金簇分子的新用途的制作方法

本发明涉及金簇分子的新用途，属于类风湿性关节炎的治疗领域。

背景技术：

类风湿性关节炎的特征在于由滑膜细胞增殖引起的持续性炎症、疼痛和关节肿胀。技术人员已经为寻找治疗这种疾病的方案做出了巨大的努力。虽然炎症涉及引起类风湿性关节炎，但许多经典抗炎药物在预防或治疗类风湿性关节炎方面无效，类风湿关节炎患者未能对许多经典抗炎药物作出反应，而且不同阶段的这种疾病对治疗有不同的反应。针对详细的测试结果，参见k.phadke等，immunopharmacology，标题为“各种抗关节炎药物在ii型胶原诱导的小鼠关节炎模型中的评价效果”(evaluationoftheeffectsofvariousanti-arthriticdrugsontypeiicollagen-inducedmousearthritismodel,1985,卷10,51-60页)，此文章的全部内容通过引用并入。

尽管在很大程度上尚未解决潜在的和有时的显著的毒性问题，但涉及可注射和口服形式的口服金药即金诺芬(auranofin)的金疗法仍然是类风湿性关节炎的有效治疗方法。

口服施用的金诺芬形式是不溶于水的白色无味结晶固体。该粉末不稳定，须避光和避热。化学物质复合金(i)是化学名为2,3,4,6-四-邻乙酰基-1-硫代-β-d-吡喃葡糖酸-s-(三乙基-膦)-金(2,3,4,6-tetra-o-acetyl-1-thio-β-d-glucopyranosato-s-(triethyl-phosphine)-gold)的金诺芬中的活性成分，其中三乙基膦基团使金(i)硫醇复合物稳定(如图2a、图2b和图2c)。金诺芬有很多副作用。腹泻是最常见的报道，因为该药物改变了通过结肠和在肠道运输过程中的盐和水的吸收。其它副作用包括据患者报道经历过的严重的皮疹、蛋白尿、眼睛问题、再生障碍性贫血和血液毒性反应。

类风湿性关节炎仍然是与进行性残疾、系统性并发症和早期死亡相关的最常见的疾病。目前的疾病改变疗法仅产生有限或部分反应。尚缺乏可靠的预测性的治疗反应和毒性。因为滑膜炎症往往会持续存在，对于类风湿性关节炎而言而言，持续缓解几乎是不可能实现的，并且需要持续的药物治疗，因此，本领域迫切需要开发用于治疗类风湿性关节炎的安全治疗剂。

技术实现要素：

有鉴于上述现实需要，本发明的目的在于提供新的治疗类风湿性关节炎的方法。

本发明实验证实了金簇分子(亦可称为金属金簇分子，金簇复合分子，金属金簇复合分子，金簇络合物，金属金簇络合物)在动物模型中具有积极的抗炎和抗风湿作用，这表明金簇分子作为类风湿性关节炎治疗剂的新范畴的巨大潜力。更为重要的是，金簇分子在体内没有明显毒性的性质，这种安全性对于一旦治疗停止则症状恢复的类风湿性关节炎患者而言是极有益的，因为其不产生或很少产生副作用。

因而，本发明提供金簇分子在制备用于预防、减轻和/或治疗类风湿性关节炎和/或抗炎的药物中的应用；其中，所述金簇分子具有金(0)m(稳定剂)n结构式，式中m，n分别表示0价金与稳定剂的个数，均为不为零的整数，所述稳定剂是为使0价金稳定。

在一些实施方式中，所述的稳定剂中含有能使0价金原子稳定的基团，该基团例如包括硫醇基、胍基、酰胺基、咪唑基、硒醇基、膦基、氨基、胺基、羧基、羟基中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述的稳定剂包括含所述基团的peg、含所述基团的plga、蛋白质、糖、核酸、肽中的一种或多种，所述肽例如包括聚赖氨酸、聚精氨酸、聚天冬酰胺、聚天冬氨酸、聚天冬氨酸盐、聚谷氨酸盐和谷胱甘肽中的一种或多种；所述聚天冬氨酸盐例如为聚天冬氨酸钠盐。

在一些实施方式中，所述金簇分子具有结构式aum-(肽)n或(肽)n-aum，其中，m，n分别表示该金簇分子中的金原子数和肽数，均为不为零的整数。

在一些实施方式中，所述肽为seqidno:1、seqidno:2(谷胱甘肽)、seqidno:3、seqidno:4或血清蛋白中的一种或多种；

seqidno：1：cys-cys-tyr-gly-gly-pro-lys-lys-lys-arg-lys-pro-gly；

seqidno：2：glu-cys-gly；

seqidno：3：cys-cys-tyr；

seqidno：4：cys-tyr。

优选地，所述血清蛋白为人血清蛋白。

在一些实施方式中，所述aum-(肽)n或(肽)n-aum为au1～2000(seqidno：1)1～2500、au1～2000(seqidno：2)1～2500、au1～2000(seqidno：3)1～2500、au1～2000(seqidno：4)1～2500或hsa-au1～10000，所述hsa表示人血清蛋白，优选为au25(seqidno：1)9、au25(seqidno：2)18、au5(seqidno：3)3、au25(seqidno：4)18或hsa-au4000。

在一些实施方式中，所述药物的剂型包括口服剂、液体悬浮剂或注射剂。在一些实施方式中，所述注射剂包括腔内注射剂、静脉注射剂或肌肉注射剂。

在一些实施方式中，所述腔内注射剂为腹腔注射剂，优选地，所述腹腔注射剂为腹腔注射液体悬浮剂。

本发明的药物可根据实际需要按现有技术制成适宜的剂型供施用于受试对象，当为口服剂时，可通过口服方式施用，当为注射剂时，可通过腹腔注射、肌肉注射或静脉注射的方式施用。本发明对动物模型进行的本文的实验显示出腹腔内施用的金簇分子展现显著的抗炎作用和抗风湿作用。因而，本发明优选将金簇分子制备成注射剂，更优选制成腹腔注射剂。

在一些实施方式中，所述金簇分子具有结构式aum-(肽)n或(肽)n-aum，其中，m，n分别表示该金簇分子中的金原子数和肽数，为不为零的整数；

所述肽为seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4；

seqidno：1：cys-cys-tyr-gly-gly-pro-lys-lys-lys-arg-lys-pro-gly；

seqidno：2：glu-cys-gly；

seqidno：3：cys-cys-tyr；

seqidno：4：cys-tyr；

优选地，所述aum-(肽)n或(肽)n-aum为au25(seqidno：1)9、au25(seqidno：2)18、au5(seqidno：3)3；au25(seqidno：4)18；

所述药物的剂型为腹腔注射剂或皮肤涂抹剂。

亦即本发明公开了在预防、减缓和/或治疗类风湿性关节炎施用金簇分子的方法。

在一个实施方式中，首先获得稳定的金簇分子，对患有类风湿性关节炎的动物腹腔施用治疗有效量的金簇分子的液体悬浮液，以缓解疾病的发展和进展。

在一个实施方式中，对患有类风湿性关节炎的动物口服施用治疗有效量的金簇分子的液体悬浮液，以缓解疾病的发展和进展。

本发明如出现术语“第一”、“第二”、“第三”和“第四”等，则其可以用于区分相似的要素，而不一定用于描述特定的连续或时间顺序。应当理解，如此使用的术语是可互换的。此外，术语“包括”、“包含”、“具有”及其任何变型旨在涵盖非排他性包含，使得包括一系列技术特征的过程、方法、物品、设备或组合物不一定限于这些技术特征，而是可以包括未明确列出的或者这些过程、方法、物品、设备或组合物固有的其它技术特征。

术语“金簇(metallicgoldcluster，金属金簇(metallicgoldcluster))”是指金原子簇分子，其中金原子形成几何晶体结构。金几何晶体结构常常可通过与稳定剂分子中所含的硫醇基、胍基、酰胺基、咪唑基、硒醇基、膦基、氨基、胺基、羧基、羟基形成非共价金属键来稳定。金簇分子通常在uv激发下发射荧光。金簇分子可按常规技术制备，通常在反应溶液中存在稳定剂分子的情况下制备。例如将金(i)或金(iii)盐与含有含硫醇基、胍基、酰胺基、咪唑基、硒醇基、膦基、氨基、胺基、羧基、羟基的稳定剂反应以形成金簇分子，反应溶液中稳定剂与金(0)形成非共价金属键来稳定，这些稳定剂分子包括但不限于含所述基团的peg、含所述基团的plga、蛋白质、糖、核酸、肽中的一种或多种，所述肽例如包括聚赖氨酸、聚精氨酸、聚天冬酰胺、聚天冬氨酸、聚天冬氨酸盐、聚谷氨酸盐和谷胱甘肽中的一种或多种；所述聚天冬氨酸盐例如为聚天冬氨酸钠盐；所述糖例如为多糖；所述肽例如为蛋白质。

术语“aum-(肽)n或(肽)n-aum(aum-peptiden或peptiden-goldm)”或“金-肽簇复合(gold-peptideclustercomplex)”或“金-肽簇”或“金(0)m-肽n(gold(0)m-peptiden)”或“肽n-金m(peptiden-goldm)”分子是可互相使用的，这些是可通过与含硫醇基、胍基、酰胺基、咪唑基、硒醇基、膦基、氨基、胺基、羧基、羟基的肽或多肽形成稳定的金簇分子，其中m和n各自表示复合物中的金原子数和包裹分子的数。

术语“稳定剂”亦可称为“金簇封端分子(goldclustercappingmolecule)”，其是指可与金原子形成非共价金属键从而使金簇几何结构稳定的含硫醇基、胍基、酰胺基、咪唑基、硒醇基、膦基、氨基、胺基、羧基、羟基的肽或聚合物分子。这些分子包括脂质、谷胱甘肽、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚天冬酰胺、聚天冬氨酸、聚天冬氨酸钠盐、聚谷氨酸盐、含所述基团的peg(聚乙二醇)、含所述基团的plga(聚乳酸-羟基乙酸共聚物)、蛋白质、多糖、核酸以及它们的降解产物，来自各种生物来源(包括植物、动物、细菌和真菌)的消化提取物的生物聚合物分子，标准形式易于从商业来源获得。

本发明金簇分子在结构上不同于传统胶体金颗粒(金胶体颗粒)。

术语“胶体金”是指是指由密集填充的金原子形成的高密度金颗粒。其是各种尺寸的球形金颗粒(图1)。胶体金颗粒的且金原子数不可准确预测。在典型的胶体金制剂中，生成的金颗粒的尺寸在很宽的范围内是多样的；这类金颗粒没有单光子激发荧光。最常见的胶体金制备方法是将作为还原剂的柠檬酸三钠在水溶液中与四氯金酸盐反应，在加热升高至接近沸腾或回流温度的温度下脱水，参见frens,g.的“用于调节单分散金悬浮液中颗粒尺寸的受控成核”(controllednucleationforregulationofparticlesizeinmonodispersegoldsuspensions，naturephys.sci.1973,241:20-22)，此文章的全部内容通过引用并入。

不同于在电子显微镜下具有密集填充的固体金颗粒并具有各种尺寸的胶体金(图1)，金簇分子或aum-(肽)n稳定，并具有明确限定的分子式、尺寸和几何结构的金原子簇(图3a、图3b和图3c)。它们的物理外观和性质是不同的，因为它们具有不同的uv光吸收光谱和质谱。它们的结构差异由图3a所示的吸收光谱和荧光的存在证明(图3b)。质谱显示精确的分子式。例如，在图3c中，25个au原子形成一个结合9个肽的簇。

金簇分子也不同于金盐。在另一个对比中，金诺芬中的金化学物质2,3,4,6-四-邻乙酰基-1-硫代-β-d-吡喃葡糖酸-s-(三乙基-膦)-金在图2a、图2b和图2c中示出，金原子处于氧化状态且不能形成金属键。

金簇分子具有金属表面，其可与硫醇等化学基团形成非共价但稳定的金属键。典型的制备反应如图3所示。另见gao,x的美国专利号8383919，其全部内容通过引用并入。金簇络合物通过含有硫醇基、胍基、酰胺基、咪唑基、硒醇基、膦基、氨基、胺基、羧基、羟基的聚合物分子稳定，所述聚合物分子统称为稳定剂(金簇包裹分子)，其可以是含有硫醇基、胍基、酰胺基、咪唑基、硒醇基、膦基、氨基、胺基、羧基、羟基的肽。如图3c中的实例所示，其中金-肽簇制剂是由具有固定数目金原子的金簇，其中每个金簇分子非共价地结合有限数目的含硫醇的肽。然而，在肽和金结晶原子之间形成的这些非共价金属键将允许其它富含半胱氨酸或硒半胱氨酸的蛋白质或肽在体内竞争性结合，使金簇复合物成为调节体内含半胱氨酸或硒半胱氨酸的蛋白质水平的良好的无毒非侵入性治疗候选分子。

术语“类风湿性关节炎”是指通常以滑膜炎症和增生(“肿胀”)、自体抗体产生、软骨和骨破坏(“畸形”)为特征的疾病。患者的类风湿关节炎是基因型与环境触发物之间复杂相互作用的结果。其通常对ii型胶原具有高水平的细胞和体液免疫应答。可以通过皮内注射在弗氏佐剂中乳化的ii型胶原，在大鼠和小鼠中诱导多发性关节炎。已经基于ii型胶原诱导性炎症建立了各种动物模型。已知一些近交系的小鼠(如mrl/lpr)随着年龄而发展自身免疫性疾病(类似于人全身性红斑狼疮)，这些小鼠也被报道为自发地发展关节炎，并对i型和ii型胶原具有体液应答。据报道，小鼠对关节炎的敏感性和对胶原的免疫应答受主要组织相容性复合物(mhc)基因的控制，并且人类白细胞抗原基因的某些特定表位赋予特定的易感性。这可能是因为素因性t细胞谱系选择，抗原呈递或肽亲和力的改变在促进自体反应性适应性免疫应答中发挥作用。

综上可知，本发明主要提供了金簇分子在制备用于预防、减轻和/或治疗类风湿性关节炎的药物中的应用，亦即本发明涉及金属au(0)-簇-复合分子，尤其涉及使用au(0)-肽簇分子作为治疗剂来预防、减缓、治疗、治愈和/或抑制动物的类风湿性关节炎的症状和发展，本发明表明金簇分子在动物模型中具有积极的抗炎和抗风湿作用，作为类风湿性关节炎治疗剂的新范畴的巨大潜力。更为重要的是，金簇分子在体内没有明显毒性的性质，这种安全性对于一旦治疗停止则症状恢复的类风湿性关节炎患者而言是极有益的，因为其不产生或很少产生副作用。

附图说明

将参考附图描述所公开的申请，附图示出了本发明的重要的示例的实施方式，并通过引用并入本说明书中，其中：

图1是显示现有技术中胶体金制剂尺寸多样性的尺寸分布的柱状图图示。

图2a是金化合物(金诺芬的活性成分)的化学结构。

图2b是金化合物(金诺芬的活性成分)的吸收光谱。

图2c是金化合物(金诺芬的活性成分)的质谱。

图3形象化地示出了生成金(0)-肽簇分子的示例性反应过程。

图3a是本发明的使用seqidno:1的肽的肽9-金25复合分子的吸收光谱。

图3b是本发明的图3a的肽9-金25复合分子的荧光光谱。

图3c是本发明的图3a的肽9-金25复合分子的质谱。

图4a是本发明的使用seqidno:2的肽的肽18-金25复合分子的吸收光谱。

图4b是本发明的图4a的肽18-金25复合分子的荧光光谱。

图4c是本发明的图4a的肽18-金25复合分子的质谱。

图5是本发明的has-金4000复合分子的吸收光谱。

图6显示本发明的不同实验组的小鼠后肢的照片。

图7显示本发明的不同实验组的小鼠后肢的射线照片。

图8显示本发明的不同实验组的小鼠后肢关节切片的组织学染色。

图9用图表显示出图6的不同实验组的肢体关节区域的金量。

图10用图表显示出图6的不同实验组的肢体关节区域的炎性细胞因子il-6因子的量。

图11用图表显示出图6的不同实验组的肢体关节区域的炎性细胞因子il-1β因子的量。

图12用图表显示出图6的不同实验组的肢体关节区域的炎性细胞因子tnf-α因子的量。

图13是本发明的使用seqidno:3的肽的肽3-金5复合分子的质谱。

图14是利用本发明制备的seqidno:3的肽的肽3-金5复合分子，抑制巨噬细胞的炎性反应。

图15是利用本发明制备的seqidno:3的肽的肽3-金5复合分子，抑制巨噬细胞的炎性反应，分泌引发或加剧类风湿关节炎的细胞因子和化学因子。

具体实施方式

将特别参考当前优选的实施方式(作为示例而非限制)来描述本申请的众多创新教导。本发明描述了几个实施方式，并且以下所有陈述都不应被视为限制一般权利要求。

为了说明的简单和清楚，附图示出了构造的一般方式，并且可以省略公知特征和技术的描述和细节，以避免不必要地模糊本发明。另外，附图中的技术特征不一定按比例绘制，主要是帮助提高对本发明实施方式的理解。

金(0)-肽簇分子的制备

在使用含有酪氨酸或半胱氨酸残基的肽制备稳定的金簇分子时，肽还起到金属金簇结构的稳定剂的作用。其它结合的聚合物分子也可用作稳定剂，这些分子包括、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚天冬酰胺、聚天冬氨酸、聚天冬氨酸钠盐、聚谷氨酸盐、含所述基团的peg、含所述基团的plga、蛋白质、谷胱甘肽、多糖、核酸以及它们的降解产物，来自各种生物来源(包括植物、动物、细菌和真菌)的消化提取物的生物聚合物分子，标准形式易于从商业来源获得。

实施例1

本发明中的实施例使用公开的肽序列(seqidno:1)cys-cys-tyr-gly-gly-pro-lys-lys-lys-arg-lys-pro-gly进行。参见liu,r.等的“经由特殊的靶向硫氧化还原蛋白还原酶1(trxr1)和抑制其活性金簇诱导肿瘤细胞凋亡(theauclustersinducetumorcellapoptosisviaspecificallytargetingthioredoxinreductase1(trxrl)andsuppressingitsactivity,chem.commun.,2014,50,10687-10690)。化学反应如下：

肽-tyroh+oh^-+haucl4→肽-tyr＝o+au25(肽)9(i)

所有的化学品购自sigma-aldrich，除非另外说明。在整个实验中使用超纯水。通过固相方法(chinapeptidesco.ltd.)合成纯度95％的肽。将所有玻璃器皿用王水洗涤，然后用超纯水和乙醇冲洗，在室温于剧烈搅拌下将haucl4水溶液(25mm,80μl)缓慢加入在5ml小瓶的肽溶液(1.06mm,1880μl)中，然后在30秒内缓慢添加naoh(0.5m,40μl)，得到约10的最终ph。在无任何干扰下将样品密封并在暗处储存15小时，以生成产物。将生成的产物透析12小时(透析管mwco＝500)以除去游离的haucl4和naoh，并且通过超滤管(millipore,mwco:3000)进一步浓缩样品以除去游离肽。将获得的金(0)-肽簇分子悬浮在水中并在4℃下保持在暗处以便进一步测试。通过uv光谱和荧光光谱以及质谱测试结构。

图3a和图3b显示出吸光度和荧光发射峰分别位于281nm和650nm。质谱(图3c)结果表明所得的金复合物是具有9个结合肽分子的25金原子簇，即au25(肽)9。

实施例2

利用化学反应(ii)，按照与实施例1相似的步骤，使用肽(seqidno:2)glu-cys-gly(gsh)制备金属金(0)-肽簇分子。参见luo,z.等的“从au(i)-硫醇盐复合物的诱导聚合发射到超亮au(0)@au(i)-硫醇盐核壳簇”(fromaggregation-inducedemissionofau(i)-thiolatecomplexestoultrabrightau(0)@au(i)-thiolatecore-shellclusters,jam.chem.soc.,2012,134,16662-16670)。

gsh+oh^-+haucl4→au25(sg)18+gs-sg(ii)

图4c是生成的分子式为au25(sg)18的金-肽簇分子的质谱。图4a和图4b显示金au25(sg)18簇分子的吸光度和荧光发射光谱。吸光度和最大荧光发射峰分别位于294nm和607nm。

实施例3

通过以下化学反应利用人血清蛋白(hsa)制备金属金-肽簇复合物样品。

hsa-tyroh+oh^-+haucl4→hsa-tyr＝o+hsa-au4000(iii)

所有的化学品购自sigma-aldrich，除非另外说明。在整个实验中使用超纯水。将所有玻璃器皿用王水洗涤，然后用超纯水和乙醇冲洗，在室温于剧烈搅拌下将haucl4水溶液(5ml,10mm,37℃)加入hsa溶液(5ml,5mg/ml,37℃)。2分钟后，引入naoh溶液(0.5ml,1m)，并在37℃的剧烈搅拌下使反应进行12小时。反应之后，通过透析管(mwco:100kda)将样品浓缩以除去未反应的游离hsa、naoh和haucl4。将获得的hsa结合的au(0)悬浮在水中并在4℃下保持在暗处。uv-vis光谱(图5)和hsa结合的金簇分子显示出由特征性局部表面等离子体共振(spr)引起的约520nm处的特征吸收峰。

实施例4

本发明中的实施例使用公开的肽序列(seqidno:3)cys-cys-tyr。化学反应如下：

肽-tyroh+oh^-+haucl4→肽-tyr＝o+au5(肽)3

所有的化学品购自sigma-aldrich，除非另外说明。在整个实验中使用超纯水。通过固相方法(chinapeptidesco.ltd.)合成纯度95％的肽。将所有玻璃器皿用王水洗涤，然后用超纯水和乙醇冲洗，在室温于剧烈搅拌下将haucl4水溶液(25mm,80μl)缓慢加入在5ml小瓶的肽溶液(1.06mm,1880μl)中，然后在30秒内缓慢添加naoh(0.5m,40μl)，得到约11的最终ph。在无任何干扰下将样品密封并在暗处储存15小时，以生成产物。将生成的产物透析12小时(透析管mwco＝500)以除去游离的haucl4和naoh，并且通过超滤管(millipore,mwco:3000)进一步浓缩样品以除去游离肽。将获得的金(0)-肽簇分子悬浮在水中并在4℃下保持在暗处以便进一步测试。通过质谱测试结构，图13表明所得的金复合物是具有3个结合肽分子的5金原子簇，即au5(肽)3。

动物实验1

胶原诱导的小鼠关节炎是研究类风湿关节炎和其它多发性关节炎的标准动物模型。重量为20-22克的dba/1雄性小鼠购自中国北京华阜康生物科技股份有限公司。ii型胶原和完全弗氏佐剂购自chondrexinc.,redmond,wa,usa。金诺芬购自sigma,usa，地塞米松购自中国天津金耀氨基酸有限公司。金25(肽)9簇分子根据实施例1制备。

将ii型胶原溶解于0.1mm乙酸溶液中，并用等体积的完全弗氏佐剂乳化，制成1.0mg/ml的ii型胶原乳液。在休息和环境适应一周后，将dba/l雄性小鼠分组，每组由10只小鼠组成。每只动物在尾巴的2-3cm底部皮内注射100μgii型胶原乳液。在第21天，注射第二加强剂量的100μgii型胶原溶液。用等量的0.9％氯化钠溶液注射小鼠的阴性对照组。

在第22天，给予每组小鼠不同的药物，每天一次，持续28天(4周)，直至第49天(第7周结束)。检查各组小鼠的炎症和状态。组1(正常组)和阴性对照组(非药物治疗的对照组)小鼠胃内接受0.9％氯化钠溶液；组2小鼠口服施用接受0.5mg/kg体重的地塞米松(dex)；组3小鼠口服施用接受1mg/kg体重的金诺芬；组4小鼠口服施用(i.g.)接受50mg/kg体重的金25(肽)9簇溶液(将实施例1中合成的金25(肽)9，配置成溶液，金浓度是5毫克/毫升，每只小鼠口服0.2毫升)；组5小鼠腹腔内(i.p.)接受5mg/kg体重的金25(肽)9簇溶液(将实施例1中合成的金25(肽)9，配置成溶液，金浓度是1毫克/毫升，每只小鼠注射0.1毫升)。

表1.治疗对小鼠体重(g)的影响(平均值±标准偏差)

^##:p<0.01针对正常组；*:p<0.05；**:p<0.01针对未经药物治疗的组。

与未治疗的小鼠组相比，ii型胶原免疫的皮内注射在第二增强胶原注射1周后(第四周)诱导所有组的体重减轻。抗炎药地塞米松没有逆转体重减轻，而所有金试剂治疗的小鼠组的体重略微恢复。

图6显示了在7周实验结束时各动物组的后肢肿胀的图片。肿胀在4周左右开始变得可见，其在第二次胶原注射之后，肿胀一般在第二次胶原注射后2至3周、即在第5-6周时达到峰值。在图6中，a显示无肿胀的正常小鼠的爪；b显示无药物治疗的免疫小鼠，其中ii型胶原诱导脚趾、爪和踝周围的肿胀和变形；c显示dex治疗的小鼠，其无明显肿胀；d显示金诺芬治疗的小鼠，其有肿胀且无明显改善；e显示口服施用金25(肽)9簇分子的小鼠，其仍有明显的肿胀，但状况略好；f显示i.p.施用金25(肽)9簇分子的小鼠，其肿胀明显减少，并且变形改善。

通过视觉评分方法评价炎症，其中小鼠个体爪通过0-4分级如下：

0分：无红肿无肿胀；

1分：脚趾轻度红斑；

2分：脚趾关节和爪肿胀；

3分：踝以下肿胀；

4分：所有踝和爪肿胀。

对每只小鼠的四肢进行检查和评分，并将每只小鼠所有四肢的评分加在一起。

所有组的评价结果示于表2。

表2.抗炎药物治疗的效果

^##:p<0.01针对正常组；*:p<0.05；**:p<0.01针对未经药物治疗的组。

在5周至7周的整个实验期间，ii型胶原在未治疗组小鼠的爪和肢体上诱导了明显的炎症和严重的畸形。在治疗的第二周，接受口服施用0.5mg/kg体重地塞米松的小鼠组的肿胀和炎症立刻被抑制；接受口服施用1mg/kg体重金诺芬的小鼠具有略微降低的肿胀评分；接受口服施用50mg/kg体重金25(肽)9簇溶液的小鼠显示出优于金诺芬的评分，但在4周的治疗结束后仍发展出相当的炎症；在治疗3周时，接受腹腔内地5mg/kg体重金25(肽)9簇溶液的小鼠的肿胀和关节畸形显著改善，并且改善随着治疗时间的增加而明显更好。

参照图7，通过各组小鼠的3dct扫描图像的图片来说明治疗效果，该治疗效果显示在7周药物治疗结束时爪关节的骨密度变化。图a显示无骨质溶解的正常小鼠的爪；b显示未经药物治疗的免疫小鼠，其中ii型胶原诱导的关节炎在趾关节引起明显的骨变形和骨质溶解；c显示dex治疗预防了骨变形，并且在第7周结束时无明显的骨质溶解；d显示金诺芬治疗的小鼠且e显示口服施用金25(肽)9簇分子的小鼠，这两种小鼠组在第7周结束时都仍发生骨变形和骨质溶解；f显示i.p.施用金25(肽)9簇分子的小鼠，与非经处理的关节炎小鼠相比，骨密度显著改善，无明显骨质溶解，仅有轻微的骨变形。因此，腹腔内施用金-肽-簇分子显示出抗炎以及抗风湿作用的显著有效性。特别是在长期施用时。

为了评估关节区域周围的软组织损伤，接着将各小鼠组的后肢的关节组织固定，包埋，切片，并用苏木精和曙红染色，以检查关节处的组织学和组织病理学变化。图8显示各小鼠组的染色结果。a是没有滑膜巨噬细胞侵入的正常关节区域的图片；b是无任何治疗的ii型胶原诱导的关节炎关节的图片，其中存在明显的骨侵蚀和软组织损伤，大量滑膜巨噬细胞浸润；c是dex治疗的小鼠的关节图片，无明显的骨侵蚀，且无明显的滑膜巨噬细胞侵入；d显示用金诺芬治疗的小鼠的关节图片，在关节区域有明显的软组织损伤，以及大量的滑膜巨噬细胞浸润；e和f是分别通过口服或i.p.施用方法用金25(肽)9簇分子治疗的关节区域的图片，f中的骨质侵蚀显著减少并且没有明显数量的滑膜巨噬细胞浸润；e中的口服施用金-肽-簇显示减少的软组织损伤和较少的巨噬细胞浸润。因此，口服和腹腔内施用金-肽-簇分子都展现出显著的抗炎以及抗风湿作用，然而，腹腔内使用金25(肽)9簇分子是明显更有效的方法。

参照图9，在各种治疗的小鼠组的关节炎关节处测量金的量。这显示出，相比于口服施用方法(组4)，腹腔内(组5)施用金试剂能使更高量的金被输送至关节炎关节处。对金诺芬治疗(组3)也观察到较少但可比量的金。

参照图10和图11，在各种治疗的小鼠组的关节炎关节处测量促炎细胞因子il-6和il-1β的量。口服(组4)和腹腔内(组5)施用金25(肽)9簇均将这两种细胞因子降低到与dex(组2)相似的水平，而这两种细胞因子在金诺芬治疗的小鼠(组3)中仍然较高。

参照图10，在各种治疗的小鼠组的关节炎关节处测量促炎细胞因子tnf的量。其显示出，相比于其它治疗方法，腹腔内施用金25(肽)9簇显著减少了tnf生成(组5)，虽然dex(组2)最有效，但口服施用金25(肽)9簇也减少了tnf的量(组4)，这表明金25(肽)9簇可发挥抗炎和抗风湿作用。

细胞实验2

人体在各种遗传、环境、生物因子的刺激下，会引发关节部位的巨噬细胞发生炎性反应，分泌多种细胞因子和化学因子，这些因子进一步引发或加剧类风湿关节炎或其他自身免疫疾病。巨噬细胞在类风湿关节炎中发挥重要作用，巨噬细胞出现炎性反应，细胞分泌炎症因子，包括no化学炎性因子，tnf-α细胞炎性因子，il-1β细胞炎性因子，il-6细胞炎性因子。这些巨噬细胞分泌的炎性因子会诱发和加剧类风湿关节炎症。因此巨噬细胞发生炎性反应是类风湿关节炎和其他种类自生免疫疾病的生物机制之一。本发明利用实例4中合成的au5-肽3，抑制巨噬细胞的炎性反应，见图14。从图14中看出，随着发生了炎性反应的巨噬细胞培养液中，加入不同浓度的金簇分子(金的浓度分别是：5,10,20,50微摩尔每升)，巨噬细胞的炎性变形趋于好转，逐步恢复到正常巨噬细胞的形态。通过分子生物学实验，见图15，我们可以检测出，加入不同浓度的金簇分子(金的浓度分别是：5,10,20,50微摩尔每升)，巨噬细胞分泌的炎性因子(包括no化学炎性因子，tnf-α细胞炎性因子，il-1β细胞炎性因子，il-6细胞炎性因子)逐步降低，进而巨噬细胞诱发或加剧类风湿关节炎或其它自身免疫疾病的能力降低。本实验从细胞和分子的水平上，表明了金簇分子发挥抑制类风湿关节炎疾病的分子机制。

安全性评价3

选用昆明种小鼠，体重20g/只。小鼠分为12组，每组10只，雌雄各半，每组腹腔注射给金簇分子，金簇分子来自于实施例2，12组中的小鼠腹腔注射金簇的剂量按金的含量折算如下：(1000、700、490、343、240、150、105、73.5、51.5、36、25、17.5)mg/kg。给药后观察小鼠毒性反应时间2周，结果：给药后，未出现死亡、各组小鼠精神状态可、未出现明显体重下降。因此金簇的安全性很高。

如本领域技术人员将认识到的，本申请中描述的创新概念可以在极大范围的应用中进行修改和改变，因此专利主题的范围不受任何给定的具体示例性教导的限制。其旨在包含落在所附权利要求的主旨和广泛范围内的所有这样的替代方案、修改和变化。