一种猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎、猪丁型冠状病毒病三联亚单位疫苗的制作方法

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎、猪丁型冠状病毒病三联亚单位疫苗

背景技术：

猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrhea，ped)是由猪流行性腹泻病毒引起的猪的一种高度接触性肠道传染病，以腹泻、呕吐和食欲下降为基本特征，本病对不同年龄的猪均易感，尤其哺乳仔猪危害最严重，是一种高度接触性传染病。该病于1971年首发于英国，1986年我国首次出现该病。自2010年开始，全国猪流行性腹泻呈暴发流行，流行的田间毒株相较2010年前毒株出现了变异，给养殖业造成了巨大的经济损失。

猪传染性胃肠炎（transmissiblegastroenteritis,tge)是猪的一种急性肠道传染病，发病急，传播快，各种年龄的猪只都可以感染，以引起3-10日龄以内仔猪呕吐、严重腹泻、消瘦与高死亡率（通常100%）为特征，发病猪也常表现为急性水样腹泻，粪便呈黄色或淡绿色或灰白色，有的哺乳仔猪粪便内混有未消化的凝乳块。病猪、带毒猪及其排泄物、乳汁、呕吐物等均为重要传染源，该病全年均可发生，近年来各地呈散发流行。

猪丁型冠状病毒（porcinedeltacoronavirus，pdcov)属于尼多病毒目(nidovirales)、冠状病毒科(coronaviridae)、冠状病毒属(coronavirus)的delta冠状病毒，为有囊膜的单股正链rna病毒。2014年初，美国俄亥俄州最先报道一种新的猪肠道冠状病毒pdcov，在当年年底该病已在美国的17个州中流行。随后加拿和韩国也报道检测到了pdcov，其阳性检出率高达25%。更为重要的是，2014-2016年间中国大陆地区的pdcov临床检测阳性率高达23.4%，而针对该病尚无对应疫苗。

对于猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎、猪丁型冠状病毒病的感染，目前还没有有效的治疗方法，主要是以疫苗免疫预防为主。目前，国外主要是韩国的弱毒苗，国内主要是哈兽研研制的tge、ped与轮状病毒三联弱毒活疫苗，大北农公司的tge-ped二联弱毒活疫苗，武汉科前公司的tge-ped二联灭活疫苗等疫苗，但临床应用效果有限；此外，弱毒疫苗与灭活疫苗在生产中存在散毒风险，弱毒疫苗的过度使用，一方面存在毒力返强的风险，另一方面，可能造成流行毒株与疫苗株的重组变异而使田间病毒流行情况更为复杂化，而使上述几种疾病的净化难度进一步加大，所以新型亚单位疫苗的研发应用对于保障畜牧兽医行业的持续健康发展至关重要。

技术实现要素：

基于上述发现与认识，本发明的主要目的在于提供一种猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎、猪丁型冠状病毒病三联亚单位疫苗，抗原成分为猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒与猪丁型冠状病毒等三种病毒各自的抗原蛋白s1，且三种病毒的s1蛋白含量需要分别≥150μg/ml（头份）。

优选地，本发明的猪流行性腹泻病毒的s1蛋白、猪传染性胃肠炎病毒s1蛋白和猪丁型冠状病毒的s1蛋白的质量比为1：1:1。

其中猪流行性腹泻病毒s1蛋白的氨基酸序列为seqidno:1，表达猪流行性腹泻病毒s1蛋白的巴斯德毕赤酵母菌x33-pedv-s1（pichiapastorisx33-pedvs1），已经于2017年6月30日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmccno:14372，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

其中猪传染性胃肠炎病毒s1蛋白的氨基酸序列为seqidno:2，表达猪传染性胃肠炎病毒s1蛋白的巴斯德毕赤酵母菌x33-tgev-s1（pichiapastorisx33-tgevs1），已经于2017年6月30日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmccno:14371，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

其中猪丁型冠状病毒s1蛋白的氨基酸序列为seqidno:3，表达猪丁型冠状病毒s1蛋白的巴斯德毕赤酵母菌x33-pdcov-s1（pichiapastorisx33-pdcovs1），已经于2017年6月30日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmccno:14370，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

所述的疫苗佐剂为mf59佐剂。

上述的三联疫苗中猪流行性腹泻病毒s1蛋白含量≥150μg/ml（头份），猪传染性胃肠炎病毒的s1蛋白含量≥150μg/ml（头份），猪丁型冠状病毒的s1蛋白含量≥150μg/ml（头份）。

本发明的猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎、猪丁型冠状病毒病三联亚单位疫苗安全性高，免疫原性好，免疫后抗体产生快速且较高抗体滴度维持时间长，疫苗保存期长，免疫剂量小，选用的佐剂易于注射，可一针防治三种主要腹泻相关病毒性疾病，提高仔猪的存活率。

附图说明

图1是本发明实施例猪流行性腹泻病毒s1蛋白基因、猪传染性胃肠炎病毒s1蛋白基因与猪丁型冠状病毒病s1蛋白基因的pcr的扩增鉴定图，

图2是本发明的猪流行性腹泻病毒s1蛋白的blast比较图；

图3是本发明的猪流行性腹泻病毒s1蛋白的遗传进化树示意图；

图4是本发明的猪传染性胃肠炎病毒s1蛋白blast比较图；

图5是本发明的猪传染性胃肠炎病毒s1蛋白的遗传进化树示意图；

图6是本发明的猪丁型冠状病毒s1蛋白的blast比较图；

图7是本发明的猪丁型冠状病毒s1蛋白的遗传进化树示意图；

图8是本发明实施例重组菌发酵诱导表达产物sds-page电泳检测图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例进行具体说明

实施例1：猪流行性腹泻病毒（pedv）s1基因、猪传染性胃肠炎病毒（tgev）s1基因与猪丁型冠状病毒（pdcov）s1基因的筛选

自2010年起，中国大陆多个省市地区出现大面积的仔猪腹泻病情，而部分发病猪之前已经注射了当时市售的腹泻疫苗，因此推测田间流行病毒为变异后毒株，在对2013-2016年间的临床样品检测后，从发病猪体内分离出不同的猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒与猪丁型冠状病毒，进行全基因组测序以及遗传进化分析（图3、图5与图7）之后，选定pedvkb2013-4株、tgevbd株与pdcovsd株作为当前田间流行毒株的参考株；其中pedvkb2013-4株（猪流行性腹泻病毒porcineepidemicdiarrheavirus）已经于2016年08月23日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmccno:12663，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；tgevbd株（猪传染性胃肠炎病毒transmissiblegastroenteritisvirus）已经于2017年06月07日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmccno:13856，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；pdcovsd株（猪δ冠状病毒porcinedeltacoronavirus）已经于2017年06月07日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmccno:13853，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

根据猪流行性腹泻病毒s1蛋白的抗原特性和氨基酸序列，设计合成一对引物，primer1:5’-ggatccatgaagtctttaacctactt-3’，含bamhi位点；primer2:5’-aagcttaacaccttcaagtggtttag-3’，含hindiii位点；取pedvkb2013-4株病毒基因作为模板，pcr扩增目的片段（图1为猪流行性腹泻病毒s1基因pcr的扩增鉴定图），产物回收连接peasy-t1克隆载体，转化和筛选阳性克隆peasy-t1-pedv-s1，经序列测定；其核苷酸序列为seqidno:4，编码的蛋白的序列为seqidno:1。与ncbi中公开的2010-2017年间流行的猪流行性腹泻病毒s1蛋白序列相比，同源性在96.5%-99.9%之间（图2）。

根据猪传染性胃肠炎病毒s1蛋白的抗原特性和氨基酸序列，设计合成一对引物，primer3:5’-ggatccatgaaaaaactatttgtg-3’，含bamhi位点；primer4:5’-aagcttaccaacaggactcaacgac-3’，含hindiii位点；取tgevbd株病毒基因作为模板，pcr扩增目的片段（图1为猪传染性胃肠炎病毒s1基因pcr的扩增鉴定图），产物回收连接peasy-t1克隆载体，转化和筛选阳性克隆peasy-t1-tgev-s1，经序列测定；其核苷酸序列为seqidno:5，编码的蛋白的序列为seqidno:2。与ncbi中公开的2010-2017年间流行的猪传染性胃肠炎病毒s1蛋白序列相比，同源性在96.7%-99.9%之间（图4）。

根据猪丁型冠状病毒s1蛋白的抗原特性和氨基酸序列，设计合成一对引物，primer5:5’-ggatccatgcagagagctctattgat-3’，含bamhi位点；primer6:5’-aagcttaccatcactacacacgctgat-3’，含hindiii位点；取pdcovsd株病毒基因作为模板，pcr扩增目的片段（图1为猪丁型冠状病毒s1基因pcr的扩增鉴定图），产物回收连接peasy-t1克隆载体，转化和筛选阳性克隆peasy-t1-pdcov-s1，经序列测定；其核苷酸序列为seqidno:6，编码的蛋白的序列为seqidno:3。与ncbi中公开的2013-2017年间流行的猪丁型冠状病毒s1蛋白序列相比，同源性在96.8%-99.9%之间（图6）。

实施例2：重组猪流行性腹泻病毒s1蛋白、猪传染性胃肠炎病毒s1蛋白与猪丁型冠状病毒s1蛋白的制备，

包括以下步骤：a.构建表达载体；b.构建表达菌株；c.重组猪流行性腹泻病毒s1蛋白、猪传染性胃肠炎病毒s1蛋白与猪丁型冠状病毒s1蛋白的诱导和提取纯化。具体如下：将阳性克隆质粒peasy-t1-pedv-s1或peasy-t1-tgev-s1或peasy-t1-pdcov-s1和表达载体ppiczα载体分别用bamhi和hindiii双酶切产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后，用dna凝胶回收试剂盒纯化回收，分别获得1.9kb或1.9kb或1.6kb和3.3kb片段，在16℃定向连接构建ppiczα-pedv-s1或ppiczα-tgev-s1或ppiczα-pdcov-s1表达载体，经酶切鉴定正确后；将质粒线性化后，电转化入毕赤酵母感受态细胞，构建毕赤酵母表达菌株x33-pedv-s1或x33-tgev-s1或x33-pdcov-s1，并提取表达菌株x33-pedv-s1或x33-tgev-s1或x33-pdcov-s1基因组，分别使用引物primer1/2或primer3/4或primer5/6进行pcr鉴定正确，于2017年6月30日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号分别为cgmccno.14370；进行诱导表达，挑取含x33-pedv-s1或x33-tgev-s1或x33-pdcov-s1的单克隆菌落接种于bmgy液体培养基，30℃振荡培养过夜，离心收集菌体，用适量的bmmy悬浮后，加入0.55%甲醇，30℃诱导96小时。4℃，9000rpm离心5min，保留上清液，加入40%的硫酸铵沉淀后，12000rpm离心5min收集蛋白沉淀，用pbs重溶蛋白。加入蛋白电泳上样缓冲液，沸水煮8分钟后，用12%的分离胶进行sds-page鉴定（图8是重组菌发酵诱导表达产物的sds-page电泳检定图，图中1、2、3分别为pedv-s1、tgev-s1与pdcov-s1蛋白表达产物沉淀，m为分子量标准蛋白质）。

将生产猪流行性腹泻病毒s1蛋白的毕赤酵母表达菌株x33-pedv-s1株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmccno.14372。

将生产猪传染性胃肠炎病毒s1蛋白的毕赤酵母表达菌株x33-tgev-s1株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmccno.14371。

将生产猪丁型冠状病毒s1蛋白的毕赤酵母表达菌株x33-pdcov-s1株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmccno.14370。

1.制苗用菌液的制备将x33-pedv-s1或x33-tgev-s1或x33-pdcov-s1菌种接种于含博莱霉素的ypd液体培养基中，30℃振荡培养16-18小时。然后划线接种于加有博莱霉素的ypd固体培养基，选取典型菌落2-3个混合于少量ypd液体培养基中，置30℃摇床中振荡培养18小时，定量分装，经纯粹检验后，作为一级种子。取一级种子接种于bmgy液体培养基中，30℃振荡培养16-18小时，经镜检后，置2-8℃保存，作为二级种子。

2.制苗用蛋白的制备按发酵罐容积60%(v/v)加入bmgy不完全液体培养基，同时按培养基0.1%(v/v)加入消泡剂，通入高温蒸汽灭菌30分钟，待培养基温度降至32℃，加入ynb和生物素，接种生产用毕赤酵母x33-pedv-s1或x33-tgev-s1或x33-pdcov-s1二级种子液，发酵罐参数设置分别为搅拌速度800r/min，温度30℃，维持d0值(溶氧量)在20%。培养24小时后的菌液补加甲醇，甲醇的补加速度为2ml/h/l诱导表达培养，按照以上发酵控制参数及工艺诱导表达120小时；发酵培养菌液经管式离心机10000r/min离心30分钟，收获的上清，加入硫酸铵沉淀蛋白后，按12000r/min离心30分钟收获沉淀，加入适量的生理盐水溶解蛋白沉淀。

3.灭活将蛋白液置于灭活瓶内，计量加入10%甲醛溶液，随加随摇，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.1%。加甲醛溶液后倒入另一灭活瓶中，以避免瓶口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时后取出，置2-8℃保存。

4.半成品检验

4.1无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。

4.2蛋白含量测定按bradford法检测蛋白含量。

4.3灭活检验将灭活后的蛋白液取少量接种ypd固体培养基，置30℃继续培养72小时。观察无菌落生长，判灭活检验合格。

实施例3：猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎、猪丁型冠状病毒病三联亚单位疫苗的制备

经过检验合格后的半成品pedv-s1、tgev-s1与pdcov-s1蛋白抗原进行疫苗制备（以下配制中各液体成分按体积比计）。

1佐剂制备将0.5%体积的司盘-85分散在5%体积的鲨烯相中，与0.5%体积的吐温-80混合入94%体积的10mm柠檬酸钠缓冲液中，然后高速混合得到粗乳液。然后将这种粗乳液重复通过高压均质机（1200bar，6-8个循环），产生具有均一油滴尺寸的乳液；将乳液滤过0.22μm滤膜，以除去大油滴，得到乳液的平均液滴尺寸在4℃下保持至少3年不变。

2抗原制备将猪流行性腹泻病毒s1蛋白、猪传染性胃肠炎病毒s1蛋白与猪丁型冠状病毒s1蛋白分别使用生理盐水稀释成150μg/0.1ml。

3乳化取油相1份放于50l-200l高速剪切机内，开动四叶桨慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以300-500r/min，乳化5分钟。乳化后，取10ml疫苗以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。

4疫苗成品检验

4.1性状

外观疫苗应为乳白色乳剂，无杂质并且外包装应合格。

剂型为水包油型。取一根清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，轻轻晃动后均匀的分散于水中。

稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。

黏度按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

4.2装量检查按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

4.3无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

4.4安全检验用3-5日龄仔猪10头（对应母猪应为怀孕后期检测猪流行性腹泻、传染性胃肠炎和猪丁型冠状病毒病中和抗体效价≤1:4），每头耳后颈部肌肉注射疫苗1.0ml，同时设对照5只，在相同的条件下饲养，连续观察14日，记录试验猪采食、饮水及临床情况。应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。

4.5效力检验

4.5.1检验免疫仔猪血清中和抗体接种1倍免疫剂量的仔猪，于免疫后2周用中和抗体试验法检验针对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒与猪丁型冠状病毒病的血清中和抗体，10头仔猪应至少8头仔猪转阳，针对三种病毒的中和抗体效价≥1:32，即能达到良好的免疫效果；

4.5.2对仔猪做免疫攻毒试验接种1倍剂量的仔猪免疫剂15头，于免疫后3周分为3组（5头/组），连同未接种疫苗的同龄仔猪15头（也分为3组，5头/组），以10^5.0tcid50/ml猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪丁型冠状病毒病强毒分别口服攻毒，攻毒后免疫仔猪应分别有4/5保护，对照猪5/5发病，或免疫仔猪5/5保护，对照仔猪4/5发病，判为免疫合格。

4.6甲醛残留量检测3批三联亚单位疫苗的检测结果分别为0.092%、0.085%、0.086%，均低于兽用生物制品通则的规定（0.2%）。

实施例4、实施例3中试制的猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎、猪丁型冠状病毒病三联亚单位疫苗与市售灭活疫苗及弱毒活疫苗的血清中和抗体与免疫保护效果比较

1材料实施例3中猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎、猪丁型冠状病毒病三联亚单位疫苗试制品；猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒（g5型）三联活疫苗（弱毒华毒株+弱毒cv777株+nx株），吉林正业生物制品股份有限公司生产（批号2016006）；猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗，吉林正业生物制品股份有限公司生产（批号2016003）。

2方法

2.1动物试验设计

用3-5日龄仔猪65头（对应母猪应为怀孕后期检测猪流行性腹泻、传染性胃肠炎和猪丁型冠状病毒病中和抗体效价≤1:4），每头耳后颈部肌肉注射疫苗1.0ml，同时设对照15只，在相同的条件下饲养，连续观察14日，记录试验猪采食、饮水及临床情况，14d后分别进行采血，并于采血当天用强毒攻击。阴性对照组的15头不作免疫，分为3组，分别用于三种病毒攻毒的阴性对照。三个疫苗组分别设有一组（5头）空白对照组，只免疫不进行攻毒。具体分组情况见表1。

表1动物试验分组情况

2.2效力试验

2.2.1抗体测定

参照实施例3中的4.5.1项方法进行效力检验，对免疫后14天的仔猪分别采血，分离血清，测定分别针对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪丁型冠状病毒的中和抗体效价。

2.2.2免疫攻毒保护

参照施例3中的4.5.2项方法进行效力检验，对免疫后14天的仔猪分别用对应的强毒进行攻击。连续观察10日，记录各组仔猪的发病情况。

3结果

3.1抗体测定结果

用实施例3中猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎、猪丁型冠状病毒病三联亚单位疫苗试制品、猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒（g5型）三联活疫苗（弱毒华毒株+弱毒cv777株+nx株）（批号2016006）以及猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗（批号2016003）分别对3～5日龄健康易感仔猪进行免疫，14d后的中和抗体结果见表2。结果表明三联亚单位疫苗免疫后仔猪血清中针对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪丁型冠状病毒的中和抗体效价均不低于1:32，而市售二联灭活疫苗和市售三联弱毒活疫苗免疫仔猪的中和抗体效价均不高于1:16。因此，三联亚单位疫苗免疫后产生的针对3种病毒的中和抗体水平要优于市售三联弱毒活疫苗与市售二联灭活疫苗。

表2三联亚单位疫苗试制品与市售三联弱毒活疫苗、市售二联灭活疫苗免疫后的中和抗体效价比较

3.2免疫攻毒保护结果

用实施例3中猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎、猪丁型冠状病毒病三联亚单位疫苗试制品、猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒（g5型）三联活疫苗（弱毒华毒株+弱毒cv777株+nx株）（批号2016006）以及猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗（批号2016003）分别对3～5日龄健康易感仔猪进行免疫，14d后分别用对应的强毒进行攻击，连续观察10日，攻毒保护的结果见表3。

表3三联亚单位疫苗试制品与市售三联弱毒活疫苗、市售二联灭活疫苗免疫后的攻毒保护效果比较

结果表明本发明的猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎、猪丁型冠状病毒病三联亚单位疫苗安全性高，免疫原性好，免疫后抗体产生快速且较高抗体滴度维持时间长，疫苗保存期长，免疫剂量小，选用的佐剂易于注射，可一针防治三种主要腹泻相关病毒性疾病，提高仔猪的存活率。

序列表

<110>陕西诺威利华生物科技有限公司

<120>一种猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎、猪丁型冠状病毒病三联亚单位疫苗

<130>2017-11-08

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