专利名称：一种诱导干细胞向血管平滑肌细胞分化的方法
技术领域：
本发明涉及组织工程学中获得种子细胞的方法。
背景技术：
目前对体内血管平滑肌的形成的研究还较粗浅，更不用说在体外诱导分化形成血管平滑肌细胞了，目前构建组织工程血管所用的血管平滑肌细胞来自脐动脉或者大动物的颈内动脉的成熟平滑肌细胞。但是这些细胞是终末分化细胞，易老化，体外增殖能力差。
因此本领域迫切需要一种在体外获得血管平滑肌细胞种子细胞的方法，从而找到取材便利、创伤小、可大规模扩增的血管平滑肌种子细胞新来源。
发明内容
本发明旨在提供一种体外诱导骨髓间充质干细胞分化成血管平滑肌细胞的方法。
本发明的另一个目的是将体外诱导获得的血管平滑肌细胞作为组织工程种子细胞。
在本发明的第一个方面，提供了一种诱导形成血管平滑肌细胞的方法，它包括步骤用血小板来源的生长因子BB诱导骨髓间充质干细胞，从而使骨髓间充质干细胞分化形成血管平滑肌细胞。
在另一优选例中，所述的骨髓间充质干细胞是同种同体或同种异体骨髓间充质干细胞。
在另一优选例中，所述的骨髓间充质干细胞是人骨髓间充质干细胞。
在另一优选例中，所述的诱导在体外进行。
在另一优选例中，所述的骨髓间充质干细胞是单个核细胞。
在另一优选例中，在诱导步骤前以1×105-5×105个/cm2密度培养骨髓间充质干细胞，并取贴壁细胞。
在另一优选例中，所述的诱导因子血小板来源的生长因子BB的浓度为10-40ng/ml。
在另一优选例中，所述的诱导因子血小板来源的生长因子BB的浓度为15-30ng/ml。
在另一优选例中，所述的诱导培养在35-38℃，5％CO2和75-95％空气条件下进行。
在本发明的第二个方面，提供了一种根据上述的方法得到的血管平滑肌细胞。
在本发明的第三个方面，提供了上述血管平滑肌细胞的用途，它可用作组织工程中血管平滑肌种子细胞；或用于制备血管移植物。
在本发明的第四个方面，提供了血小板来源的生长因子BB的用途，它可用作使骨髓间充质干细胞分化形成血管平滑肌细胞的诱导剂。
在另一优选例中，所述的血小板来源的生长因子BB可作为体外诱导剂。
在本发明的第五个方面，提供了血小板来源的生长因子BB(PDGF-BB)在获得血管平滑肌细胞中的应用。
据此，本发明得到了一种在体外获得血管平滑肌细胞种子细胞的方法，找到了取材便利、创伤小、可大规模扩增的血管平滑肌种子细胞的新来源。
图1显示了细胞的形态学特征，其中A、C、EPDGF-BB诱导组；B、D无PDGF-BB诱导组；A、B9天；C、D14天；E18天；A、B、C、D、E扩大100倍。
图2显示了免疫荧光检测结果，扩大400倍。
图3显示了RT-PCT检测结果。
图4显示了Western blot检测结果。
图5显示了流式细胞仪检测结果。
图6显示了流式细胞分析仪(FACS)统计结果。
图7显示了组织工程血管的大体形态。
图8显示了组织工程血管的HE染色结果。
图9显示了组织工程血管的Masson染色结果。
图10显示了组织工程血管免疫组化抗平滑肌α-肌动蛋白染色的结果。
具体实施例方式
发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现在体外用血小板来源的生长因子BB(PDGF-BB)可以将骨髓间充质干细胞诱导分化为血管平滑肌细胞，从而为构建组织工程化血管提供了来源充足的种子细胞。
种子细胞是组织工程用于构建组织的最基本的原材料，不仅需要较多的种子细胞数量，而且应具有最佳的细胞生物活性。理想中的自体骨髓来源的干/祖细胞取材方便，对供体健康无损害，而且不存在免疫损害、和组织配型问题，也不存在胚胎干细胞存在的伦理问题。
骨髓间充质干细胞是骨髓来源，可向多种间质细胞分化，如骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和肌细胞。干细胞可以不对称分裂，可大量增殖且不易老化。
可以用常规的方法诱导骨髓间充质干细胞分化为血管平滑肌细胞。一种优选的方法是加入诱导因子PDGF-BB，其步骤包括(1)抽取骨髓，加入等量DMEM-LG培养液，离心去上层脂肪及部分上清；(2)在步骤(1)中去除了上层脂肪及部分上清的溶液中按0.5-2∶2与Percoll分离液混合、离心；(3)取步骤(2)中离心后的中层云雾状单个核细胞层；(4)收集步骤(3)中获得的细胞，低糖基本培养基(DMEM-LG)重悬，以1-5×105/cm2密度接种培养；(5)用PDGF-BB诱导其向血管平滑肌样细胞分化。
细胞置于35-38℃、5％CO2和75-95％空气条件下培养。PDGF-BB的浓度为10-40ng/ml，优选15-30ng/ml，更优选20ng/ml。
本发明的另一个方面是用上述的诱导方法得到的血管平滑肌细胞；所得到的血管平滑肌细胞可以作为组织工程中的种子细胞。
本发明的主要优点在于1.诱导方法的原材料来源广泛、对患者损伤小、无免疫排斥反应，不存在道德伦理问题；2.诱导方法操作简便、成本低廉；
3.所获得的血管平滑肌细胞可以作为组织工程中的种子细胞。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。
实施例1诱导分化骨髓间充质干细胞成血管平滑肌细胞的方法(1)于健康成人髂前上棘抽取骨髓5ml，移入含等量DMEM-LG培养液(内含10％FBS，肝素100U/ml)5ml无菌离心管中，300g离心5分钟，吸去上层脂肪及部分上清；(2)按1∶2加在1.073g/ml的Percoll分离液(购自Pharmacia公司，瑞典)上，900g离心30分钟；(3)取中层云雾状单个核细胞层，PBS冲洗，300g离心5min，弃去上清；(4)收集细胞，低糖基本培养基(DMEM-LG，购自Gibco公司，美国)重悬，以2×105/cm2密度接种培养，培养48小时后首次换液，PBS冲洗一次，去除未贴壁细胞，每2-3天换液；(5)待细胞融合后，传代分两组PDGF-BB诱导组和对照组(无PDGF-BB诱导组)，PDGF-BB诱导组细胞重悬于加入PDGF-BB(20ng/ml)(购自R&D公司，美国)的EGM-2培养液(购自Cambrex公司，美国)中，对照组细胞重悬于EGM-2培养液中，细胞均置于37℃、5％CO2和95％空气条件下培养。
实施例2检测实施例1中获得的细胞1.细胞免疫荧光染色细胞传代后培养至14天，乙醇∶乙酸(99∶1)固定细胞20分钟，PBS漂洗5分钟×3次；滴加0.25％Triton X-100作用10分钟，PBS漂洗5分钟×3次；0.5％羊血清室温下封闭30分钟；单克隆鼠抗人平滑肌肌动蛋白(MonoclonalMouse Anti-Human Smooth Muscle Actin Clone 1A4，1100，DakoCytomation公司)、羊多克隆抗SM 22 α(Goat polyclonal to SM22 alpha，1100，美国Abcam公司)，鼠抗平滑肌肌球蛋白重链单克隆抗体(Mouse anti-smooth musclemyosin，heavy chain monoclonal ant ibody，1100，加拿大CHEMICON公司)，鼠单克隆抗Calponin抗体(Mouse monoclonal to Calponin·ab700，英国Abcam公司)4℃孵育过夜，PBS漂洗，异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)小鼠抗大鼠Ig G(1100，Invitrogen公司，美国)或者异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)小鼠抗羊Ig G(1100，Invitrogen公司，美国)37℃，孵育30分钟，PBS漂洗，碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)(12000，美国Sigma公司)室温孵育6分钟衬染核，PBS漂洗后封片。免疫荧光显微镜(购自日本NIKON公司)观察，激光激发波长为488nm，胞浆内绿色荧光为表达阳性，细胞核为红色荧光。
2.细胞反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测各组细胞培养至14天时，收集各组细胞，检测SM α-actin、SM calponin、SMMHC、SM 22α的mRNA表达。Trizol(美国Invitrogen公司)提取总mRNA，根据RT-PCR操作说明，进行反转录和扩增反应。四个指标的相应引物序列见表1，反应条件预变性94℃4分钟；变性94℃30秒℃，退火55℃30秒，延伸72℃1分钟，循环34次；最后延伸72℃5分钟。
表1.引物序列和扩增产物大小
3.Western印迹检测分别收集各诱导组和对照组在培养至14天的细胞，各组细胞数为1×106个，各加入预冷三去污裂解液1ml，冰上裂解30分钟，裂解得细胞轻轻刮入Eppendorf管内，12000rpm，4℃离心5分钟；取上清，加等体积2×上样缓冲液，100℃沸水浴变性10分钟，冷却备用；聚丙烯酰胺凝胶电泳10mA，电泳3～4小时。电泳结束后，90V，4度转膜2小时，封闭缓冲液4度过夜。37度，顺序加入小鼠抗SM 22α一抗、生物素化二抗IgG、链亲和素-碱性磷酸酶(streptavidin-AP)进行杂交，逐级放大后，室温下滴加显色底物NBT/BCIP5-6ml，温和震荡5-10分钟，显色。
4.流式细胞分析检测(fluorescence activated cell sorter，FACS)取各组(诱导组和对照组)培养至14天的细胞，消化得细胞悬液，PBS离心1500rpm，5分钟，2次，制成单细胞悬液。乙醇∶乙酸(99∶1)固定细胞5分钟，滴加0.25％Triton X-100作用5分钟，PBS漂洗1500rpm，5分钟；分装入4个1.5ml Eppendorf管，保证每管含1×106以上的细胞，其中三管内分别加入抗VSMα-actin抗体、抗VSM calponin抗体和抗SMMHC抗体(抗体来源同上)，各10ul，4℃孵育40分钟；PBS离心1500rpm，5分钟，洗掉未结合抗体；4管同时加入FITC标记的抗鼠二抗4ul，4℃孵育30min，PBS离心1000rpm，5分钟，洗掉未结合抗体；同型对照组只加FITC标记二抗。
检测结果1.细胞形态学观察见图1。
结果表明应用PDGF-BB诱导9天，可见诱导组和对照组细胞均呈长梭型。传代后，继续诱导至14天，可见诱导组细胞呈长梭型，平滑肌样，而未诱导组细胞变短呈多角型改变。至18天时，细胞融合，排列呈“波峰波谷”样分布。
2.细胞免疫荧光观察诱导14天时，分别用SMα-actin、SM calponin、SMMHC、SM 22 α的抗体标记PDGF BB诱导组、未诱导组。人脐动脉平滑肌细胞(human Umbilical Artery Smooth Muscle Cell，h UASMC)作为阳性对照，人软骨细胞(human chondrocyte，h chon.)作为阴性对照。结果见图2。
结果表明诱导组细胞诱导至14天时，细胞表达SM α-actin、SM calponin、SMMHC、SM 22 α阳性，但SMMHC和SM calponin荧光分布在胞浆中，呈弥散分布，未见明显肌丝纤维样。阳性对照人脐动脉平滑肌细胞(Human Umbilicalarterial smooth mucle cells，h UASMC)SMMHC和SM calponin抗原荧光表达类似，也未见明显肌丝样分布。而无PDGF-BB诱导组和阴性对照人软骨细胞(human chondrocyte，h chon.)未见荧光表达。
3.RT-PCR检测诱导14天，诱导组PDGF-BB诱导组(induced)和对照组(no PDGF-BB)分别检测血管平滑肌SM α-actin，SM 22α，SM MHC，SMcalponin在mRNA上的表达。人脐动脉平滑肌细胞(h UASMC)作为阳性对照，人软骨细胞(h chon.)作为阴性对照。结果见图3。
结果表明单层培养的骨髓间充质干细胞PDGF-BB诱导至14天，RT-PCR检测到SM α-actin、SM calponin、SMMHC、SM 22 α扩增产物，与阳性对照平滑肌细胞扩增结果相符；无PDGF-BB诱导组及阴性对照人软骨细胞未见阳性条带。
4.Western印迹检测见图4。
结果表明诱导14天，诱导组(PDGF BB induced)和阳性对照组(h UASMC)在23KD(SM 22α)处可见明显蛋白条带，未诱导组(NO PDGF-BB)和人软骨细胞阴性对照组(h chondrocyte)在此位置未见明显蛋白条带。
5.流式细胞分析仪(FACS)检测见图5和图6。
结果表明PDGF-BB诱导14天，可见SM α-actin、SM calponin、SMMHC升高，诱导组表达阳性百分率分别达到57.93±3.22、43.66±4.22、49.73±2.79；而未诱导组SM α-actin、SM calponin、SMMHC表达阳性百分率分别为4.89±0.23、6.00±0.84、6.70±2.45。各指标两组间有统计学意义(P＜0.05，n＝3)。
实施例3用实施例1得到的血管平滑肌细胞制备血管移植物1.血管平滑肌细胞的接种收集第2-3代内，总数为10×107的诱导平滑肌细胞，加入2ml DMEM培养液，制成细胞悬液，将上述细胞悬液均匀接种于一片预制好的PGA纤维上，置于37℃，5％CO2培养箱内，4h后加入DMEM培养液，静置于培养箱内继续培养，每天更换培养液。
2.在血管生物反应器中构建细胞-PGA管状复合物。
(1)体外培养2周后，将片状的细胞-PGA复合物包绕于事先消毒好的外径为6mm的硅胶管周围，使细胞-PGA复合物形成管形结构。
(2)设定反应器参数流量200ml/min，作用160ms后，放松200ms，使搏动达到167次/min。
(3)体外构建6周。
3.构建血管的检测(1)大体观察观察构建血管的形态。
(2)免疫学检测将裸鼠皮下新生组织放入4％多聚甲醛溶液内固定24h，常规脱水，石蜡包埋，切片，行HE、Masson三色染色，观察新生组织的组织学特征。
(3)免疫组化检测组织工程化血管平滑肌α-肌动蛋白表达a、将组织切片置二甲苯脱蜡，100％、95％、85％、70％梯度酒精水化。
b、PBS漂洗3min×3次。
c、浸入0.3％H2O2-PBS，室温，30min，以阻断内源性过氧化物酶。
d、PBS振洗3min×3次。
e、0.05％胰蛋白酶37℃，消化30min。
f、PBS振洗3min×3次。
g、滴加绵羊血清(10％血清-PBS)，置湿盒内37℃，30min，以清除非特异性染色。
h、弃去血清，在实验组与阳性对照组组织切片上滴加一抗(兔抗人平滑肌α-肌动蛋白抗体1∶50)，在空白对照组组织切片上滴加PBS，置湿盒内4℃冰箱内过夜。
i、PBS振洗3min×3次。
j、滴加二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG)，37℃，30min。
k、PBS振洗3min×3次。
l、DAB显色10-20min，流水冲洗5min。
m、苏木精衬染细胞核，盐酸酒精分化，流水冲洗。
n、常规脱水封片。
4.检测结果(1)大体观察见图7。
结果表明，6周时，细胞-PGA复合物构成管型结构，直径6mm。
(2)免疫学检测a、HE染色见图8。
结果表明，6周时，PGA成分大部分降解，留下的空隙被大量细胞外基质所充填，形成了较致密、有一定厚度的组织结构，在基质中有散在的细胞，分布均匀。
b、Masson三色染色见图9。
结果表明，组织工程化血管的管壁细胞外基质成分主要为染成绿色的胶原，平滑肌纤维染成红色。
(3)免疫组化检测见图10。
结果表明，组织工程化血管管壁内有多数散在分布的有核细胞，这些细胞为棕黄色，经抗-平滑肌α-肌动蛋白抗体检测为阳性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海国睿生命科技有限公司<120>一种诱导干细胞向血管平滑肌细胞分化的方法<130>062453<160>8<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>1ggtgatggtg ggaatggg18<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
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权利要求
1.一种诱导形成血管平滑肌细胞的方法，其特征在于，它包括步骤用血小板来源的生长因子BB诱导骨髓间充质干细胞，从而使骨髓间充质干细胞分化形成血管平滑肌细胞。
2.如权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，所述的骨髓间充质干细胞是同种同体或同种异体骨髓间充质干细胞。
3.如权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，所述的骨髓间充质干细胞是人骨髓间充质干细胞。
4.如权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，所述的诱导因子血小板来源的生长因子BB的浓度为10-40ng/ml。
5.如权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，所述的诱导因子血小板来源的生长因子BB的浓度为15-30ng/ml。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在35-38℃，5％CO2和75-95％空气条件下进行诱导培养。
7.根据权利要求1所述的方法得到的血管平滑肌细胞。
8.根据权利要求7所述的血管平滑肌细胞的用途，其特征在于，用作组织工程中血管平滑肌种子细胞；或用于制备血管移植物。
9.血小板来源的生长因子BB的用途，其特征在于，用作使骨髓间充质干细胞分化形成血管平滑肌细胞的诱导剂。
10.血小板来源的生长因子BB在获得血管平滑肌细胞中的应用。
全文摘要
一种加入血小板来源的生长因子的体外诱导骨髓间充质干细胞成血管平滑肌细胞的方法，涉及组织工程学中获得种子细胞的方法。形态学改变和细胞免疫荧光等证明了诱导后的细胞具有血管平滑肌细胞的表型。
文档编号C12N5/08GK101070532SQ200610026479
公开日2007年11月14日 申请日期2006年5月12日 优先权日2006年5月12日
发明者崔磊, 尹烁, 李纲, 曹谊林, 刘伟 申请人:上海国睿生命科技有限公司