专利名称：一种低分子量肝素钠及其亲和层析制备方法
技术领域：
本发明公开了一种低分子肝素钠(LMWH)及其制备方法，特别是，公开了一种低分子肝素钠(LMWH)及其酶解亲和层析制备方法。
背景技术：
肝素钠(heparin)是广泛存在于动物器官(如牛、羊的小肠黏膜及肺组织等)的一种葡萄胺聚糖，具有抗凝、抗过敏、抗病毒、抗癌、调节血脂等多种生物学功能，但长期使用会有许多负面影响，如出血和诱导血小板减少等。低分子量肝素钠(Low Molecular Weight Heparin，LMWH)是一种天然的抗凝血和抗血栓药物，是普通肝素钠(heparin)的衍生物，是分离普通肝素钠得到的一组分。在应用中，克服了出血和诱导血小板减少的负面影响。是近十年来深受医药界关注的新一代肝素钠类抗血栓药物，具有抗血栓作用优于肝素钠，抗凝血作用低于肝素钠，生物利用度高，体内半衰期长，出血倾向小，服用后易吸收等特点，为今后取代肝素钠的一种新生物制品。
本发明产品采用通过清真宰牲的牛羊肠黏膜为基础原料，适合于在中东及穆斯林国家销售及使用，为穆斯林国家及世界各国医药界十分需求的制品。
本产品的制造工艺采用以清真牛羊肠黏膜为主要原料生产的粗制肝素钠，然后再进行生物酶的解聚和亲和层析的纯化。国内外报道低分子肝素钠生产大多采用精品肝素钠，本发明起始原料为粗制肝素钠，降低了工业成本，提高了收率，稳定了质量。
发明内容
本发明的目的是提供了一种低分子肝素钠，在工艺技术上，克服现有技术大多采用化学降解，造成产品残留毒素及分子量均一性差、生产成本高、工业化生产条件繁琐的缺陷.本发明采用生物酶降解低分子肝素钠后，利用亲和层析技术专一分离出具有较高生物活性物质的(溶血栓特性的)低分子量肝素钠片段，得到了一种纯度大于80％以上的低分子肝素钠。
本发明的另一目的是提供了一种低分子肝素钠的酶解聚后亲和层析制备方法，在原料选择上，不采用猪肠黏膜为主原料，而是采用源于清真牛羊肠黏膜的粗品肝素钠为主要原料，既适应了向穆斯林国家的医药界供应药用原料的渠道，又降低了成本；并且采用生物酶降解及亲和层析分离纯化技术，工艺简单、无残留毒素、无三废污染。
——本发明是这样实现的本发明公开了一种低分子肝素钠，具有平均分子量在3500-4000之间，低分子量的含有量在80％-85％。溶血栓生物活性每毫克在100-125国际单位之间，同时Fxa与FIIa的比值在3.0-4.0之间的一种新颖的低分子肝素钠，是一种高效、低副作用、抗Fxa半衰期长、生物利用度高、用途广泛的低分子肝素钠。本发明还公开了一种低分子肝素钠的酶解亲和层析制备方法，采用源于牛羊肠黏膜(清真)的粗品肝素钠为主要原料，并用生物酶和亲和层析分离纯化，获得低分子肝素钠。本制备方法简单、成本、易操作、无三废，收率大于80％。
本发明还公开了一种低分子肝素钠的酶解聚后亲和层析制备方法，依次包括如下步骤(1)以来源于牛羊(清真)肠黏膜的低分子肝素钠为主要原料，用木瓜酶进行酶解；
(2)所得酶解加入抗凝血酶(Fxa抑制剂)，常温静置后迅速冷却至5℃-10℃；(3)将所得酶解液调至PH7.4±0.1后，通过伴刀豆球蛋白sephrose亲和层析柱，收集下柱流出液；(4)所得下柱流出液继续冷却至3℃，调至PH1.7-1.9，静置后过滤收集清液；(5)所得清液调至-11后，加入过氧化氢，升温至25℃，保温24小时；(6)次日用出菌板压滤收集清液；(7)清液加入无菌、无内毒素的药用乙醇，搅拌后静置过夜；(8)次日离心收集沉淀物，脱水后，进入真空干燥36小时，即得低分子肝素钠成品。
本发明对来源于牛羊为原料的粗品肝素钠(heparin)，采用木瓜蛋白酶(papain)，来源于caricapapara公司0.2-0.4U/mg裂解。加入自制抗凝血酶(fxa抑制剂)，孵育30分钟。通过刀豆球蛋白sephrose亲和层析柱收集穿过峰，酸化、碱化除菌后真空干燥得专一分子量的低分子量肝素钠精品(一)工艺路线肝素钠粗品(从牛或羊中获得)→(木瓜酶)酶解→酶解液→加入抗凝血↑ ↑↑(80-100u/mg SH) (0.2-0.4u/mg) 从牛血中提取酶(自制)37℃孵育30分钟→过刀豆球蛋白→sephrose亲和析柱→收集穿过峰→酸化、碱化→无菌过滤→真空干燥→低分子肝素钠精品(二)工艺过程(按以下次序进行)1、将从清真宰牲场取出的牛羊肠黏膜制成每毫克含有普通肝素钠效价为80单位-100单位的粗制品，按重量10倍量加入含有1％氯化钠的纯水中，不断搅拌使其全部溶解，再继续搅拌1小时，用布氏漏斗过滤的清液。
2、清液用2当量氢氧化钠调PH7.8-8.8，然而在不断搅拌中加入木瓜酶(每百万单位粗品肝素钠加入1000毫克木瓜酶)，缓缓升温至40℃-45℃，保温26小时。
3、酶解液经过布氏漏斗过滤后，用2当量盐酸调PH至6.5-6.8，然后再不断搅拌下加入抗凝血酶(fxa抑制剂)，(每百万单位粗品肝素钠加入250毫克fxa抑制剂)，37℃保温静置30分钟，(fxa抑制剂活力2500U/mg)。
4、加入fxa抑制剂的酶液，迅速置于5℃冷室中，使其冷却至5℃-10℃后调整PH7.4±0.1后，通过刀豆球蛋白sehrose亲和层析柱，流速为60me/cm2/分。(凝胶柱体积为每千万单位粗品肝素钠0.75升)。收集下柱流出峰(LMWH在230nm处有一特定吸收值)。
5、收集下柱流出液，继续冷却至3℃，用2当量盐酸调PH1.7-1.9，产生乳白色的沉淀物，静置30分钟，即用布氏漏斗真空过滤收集清液。
6、清液用5当量氢氧化钠调PH至11后，加入3％过氧化氢，升温至25℃，保温24小时(若PH降至9以下，须不断调整至11左右)。
7、次日用除菌板框压滤收集清液。
8、清液加入无菌、无内毒素的药用乙醇(每升清液用0.85升乙醇)搅拌15分钟后，静置过夜。
9、次日虹吸废乙醇，离心收集沉淀物，用无水乙醇脱水2-3次后，进入真空干燥箱干燥36小时即得低分子肝素钠成品。
10、成品按EP2002版进行全项化验。
本发明成功地用牛羊肠黏膜为起始原料的粗品肝素钠，采用木瓜酶进行解聚，然后通过刀豆球蛋白sephrose亲和层析柱纯化所得的低分子肝素钠成品，经药品测试中心的检测，低分子肝素钠的溶血栓(Fxa)因子活力单位稳定在100-125国际单位/每毫克。抗凝血(FIIa)的活力单位在25-50国际单位/每毫克。平均分子量3500-5500范围内，占总产品的68-88％之间。本发明成品Fxa与FIIa的比值在3.0-4.0之间，最终产品可达到无菌、无内毒素的注射规格。
低分子肝素钠是一类很有前途的抗血栓药物，在欧洲有取代肝素钠之势。本发明制造的低分子肝素钠为高效、低副作用、抗Fxa半衰期长、生物利用度高。低分子肝素钠一般以它的纳盐、钾盐或者钙盐存在。
实施例1称取用羊肠黏膜为起始原料的肝素钠钠粗品1亿单位(单位效价为每毫克120国际单位)1.2公斤加入12升纯水，再加入氯化钠100克，不断搅拌，使其溶解。搅拌1-2小时，用布氏漏斗，真空过滤，得清液约11.8升，用2当量氢氧化钠(约25毫升)调PH7.9，加入100克木瓜酶搅拌，使其溶解，并逐渐升温到40℃-42℃。保温26小时(每小时搅拌10分钟)，用布氏漏斗，真空过滤后，用2当量盐酸调PH6.8，加入抗凝血酶(Fxa抑制剂)因子25克，使温度保持37℃(30分钟)。溶解后，经过布氏漏斗过滤，得清液12.5升，迅速置于5℃冷室中，使其冷却到6℃±1℃。调PH到7.4±0.1后，通过直径2.2cm的内含半刀斗球蛋白sephhrose亲和层析柱1.5升(流速3me/cm2/分钟)用紫光监测仪在波长230nm收集下柱流出峰，共计7.6升。冷却到1℃-3℃，用2当量盐酸调PH1.9，溶液产生乳白色沉淀物静置30分钟后，即用布氏漏斗真空过滤，收集清液，不间断地用2当量氢氧化钠调PH至11.0±0.1，加入3％过氧化氢升温至25℃，保温24小时。第二天用除菌板，真空布氏漏斗无菌过滤，收集纯清液8升。加入预先备好-10℃ 95％药用乙醇6.8升，搅拌25分钟，静置过夜。第二天，虹吸出废乙醇，离心收集沉淀物，用无水乙醇脱水3次后进入真空干燥箱真空干燥36小时，得LMWH成品682克。经化验Fxa活力单位为每毫克119.25国际单位，FIIa活力单位为每毫克33国际单位，Fxa比FIIa的比值3.61，平均分子量3800。2000-8000分子量占总83％，产品质量经EP2002版全项化验合格，收率81.33％。
实施例2称取用牛羊肠黏膜为起始原料的肝素钠钠粗品10亿单位(单位效价每毫克100国际单位)10公斤加入100升纯水，再加入氯化钠1公斤，不断搅拌，使其溶解。搅拌1-2小时，用布氏漏斗，真空过滤，得清液约106.9升，用2量氢氧化钠(200毫升)调PH8.5，加入1千克木瓜酶不断搅拌，使其溶解，并逐渐升温至43℃-45℃。保温26小时(每小时搅拌10分钟)，用布氏漏斗，真空过滤后，用2当量盐酸调PH至6.6，然后加入抗凝血(Fxa抑制剂)因子250克，使温度保持37℃(30分钟)。溶解后经过布氏漏斗过滤，得清液105.1升，迅速置于5℃冷室中，使其冷却到5℃-10℃后，调整PH至7.4±0.1后，通过直径为20cm的，内含刀豆球蛋白sephhrose亲和层析柱15升(流速为60me/cm2/分)，用紫外监测仪在波长230nm收集下柱流出峰，共计98升。继续冷却到3℃±，用2当量盐酸调PH1.9，溶液产生乳白色沉淀物静置30分钟后，即用布氏漏斗真空过滤收集清液，不间断地用2当量氢氧化钠调PH至11.0，再加入3％过氧化氢升温至25℃保温24小时。第二天用除菌板板框压滤，收集纯清液100升，加入预先备好的-10℃无菌、无内毒素的95％的药用乙醇85升搅拌15分钟，静置过夜。第二天，虹吸出废乙醇，离心收集沉淀物，用无水乙醇脱水3次后进入真空干燥箱干燥36小时，即得低分子肝素钠成品7.62公斤。经化验检出Fxa活力单位为每毫克122.50国际单位，FIIa活力单位为每毫克32.58国际单位，Fxa比FIIa比值为3.76，平均分子量为3650，2000-8000分子量占84.5％，产品完全符合EP2002版中的伊诺型低分子量肝素钠，收率达88.6％。
权利要求
1.一种低分子肝素钠，其特征在于，平均分子量在3500-4000之间，低分子量的含有量大于80％-85％之间。溶血栓的生物活性每毫克在100-125国际单位之间，Fxa与FIIa的比值在3.0-4.0之间。
2.本发明还公开了一种低分子肝素钠的酶解聚后亲和层析制备方法，依次包括如下步骤(1)以来源于牛羊(清真)肠黏膜的低分子肝素钠为主要原料，用木瓜酶进行酶解；(2)所得酶解加入抗凝血酶(Fxa抑制剂)，常温静置后迅速冷却至5℃-10℃；(3)将所得酶解液调至PH7.4±0.1后，通过伴刀豆球蛋白sephrose亲和层析柱，收集下柱流出液；(4)所得下柱流出液继续冷却至3℃，调至PH1.7-1.9，静置后过滤收集清液；(5)所得清液调至-11后，加入过氧化氢，升温至25℃，保温24小时；(6)次日用出菌板压滤收集清液；(7)清液加入无菌、无内毒素的药用乙醇，搅拌后静置过夜；(8)次日离心收集沉淀物，脱水后，进入真空干燥36小时，即得低分子肝素成品。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的低分子肝素钠起始原料为从牛羊(清真)肠黏膜制成的粗制品，他是在PH7.8-8.8之间用木瓜蛋白酶，在40℃-45℃解聚26小时。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的酶解液经过布氏漏斗过滤清后，调PH6.5-6.8后加入Fxa抑制剂，37℃保温30分钟。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述亲和层析柱，为伴刀豆球蛋白sephrose亲和层析柱，其所用的缓冲体系为PH7.40.05Mtris缓冲体系。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所得清液调PH至11加入过氧化氢，升温25℃，保温24小时，然后用除菌板压滤收集清液，用无菌、无内毒素的药用乙醇沉淀，脱水真空干燥36小时的低分子肝素钠成品。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于所得低分子肝素钠为无菌、无内毒，透光率在260nm≤0.20、280nm≤0.15的可用于静脉注射的药用原料。
全文摘要
本发明公开了一种低分子肝素钠，具有抗凝、抗过敏、抗病毒、抗癌、调节血脂等多种生物学功能，是一种高效、低副作用、抗FXa半衰期长、生物利用度高、用途广泛的低分子肝素钠。本发明还公开了一种低分子肝素钠的酶解亲和层析制备方法，采用源于牛羊肠黏膜(清真)的粗品肝素为主要原料，并用生物酶降解和亲和层析分离纯化，获得低分子肝素钠。本制备方法简单、易操作、无三废，产得率高、成本低。
文档编号A61K9/08GK1803853SQ20061002358
公开日2006年7月19日 申请日期2006年1月24日 优先权日2006年1月24日
发明者苏翰, 苏有录, 唐甜, 周钰, 韩彬 申请人:上海阿敏生物技术有限公司