固醇溶于二氯甲烷溶液中，配成浓度为50mg/ml的胆固醇溶液；
（2）将4-二甲氨基吡啶溶于二氯甲烷溶液中，配成浓度为1mg/ml的4-二甲氨基吡啶溶液；
（3）将edc•hcl，溶于二甲基亚砜溶液中，配成浓度为100mg/ml的edc•hcl溶液；
（4）将羧基化处理的丝素蛋白、胆固醇溶液按照羧基与氨基的摩尔比为5:1的比例混合，加入二甲基亚砜和二氯甲烷，待上述混合样品完全溶解后，向上述混合溶液中加入4-二甲氨基吡啶和edc•hcl反应24h，透析冷冻干燥，制备丝素蛋白-胆固醇粉末；
（5）将丝素蛋白-胆固醇粉末溶于水，制备成质量浓度为1%～20%的丝素蛋白-胆固醇溶液。
4.将丝素蛋白-环糊精溶液和丝素蛋白-胆固醇溶液按照环糊精和胆固醇单元摩尔比为10:1～1:10比例混合均匀，得到自愈性丝素蛋白水凝胶。
本发明的显著优点在于：
本发明以丝素蛋白为原料，对丝素蛋白的氨基酸侧链进行化学修饰，在其氨基酸侧链引入环糊精和胆固醇，通过主客体单元之间的可逆性结合作用，构建具有自愈合性能的丝素蛋白水凝胶，具有自愈合性能的丝素蛋白水凝胶能够自主修复裂缝，维持水凝胶结构和性能的稳定性，有望减少活性物质的损失，并为组织的缺损修复与功能再生提供稳定的材料载体。值得关注的是，该水凝胶所组成原料丝素蛋白、环糊精和胆固醇均具有良好的生物相容性，为临床医学提供更为理想的医用材料。
附图说明
图1红外光谱图；红外数据表明丝素蛋白高分子上成功接枝环糊精和胆固醇；
图2受损及自愈后的丝素蛋白水凝胶；借助主客体间的可逆性相互结合作用，实现丝素蛋白水凝胶的自愈性。
具体实施方式
为了验证设计的可行性，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明应用不仅限于此。
实施例1
一种丝素蛋白基自愈合水凝胶的制备方法，具体步骤为：
1．蚕丝经脱胶、溶解、透析、过滤，制备成质量浓度为2%的丝素蛋白水溶液；将丝素蛋白溶液在硼砂缓冲液中处理，获得硼砂改性的丝素蛋白溶液；再将丝素蛋白溶液与重氮盐反应，对丝素蛋白的酪氨酸残基进行羧基化修饰；然后与氯乙酸反应，对丝氨酸残基进行羧基化修饰；经透析后冷冻干燥，得到羧基化处理的丝素蛋白粉末；
2.将环糊精溶于二甲基亚砜溶液中，配成浓度为100mg/ml的环糊精溶液；将edc•hcl溶于二甲基亚砜溶液中，配成浓度为100mg/ml的edc•hcl溶液；将nhs溶于二甲基亚砜溶液中，配成浓度为50mg/ml的nhs溶液；将2mg羧基化处理的丝素蛋白溶于20ml二甲基亚砜，加入354μl环糊精溶液、4μlnhs溶液和6μledc•hcl反应24h，透析冷冻干燥，制备丝素蛋白-环糊精粉末；将丝素蛋白-环糊精粉末溶于水，制备成质量浓度为2%的丝素蛋白-环糊精溶液；
3.将胆固醇溶于二氯甲烷溶液中，配成浓度为50mg/ml的胆固醇溶液；将4-二甲氨基吡啶溶于二氯甲烷溶液中，配成浓度为1mg/ml的4-二甲氨基吡啶溶液；将edc•hcl，溶于二甲基亚砜溶液中，配成浓度为100mg/ml的edc•hcl溶液；将2mg羧基化处理的丝素蛋白溶于10ml二甲基亚砜，加入10ml二氯甲烷、6μl胆固醇溶液、74μl4-二甲氨基吡啶溶液和6μledc•hcl反应24h，透析冷冻干燥，制备丝素蛋白-胆固醇粉末；将丝素蛋白-胆固醇粉末溶于水，制备成质量浓度为2%的丝素蛋白-胆固醇溶液；
4.将10ml丝素蛋白-环糊精溶液和2ml丝素蛋白-胆固醇溶液（按照环糊精和胆固醇单元摩尔比为5:1）混合均匀，得到质量浓度为2%的自愈性丝素蛋白水凝胶。制备的丝素蛋白水凝胶的吸水溶胀比达到185%。断裂后水凝胶碎片在25℃下愈合1h后成为完整的水凝胶片。附图2是自愈性丝素蛋白水凝胶。
实施例2
一种丝素蛋白基自愈合水凝胶的制备方法，具体步骤为：
1．蚕丝经脱胶、溶解、透析、过滤，制备成质量浓度为5%的丝素蛋白水溶液；将丝素蛋白溶液在硼砂缓冲液中处理，获得硼砂改性的丝素蛋白溶液；再将丝素蛋白溶液与重氮盐反应，对丝素蛋白的酪氨酸残基进行羧基化修饰；然后与氯乙酸反应，对丝氨酸残基进行羧基化修饰；经透析后冷冻干燥，得到羧基化处理的丝素蛋白粉末；
2.将环糊精溶于二甲基亚砜溶液中，配成浓度为100mg/ml的环糊精溶液；将edc•hcl溶于二甲基亚砜溶液中，配成浓度为100mg/ml的edc•hcl溶液；将nhs溶于二甲基亚砜溶液中，配成浓度为50mg/ml的nhs溶液；将20mg羧基化处理的丝素蛋白溶于200ml二甲基亚砜，加入3540μl环糊精溶液、40μlnhs溶液和60μledc•hcl反应24h，透析冷冻干燥，制备丝素蛋白-环糊精粉末；将丝素蛋白-环糊精粉末溶于水，制备成质量浓度为10%的丝素蛋白-环糊精溶液；
3.将胆固醇溶于二氯甲烷溶液中，配成浓度为50mg/ml的胆固醇溶液；将4-二甲氨基吡啶溶于二氯甲烷溶液中，配成浓度为1mg/ml的4-二甲氨基吡啶溶液；将edc•hcl，溶于二甲基亚砜溶液中，配成浓度为100mg/ml的edc•hcl溶液；将20mg羧基化处理的丝素蛋白溶于100ml二甲基亚砜，加入100ml二氯甲烷、60μl胆固醇溶液、740μl4-二甲氨基吡啶溶液和60μledc•hcl反应24h，透析冷冻干燥，制备丝素蛋白-胆固醇粉末；将丝素蛋白-胆固醇粉末溶于水，制备成质量浓度为20%的丝素蛋白-胆固醇溶液；
4.将40ml丝素蛋白-环糊精溶液和20ml丝素蛋白-胆固醇溶液（按照环糊精和胆固醇单元摩尔比为1:1）混合均匀，得到质量浓度为13.3%的自愈性丝素蛋白水凝胶。制备的丝素蛋白水凝胶的吸水溶胀比达到150%。断裂后水凝胶碎片在25℃下愈合2h后成为完整的水凝胶片。
实施例3
一种丝素蛋白基自愈合水凝胶的制备方法，具体步骤为：
1．蚕丝经脱胶、溶解、透析、过滤，制备成质量浓度为8%的丝素蛋白水溶液；将丝素蛋白溶液在硼砂缓冲液中处理，获得硼砂改性的丝素蛋白溶液；再将丝素蛋白溶液与重氮盐反应，对丝素蛋白的酪氨酸残基进行羧基化修饰；然后与氯乙酸反应，对丝氨酸残基进行羧基化修饰；经透析后冷冻干燥，得到羧基化处理的丝素蛋白粉末；
2.将环糊精溶于二甲基亚砜溶液中，配成浓度为100mg/ml的环糊精溶液；将edc•hcl溶于二甲基亚砜溶液中，配成浓度为100mg/ml的edc•hcl溶液；将nhs溶于二甲基亚砜溶液中，配成浓度为50mg/ml的nhs溶液；将50mg羧基化处理的丝素蛋白溶于500ml二甲基亚砜，加入8850μl环糊精溶液、100μlnhs溶液和150μledc•hcl反应24h，透析冷冻干燥，制备丝素蛋白-环糊精粉末。将丝素蛋白-环糊精粉末溶于水，制备成质量浓度为20%的丝素蛋白-环糊精溶液；
3.将胆固醇溶于二氯甲烷溶液中，配成浓度为50mg/ml的胆固醇溶液；将4-二甲氨基吡啶溶于二氯甲烷溶液中，配成浓度为1mg/ml的4-二甲氨基吡啶溶液；将edc•hcl，溶于二甲基亚砜溶液中，配成浓度为100mg/ml的edc•hcl溶液；将40mg羧基化处理的丝素蛋白溶于200ml二甲基亚砜，加入200ml二氯甲烷、120μl胆固醇溶液、1480μl4-二甲氨基吡啶溶液和120μledc•hcl反应24h，透析冷冻干燥，制备丝素蛋白-胆固醇粉末；将丝素蛋白-胆固醇粉末溶于水，制备成质量浓度为10%的丝素蛋白-胆固醇溶液；
4.将2.5ml丝素蛋白-环糊精溶液和50ml丝素蛋白-胆固醇溶液（按照环糊精和胆固醇单元摩尔比为1:10）混合均匀，得到质量浓度为10.5%的自愈性丝素蛋白水凝胶。制备的丝素蛋白水凝胶的吸水溶胀比达到130%。断裂后水凝胶碎片在25℃下愈合0.5h后成为完整的水凝胶片。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。