一种舒张子宫平滑肌的药物组合物及其制备方法与流程

本发明属于医药领域，具体涉及一种舒张子宫平滑肌的药物组合物及其制备方法。
背景技术：
：川芎系伞形科藁本属多年生草本植物川芎的干燥根茎，《神农本草经》将其列为上品，其气香浓，味苦辛，性辛温，归于肝、胆、心包经，具有活血行气、祛风止痛、疏肝解郁的功效，应用历史悠久。常用于治疗头痛、经闭痛经、跌扑肿痛，胸胁刺痛等疾病。川芎主要含有挥发油、酚酸类、生物碱、内酯类、多糖类及无机元素等成分，目前活性研究较多的主要是挥发油和酚酸类：(1)挥发油：主要包括烷基苯肽、羟基苯肽以及苯肽二聚体等。研究表明，川芎中的烷基苯肽具有光和热不稳定性，遇光易聚合为苯肽二聚体，受热则易转化为羟基苯肽。现代研究表明川芎苯肽类成分具有抗惊厥、抗血栓形成、降低血液粘稠度、调节心脏功能、防止脑缺血症、镇静和催眠等功效。(2)酚酸类：川芎总酚酸作为一个有效成分群，尤其以阿魏酸和绿原酸为代表的重要活性成分，具有抗血小板凝集、抗血栓、抗氧化、清除自由基以及防治冠心病等多种药理活性。川芎在临床上常作为活血调经之品，多以川芎复方治疗原发性痛经，主要通过抑制子宫平滑肌兴奋，来缓解子宫强烈收缩所致的痛经。目前的研究认为川芎挥发油对小鼠离体子宫平滑肌收缩有一定的抑制作用，川芎总酚酸作为川芎的有效活性成分群，对子宫平滑肌收缩活动的影响目前尚无报道。另外，关于川芎总酚酸提取工艺，文献《王文祥等,正交试验法优选川芎总酚提取工艺.中成药,2000(05):第7-9页.》公开了通过正交试验法对川芎提取工艺的筛选，得到较高的阿魏酸含量的方法，但是其所得阿魏酸的含量仅为0.72mg/g，仍然太低。因此，急需一种能够提取川芎总酚酸尤其是阿魏酸和绿原酸的川芎提取物的方法，为工业化提取生产提供指导。技术实现要素：为了解决上述问题，本发明提供了一种舒张子宫平滑肌的药物组合物及其制备方法，该药物组合物是以川芎总酚酸为活性成分，本发明提供了川芎总酚酸的提取方法及其舒张子宫平滑肌的新用途，以便为临床缓解痛经提供更多的药物选择途径。本发明提供了一种提取川芎总酚酸的方法，步骤如下：(1)将川芎粉末加入65～95％乙醇，超声提取2次，每次30～55min，浓缩提取液，得川芎总酚酸粗品a；其中川芎与乙醇的料液比为1:7.5～14g/ml；(2)将粗品a溶于氨水，调ph为2～3，萃取浓缩得川芎总酚酸b。其中，步骤(1)中，所述乙醇的浓度为65％～80％；和/或，所述超声提取时间为每次45～55min；和/或，所述川芎与乙醇的料液比为1:9～14g/ml。优选地，所述乙醇的浓度为65～75％，优选为65％；和/或，所述超声提取时间为每次55min；和/或，所述川芎与乙醇的料液比为1:13g/ml。其中，步骤(2)中，所述粗品a与氨水的质量体积比为1:40～50g/ml；所述氨水的浓度为80％。其中，步骤(2)中，所述萃取是利用乙酸乙酯、氯仿或二氯甲烷萃取。其中，步骤(2)中，所述川芎总酚酸b的得率为4.63％。其中，所述川芎总酚酸提取物中阿魏酸得率为1.87mg/g，绿原酸得率为0.138mg/g。上述方法制备得到的川芎总酚酸。本发明还提供了上述川芎总酚酸提取物在制备具有舒张子宫平滑肌作用的药物中的应用。本发明还提供了上述川芎总酚酸提取物在制备治疗痛经的药物中的应用。本发明川芎总酚酸的提取方法，通过乙醇浓度、液料比和超声时间的配合，达到了有效提取川芎总酚酸的目的，提取物平均得率达到4.63％，阿魏酸等成分的含量高，制备方法稳定可靠，重现性良好。本发明川芎总酚酸对缩宫素致大鼠离体子宫平滑肌收缩具有抑制活性，可以舒张子宫平滑肌，进而预防或治疗痛经，为临床药物提供新的选择。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明图1为实验例2中川芎总酚酸对缩宫素所致大鼠离体子宫收缩活动力的影响；图2为实验例2中川芎总酚酸对缩宫素所致大鼠离体子宫收缩张力平均值的影响；图3为实验例2中川芎总酚酸对缩宫素所致大鼠离体子宫收缩活动力的抑制作用图；图4为实验例2中川芎总酚酸对缩宫素所致大鼠离体子宫收缩张力平均值的抑制作用图；图5为实验例2中川芎总酚酸对缩宫素所致大鼠离体子宫收缩活动的抑制作用图。具体实施方式本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。1、实验仪器agilentlc-1100型高效液相色谱仪：agilent公司；fr2004b型分析天平：上海越平科学仪器有限公司；电子分析天平：auw220dshimadzucorporation；hx-200型高速中药粉碎机：浙江省永康市溪岸五金药具厂；sb25-12d超声波清洗仪：宁波新艺超声设备有限公司。2、药材与试剂川芎饮片：四川新绿色药业科技发展股份有限公司提供，经鉴定为伞形科多年生草本植物川芎ligusticumchuanxionghort.的根茎；阿魏酸：成都曼斯特生物科技有限公司，批号：must-1710908，含量99.32％；绿原酸：成都曼斯特生物科技有限公司，批号：must-17030620，含量99.39％；甲醇：色谱级，sigma公司；所用其它试剂均为市售分析纯。实施例1本发明川芎总酚酸的提取取川芎饮片，粉碎，精密称取川芎粉末10.0g，置具塞锥形瓶中，加入13倍量65％浓度的乙醇，超声提取2次，每次55min，过滤，滤液浓缩蒸干。残渣加氨水充分溶解，滤过，滤液用浓盐酸调ph为2～3，再用乙酸乙酯萃取3次(50、40、30ml)，合并乙酸乙酯萃取液，浓缩蒸干，残留物即为总酚酸。以下用实验例的方式说明本发明的有益效果：实验例1川芎总酚酸提取工艺的筛选1、hplc法测定川芎中总酚酸含量①色谱条件色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱eclipseplusc18柱：4.6×100mm×3.5μm。阿魏酸流动相：甲醇-1％醋酸水溶液(30：70，v/v)；流速：1ml/min；检测波长：323nm；柱温：25℃。绿原酸流动相：甲醇-0.1％磷酸水溶液(18：82，v/v)；流速：1ml/min；检测波长：327nm；柱温：30℃。②对照品溶液的制备分别精密称定阿魏酸和绿原酸对照品适量，置25ml棕色容量瓶中，阿魏酸用70％甲醇溶解，绿原酸用50％甲醇溶解并定容至刻度，制得各对照品溶液；③标准曲线的制备分别精密吸取阿魏酸、绿原酸对照品溶液0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1ml于6个2ml棕色容量瓶中，加入对应溶剂定容至刻度，摇匀，微孔滤膜(0.45μm)过滤。在色谱条件下自动进样10μl供hplc分析，以进样量x为横坐标，峰面积y为纵坐标，得阿魏酸回归方程为：y＝5490.4x-88.759，相关系数r＝0.9998，绿原酸回归方程为：y＝1330.1x-2.93，相关系数r＝0.9995。结果表明，阿魏酸在0.1026～1.026μg范围内，绿原酸在0.0236～0.236μg范围内，呈良好的线性关系；④供试品溶液的制备取川芎饮片，粉碎，精密称取川芎粉末10.0g，置具塞锥形瓶中，按一定液料比加入一定浓度的乙醇，超声提取一定时间，过滤，滤液浓缩蒸干。残渣加氨水充分溶解，滤过，滤液用浓盐酸调ph为2～3，再用乙酸乙酯萃取3次(50、40、30ml)，合并乙酸乙酯萃取液，浓缩蒸干，残留物即为总酚酸粗品。精密称取一定量总酚酸粗品，置棕色容量瓶，分别用70％甲醇、50％甲醇溶解定容至刻度，即得供试品溶液；⑤精密度实验分别取阿魏酸、绿原酸同一份对照品溶液，按①中色谱条件测定，连续进样5次，每次10μl，测定峰面积，阿魏酸rsd为0.22％(n＝5)，绿原酸rsd为0.16％(n＝5)，结果显示仪器精密度良好；⑥稳定性实验取同一样品2份，分别用70％甲醇、50％甲醇溶解定容至刻度，分别于0，2，4，6，8，10h测定阿魏酸和绿原酸含量，进样10μl，测定峰面积，得阿魏酸rsd为0.47％(n＝6)，绿原酸rsd为0.75％(n＝6)，结果表明供试品溶液在10h内稳定；⑦加样回收率实验取已测得含量的样品溶液5份，分别与阿魏酸、绿原酸对照品溶液等量混合，按高效液相色谱条件测定得阿魏酸平均回收率99.04％，rsd为1.45％(n＝5)；绿原酸平均回收率100.78％，rsd为2.57％(n＝5)⑧重复性实验分别称取同一样品10份，其中5份用70％甲醇溶解、5份用50％甲醇溶解定容至刻度，按高效液相色谱条件测定供试品溶液中所含阿魏酸、绿原酸含量，连续进样5次，每次10μl，测定峰面积，得阿魏酸rsd为2.93％(n＝5)，绿原酸rsd为2.83％(n＝5)，结果表明本方法的重复性较好。2、川芎中总酚酸的提取工艺精密称取川芎粉末10.0g，平行进行试验，利用hplc法测定川芎中阿魏酸、绿原酸以及总酚酸的含量，如表1所示。表1试验设计及结果根据表1分析，实验条件为：乙醇浓度为65％～95％，优选为65％～85％；液料比为7.5:1～14:1，优选为10:1～14:1，超声时间30～55min，优选为40～55min。最优条件为：乙醇浓度65％，液料比13:1，超声时间55min，此条件下总酚酸的含量预计达到43.46mg/g。3、工艺验证选择最佳工艺(乙醇浓度65％，液料比13.05:1，超声时间55min)，计算提取物得率，通式计算转移率，见表2。表2提取率及转移率结果(n＝3)4、川芎总酚酸平均转移率的测定：1)川芎药材阿魏酸含量测定：取川芎粉末(过四号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50ml，密塞，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，用hplc测定含量，得川芎中阿魏酸的含量为2.11mg/g。符合2015版《中国药典》一部项下的含量规定(不得少于0.10％)。2)川芎药材绿原酸的含量测定：取川芎粉末(过四号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率35hz)30min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，用hplc测定含量，得川芎中绿原酸的含量为1.70mg/g。即川芎药材总酚酸含量为3.81mg/g。即川芎药材总酚酸含量为3.81mg/g。3)川芎提取物总酚酸含量测定：分别吸取70％甲醇、50％甲醇溶解的供试品用微孔滤膜(0.45μm)过滤。在相应色谱条件下自动进样10μl供hplc分析。计算川芎总酚酸的转移率，总酚酸转移率＝川芎提取物中总酚酸含量/川芎药材中总酚酸含量×100％。提取物平均得率为4.63％，阿魏酸和绿原酸平均转移率分别为49.14％，3.63％，总酚酸平均转移率为52.78％，rsd为1.66％，说明该工艺合理可行，稳定可靠，具有较好的重现性。见表2。实验例2本发明川芎总酚酸提取物舒张子宫平滑肌试验1、实验材料①药物川芎总酚酸：每克浸膏含43.46mg总酚酸(实施例1的方法制备)，用dmso配成0.1g/ml，备用。②动物sd大鼠，普通级，全雌，体重220～250g，由成都达硕实验动物有限公司提供，生产许可证号：scxk(川)2015-030，检疫后用。③试剂缩宫素注射液，厂家：安徽宏业药业有限公司，批号：140347，用生理盐水水配成1u·ml-1，备用；戊酸雌二醇片，厂家：delpharmlilles.a.s.，批号：309a，用纯水配成0.8mg/ml，备用；盐酸维拉帕米，国家药品标准物质，由四川省食品药品检验检测院提供，用纯水配成1×10-3mol/l的母液，备用。nacl、kcl、cacl2、nahco3、葡萄糖试剂，均由成都市科龙化工试剂公司生产，用于配置洛氏液(1000ml含nacl9.2g、kc10.42g、cacl20.24g、nahco30.15g、葡萄糖1.0g)；dmso，厂家：成都市科龙化工试剂公司，批号：2016102401。④实验仪器十六道生理记录系统：p13516型，澳大利亚powerlab公司；离体组织灌流系统：ml0186型，澳大利亚powerlab公司；电子天平：fa2004b型，上海越平科学仪器有限公司；电热恒温水浴锅：dzkw-s-4型，北京市永光明医疗仪器有限公司；反渗透纯水仪：upt-ii-20t型，成都超纯科技有限公司；可调式移液器：thermofisherscinentific型，上海君翼仪器设备有限公司。2、实验方法取健康、成年雌性未孕大鼠，实验前2日每日按8mg/kg的剂量进行灌胃戊酸雌二醇溶液，以造成动情期大鼠模型。于第3日颈椎脱臼处死动物，迅速剖取子宫置于盛有洛氏液的的玻璃皿中，轻轻剥离子宫上附有的结缔组织和脂肪组织。然后取中间段子宫2～3cm，一端固定于盛有洛氏液20ml的浴槽，另一端连接张力换能器，负重1g，保持浴槽中的营养液在(37±0.5)℃，并通以95％o2+5％co2的混合气体，速度1～2个小气泡/s，用十六通道生理记录系统记录子宫收缩曲线。待曲线稳定30min后，加入1u/ml缩宫素160μl，造模10min后，给予川芎总酚酸，按照低、中、高剂量给药(终浓度为：0.025mg/ml，0.05mg/ml，0.1mg/ml，dmso为空白对照组，盐酸维拉帕米(ver)为阳性药，均按照等体积给药，阳性药的终浓度为：5×10-7mol/l；给药后，观察离体子宫平滑肌收缩活动的变化，记录10min，用洛氏液冲洗3次后，再进行下一次实验观察。用spss19.0统计软件进行配对t检验统计分析造模前与造模后以及造模后与给药后的变化，并计算给药后的抑制率，计算公式为：抑制率(％)＝(给药前参数－给药后参数)÷给药前参数×100％，结果以(mean±sem)表示，组间比较采用one-wayanova分析，p<0.05表示有显著性差异，p<0.01表示有极显著性差异。3、实验结果和评价正常大鼠离体子宫在给予缩宫素160u/ml后，立即出现强烈收缩，表现为收缩活动力、收缩张力平均值明显升高，与造模前比较有显著性差异(p<0.05或p<0.01)，而对收缩频率无明显影响。再加入不同浓度川芎总酚酸分别作用于子宫平滑肌10min，均可不同程度地对抗缩宫素所致的大鼠子宫平滑肌的强烈收缩，如表3、表4和图1、图2所示。表3川芎总酚酸对缩宫素所致大鼠离体子宫收缩活动力的影响(n＝6)注：与造模前比较，*p<0.05，**p<0.01；与造模后比较，▲p<0.05，▲▲p<0.01。表4川芎总酚酸对缩宫素所致大鼠离体子宫收缩张力平均值的影响(n＝6)注：与造模前比较，*p<0.05，**p<0.01；与造模后比较，▲p<0.05，▲▲p<0.01。加入盐酸维拉帕米后，能显著降低收缩活动力，收缩张力平均值，且具有极显著性差异(p<0.01)；分别加入不同剂量的川芎总酚酸，能明显降低子宫收缩活动力及收缩张力平均值，且均具有显著性差异(p<0.05或p<0.01)；通过表5、图3和图4可以看出，在试验剂量范围内，川芎总酚酸对缩宫素引起的大鼠离体子宫收缩活动具有抑制作用，且川芎总酚酸对子宫平滑肌的抑制作用呈剂量－效应关系。通过图5可以看出，空白组，阳性组以及川芎总酚酸组在未加入缩宫素时，子宫平滑肌均呈自发性收缩，而当加入缩宫素后，3个组的子宫平滑肌条的收缩频率，收缩活动力均大幅度升高，当每个组分别加入相应药物后，3个组的子宫平滑肌条收缩活动均不相同，具体表现为：空白对照组显示(图5-a)，加入dmso后10min，大鼠子宫收缩频率，收缩活力以及收缩张力无明显变化；而阳性组显示(图5-b)，加入ver后10min，大鼠子宫收缩活力，收缩张力以及收缩频率均显著性降低，川芎总酚酸组显示(图5-c)，加入川芎总酚酸后10min，大鼠的子宫收缩活力，收缩张力以及收缩频率也有所降低，但作用不及阳性组。上述实验表明：空白组dmso对子宫平滑肌无明显影响，阳性药ver和川芎总酚酸均对缩宫素引起的大鼠离体子宫收缩活动具有抑制作用，但川芎总酚酸对子宫平滑肌的收缩的抑制作用弱于阳性药对子宫平滑肌的收缩的抑制作用。表5川芎总酚酸对缩宫素所致大鼠离体子宫收缩活动的抑制作用(n＝6)组别剂量收缩活动力抑制率(％)收缩张力平均值抑制率(％)空白组—13.74±11.714.74±5.98盐酸维拉帕米5×10-7mol/l92.90±2.54##75.77±3.61##川芎总酚酸0.1mg/ml58.26±10.08##52.34±6.12##川芎总酚酸0.05mg/ml45.65±10.14#41.20±4.99##川芎总酚酸0.025mg/ml31.07±10.0722.09±6.52注：与空白组比较，#p<0.05，##p<0.01。试验结果表明，本发明组分具有较好的舒张子宫平滑肌作用，为临床上筛选/制备痛经药物提供了一种新的选择。本发明川芎总酚酸的提取方法，通过乙醇浓度、液料比和超声时间的配合，达到了有效提取川芎总酚酸的目的，提取物平均得率达到4.63％，阿魏酸等成分的含量高，制备方法稳定可靠，重现性良好。本发明川芎总酚酸对缩宫素致大鼠离体子宫平滑肌收缩具有抑制活性，可以舒张子宫平滑肌，进而预防或治疗痛经，为临床药物提供新的选择。当前第1页12