专利名称：含有用于松弛平滑肌的活性成分的脂质体组合物、该组合物的制备方法及其治疗应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基于可局部施用的在脂质体中的活性成分的药物组合物，以及该组合物的制备方法和其应用，所述药物组合物增强流经组织，尤其是在生殖区域中的血流。
背景技术：
已知脂质体是用于可控释放药物活性成分的试剂(参见例如Ulrich的评述，Biosci Rep.2002；22(2)129-50或者WO 96/14083，在脂质体中的SOD)。在局部应用脂质体中的局部麻醉剂的制剂也为本领域技术人员所已知；例如，US-4937078描述了含有常用钠通道阻断剂诸如丁卡因、利多卡因等的脂质体。其他已知化合物是能促进流经组织的血流特别是已知通过其应用来消除勃起机能障碍和阳痿的化合物(参见例如WO94/28902和EP 0967214 A1)。
发明内容
尽管已知的基于吡唑并嘧啶酮(pyrazolopyrimidones)和吡唑嘧啶酮(pyrazolopyrimidinones)的活性成分制剂作为通过口服施用或者鼻内施用的制剂存在，但是本发明的目的是提供用于所述物质的有效局部应用(优选为直接在生殖区域应用)的组合物，特别是提供一种使得这些活性成分的总体较低但同时在女性或男性性器官区域具有足够高的局部剂量的制剂。
根据本发明，通过提供用于局部，尤其是经皮和/或经粘膜施用活性成分的脂质体系统实现所述目的，所述活性成分松弛平滑肌，尤其是在性器官中供血血管的平滑肌。例如，可通过钙离子的诱导分泌触发此效果。
图1显示在DPPC/胆固醇脂质体中的西地那非包封量作为泡囊尺寸函数的示图。
具体实施例方式
在第一实施方案中，本发明涉及一种制剂，在该制剂中，活性成分是包封在脂质体中和/或以与脂质体结合的形式存在，其优选为选自由前列腺素、腺苷酸环化酶、cAMP、AMP、ATP、NO-合成酶、一氧化氮(NO)、NO化合物、硝酸盐、鸟苷酸环化酶、cGMP、GMP、GTP和磷酸二酯酶，尤其是西地那非、他达那非(tadalafil)、伐地那非(vardenafil)构成的组。
本发明的脂质体制剂不仅仅实现将活性成分暂时储存在周围组织(从中持续释放物质)中，而且与全身性应用相比具有更好的生物利用率和更长的半衰期。
对平滑肌细胞的松弛效果导致流经外部治疗的组织，例如性器官的血流增强，并因此导致性行为中的较高敏感性和感受性。
在本发明上下文中的活性成分或活性物质尤其是能介入cAMP或cGMP循环并引起较高Ca离子分泌的物质。其包括例如刺激cAMP途径的诸如罂粟碱和酚妥拉明等物质；行使重要的递质功能并激活鸟苷酸环化酶(随后形成cGMP)的一氧化氮(NO)；NO供体；甘油三硝酸酯；米诺地尔；L-精氨酸；林西多明(在体内通过NO-合成酶将精氨酸转化为瓜氨酸而形成)；吗多明；磷酸二酯酶抑制剂，例如介入cGMP途径(其中涉及PDE5受体)的例如西地那非或枸橼酸西地那非；前列腺素，例如介入cAMP循环的例如前列地尔(PGE-1)、地诺前列酮(PGE-2)。
除非有来自各自上下文的明显指明，否则当在下文中提及西地那非时，也同时指他达那非、伐地那非及它们的酸性盐，例如枸橼酸西地那非和伐地那非HCl·3H2O(三水合盐酸伐地那非)等。
在WO 02/36257中公开的用于活性成分包封的可逐级(scalable)方法已证实在制备和用活性成分装载脂质体时特别有利，这是由于该方法的高效率和其极其温和的条件。该方法通常用于制备具有脂质双层膜的单层脂质体，其非常优异的皮肤穿透性已在以前的工作中得以公认和证明。然而，也可以使用现有技术中公开的用于制备和装载脂质体的其他方法。
通过用活性成分主动装载脂质体可以实现最大装载密度。该过程可以分为两个主要类别膜装载和脂质体内水相装载。含有诸如氨基等可质子化基团的活性成分可以通过H+梯度受控装载而包含在脂质体中并以质子化状态保留在其中。对于此类主动装载，最重要的特征是脂质体膜/脂质体介质分配系数。已发现辛醇/缓冲液分配系数提供了良好的物质跨膜扩散的指示并因此与活性成分的装载或与释放曲线相关。
在此理论模型的基础上，具有不同脂质组成，优选含有长链磷脂并具有低胆固醇浓度的脂质体在合适的装载缓冲剂，优选在硫酸铵或枸橼酸/碳酸钠缓冲液中制备。在硫酸铵或枸橼酸盐缓冲液中制备脂质体后，改变周围介质，即交换或稀释周围介质，可选为中和周围介质或使周围介质碱性化，由此在脂质体内缓冲剂和脂质体外介质间形成H+梯度。在向脂质体外介质中加入活性成分后，由于该H+梯度，所述活性成分迁移进入脂质体，在其中质子化并在脂质体中保持稳定。
在该技术的应用中，装载的程度或装载容量主要由脂质体内部和外部H+浓度的比率决定。在已进行的试验中，使用每μmol脂质200nmol～400nmol活性成分的活性成分/脂质比率可实现与来自于涉及主动装载脂质体的文献中已知值相近的值。装载介质中活性成分浓度的增加没有导致装载容量的增加。
上述主动装载是由泡囊成形、活性成分添加和碱性化构成的三阶段方法。因此，本发明的又一个目的是建立利用在WO 02/36257中公开的交叉流动模块可以实现的单阶段制备方法。为此目的，将所述活性成分溶解在富含H+的水相例如硫酸铵溶液或枸橼酸溶液中，并通过交叉流动注射技术并随后立即使用稀释缓冲剂(例如在硫酸铵系统中的5％葡萄糖溶液或者在枸橼酸盐系统中的pH 9.0～9.5的枸橼酸/碳酸钠)稀释剩余的外部(＝脂质体外)水相而包封在脂质体中。已发现装载有活性成分的脂质体的质量，尤其是关于其皮肤透过性可简单地通过改变尤其是减少泡囊膜中胆固醇含量得以改善。
当需要或期望时，所述装载容量可进一步通过将平均脂质体尺寸从大约150nm～200nm(正如在此处描述的实验中通常所使用的)提高至300nm～500nm。此外，也可通过在制备过程中或在随后过滤泡囊过程中提高脂质浓度而进一步提高所述方法的效率，即每ml混悬液中脂质体包封的活性成分的量。
如果将西地那非用作活性成分，所述硫酸铵/葡萄糖溶液系统优选用于主动装载，这是由于西地那非在枸橼酸盐缓冲液中溶解性很差或者完全不溶。NH3在脂质体内水性介质中与硫酸铵以可逆平衡形式存在，并试图跨脂质体膜向外迁移并留下H+。西地那非以相反方向迁移入脂质体，接受所述氢离子H+，由此变得更亲水并因此保留在膜内。按此方式，西地那非可有效地装载入脂质体。这还以类似方式应用于西地那非替代物他达那非和伐地那非。
为确定关于膜柔韧性和相关的皮肤透过性的最佳脂质体制剂，制备并测试了各种具有不同脂质组成的脂质体混悬液。主要使用磷脂(可选与胆固醇联合使用)。然而，用其他脂质，例如糖脂、脑苷脂、硫脑苷脂或半乳糖苷代替或补充磷脂也在本发明的范围之内。可以使用的脂质的典型成员是例如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、心磷脂、鞘磷脂、缩醛磷脂、甘油糖脂、神经酰胺、糖鞘脂(glycophingolipid)和中性糖鞘脂。
提高对于经皮施用很重要的膜流动性的一种可能性是减少脂质体双层膜的相变，所述相变主要由所述磷脂的酰基链的长度、胆固醇的量和磷脂的饱和度确定。为此原因，在所述制备方法的一个实施方案中，DPPC(一种酰基链长度为16个碳原子的磷脂)被DMPC(链长度为14个碳原子)替代，这使熔点TM从45℃降低至31℃。
降低膜刚性而提高流动性的第二种可能性是降低膜内胆固醇的比例。基于总脂质含量，从55mol％∶45mol％的DPPC∶胆固醇比例(如在脂质体装载的文献中所描述)开始，胆固醇的量逐渐降低至38％或30％。与较高胆固醇含量的结果相比，发现活性成分装载略有降低。然而，这些脂质体显示改善了皮肤透过性并保持稳定，甚至在数周的长期测试中也没有明显的活性成分流失。
与早期工作的发现相反，也可制备稳定的不含胆固醇的脂质体并成功地用活性成分对其进行装载，所以根据本发明，基于总脂质含量，所述胆固醇含量为0mol％～50mol％。
使脂质体膜更柔软的第三种可能性是使用母鸡的蛋磷脂酰胆碱(E-PC)(一种具有不饱和磷脂的天然脂质混合物)替换完全饱和的DPPC或DMPC脂质。除使用这些天然脂质时的稳定性问题外，还必须在氮气气氛下制备脂质体。然而，这些泡囊既没有给出关于泡囊尺寸和均匀性的良好结果也没有给出皮肤透过性的改善。
使用本领域技术人员已知的替代性、功能相当的系统来用于H+梯度的形成也包括在本发明的范围之内。在该上下文中，“功能相当”应当理解为指如下能力，即形成跨所述脂质体的脂质双层膜的H+梯度而在该过程中不破坏膜完整性，因此在脂质体中包封的特别是质子化的活性成分保持稳定---在此处公开的稳定性标准情况下。
对于使用脂质体西地那非组合物作为局部使用的治疗剂，所述脂质体优选混入水凝胶中，水凝胶与纯混悬液相比更容易施用于皮肤。然而，制备西地那非脂质体的其他盖仑制剂并且特别是以溶液剂、洗剂、乳剂、酊剂、喷雾剂、软膏剂或霜剂形式局部施用所述制剂也包括在本发明的范围之内。在该领域里的本领域技术人员熟悉更多的可能性以及制备各种盖仑制剂必需的药用伴随物质和添加剂。
在先前试验中，例如Carbopol 981NF(来自Noveon)，已证实可以使用非常低浓度的水凝胶是有用的。其可用于药用、可相对廉价地获得并可大量得到。
为更好地进行描述，进一步参考如下实施例解释本发明。
实施例1西地那非脂质体的制备所述脂质体优选使用适用于所需活性成分的水相通过已知的交叉流动法(WO 02/36257)制备，可选地为至少部分活性成分最初包含在所述水相中和在脂质体的形成过程中包封在脂质体内部。随后通过中性或碱性稀释缓冲剂(优选为也含有活性成分)的方式稀释所述脂质体混悬液，而在所述脂质体内部和外部间形成H+梯度，这可既快速又高效地从稀释缓冲剂中转运更多的可质子化活性成分进入脂质体并保持已在脂质体形成过程中包封的活性成分。
作为另外一种选择，也可以选自如下方法在第一步，制备充填有缓冲剂的不含有活性成分的脂质体，然后仅在制备脂质体后如上所述通过H+梯度将活性成分主动装载入脂质体中。该过程可以在装载活性成分前检查所述脂质体混悬液的质量。
两种技术都是非常适合再生产的并可允许在脂质体中包封任何所期望的活性成分。它们也可以在非常温和的处理条件下进行，使得完全可以省去使用可能有害的溶剂，尤其是省去使用泡囊形成用的剪切力。
此外，使用该交叉流动法可提供无菌或无微生物形式的所有试剂并在无菌条件下进行所述脂质体的制备和装载，因此最终获得作为装载有活性成分的脂质体形式的无菌或无微生物产品。
脂质体制备(根据WO 02/36257)细节根据所选择的脂质或脂质组合物在25℃～60℃的温度，例如在DPPC脂质体的情况下为在50℃～55℃的温度，使用搅拌将所述脂质混合物溶解在96％乙醇中。缓冲液也优选在相同温度，例如在55℃保持恒温。当通过泵例如蠕动泵方式将极性水相(缓冲剂)泵过交叉流动模块时，将乙醇/脂质溶液同时在可按需预先选择的压力下注射入所述极性相中。
初始试验已表明，根据所使用的活性成分，不同的缓冲系统也表现出对形成允许进行主动装载的H+梯度的不同适宜性。因此，例如使用枸橼酸西地那非作为活性成分时，枸橼酸(脂质体内)和等摩尔中性或微碱性缓冲剂例如pH 7.5～8.0的枸橼酸/碳酸钠(脂质体外)的缓冲系统被证实为不利的，这是因为枸橼酸西地那非在此类型的缓冲系统中不溶或几乎不溶。另一方面，枸橼酸西地那非极易溶于水，并由于该原因对于此活性成分优选使用硫酸铵梯度进行主动装载。
根据此方法，因此脂质体优选在硫酸铵缓冲液(优选125mmol)存在下形成。在泡囊形成后，例如通过使用稀释缓冲剂进行稀释或通过使用5％葡萄糖溶液渗滤进行替换的方式改变保留在所述脂质体外的水相，在该情况下为硫酸铵溶液，结果是两性小分子，例如西地那非可装载入脂质体中并在其中质子化，而NH3以相反方向从脂质体中漏出。
a)两阶段变化形式通过H+梯度的方式用西地那非外部装载脂质体。在如下条件下实现最佳包封率(inclusion rate)。所述脂质(DPPC∶胆固醇摩尔比＝55∶45；每ml水相中共有13μmol～15μmol)溶解在乙醇中，并将此溶液注射入125mM硫酸铵溶液。在自发泡囊形成后，使用5％葡萄糖溶液替换剩余的外部硫酸铵溶液并加入枸橼酸西地那非。按此方式，在所述脂质泡囊内部和外部间形成H+梯度。由于导致的水解问题，低于2.5的pH值是不合适的，和由于愈加平缓的H+梯度，高于5.5的pH值也是不优选的。125mM的硫酸铵水溶液通常具有约5～5.5的pH。
通过凝胶过滤除去未被包封的西地那非后，通过rp-HPLC的方式测定活性成分含量和脂质含量。通过光子相关光谱法(PCS)的方式测定脂质体尺寸和分布。
根据泡囊尺寸，通过主动装载的方法可实现每μmol总脂质(＝DPPC+胆固醇)160nmol～230nmol西地那非的包封率(以西地那非/脂质比率表示)。这换算为每ml脂质体混悬液中1000μg～1500μg活性成分的数值。
为实现脂质体包封的西地那非的量的提高，提高了所述葡萄糖溶液中的西地那非含量。然而，发现过量的活性成分不能提高活性成分/脂质比率。因此在通过H+梯度主动外部装载的情况下，所述有效装载量似乎主要取决于所述梯度，而较小程度地取决初始采用的活性成分浓度。
b)单阶段变化形式将脂质(DPPC∶胆固醇＝55mol％∶45mol％)溶解在乙醇中，并将所述溶液注射入西地那非/硫酸铵溶液(pH 3.5～4.5)中，随之，立即在自发泡囊形成之后，加入含有进一步的枸橼酸西地那非的5％葡萄糖溶液(pH 7)用以稀释所述反应混合物和使所述反应混合物碱性化，所述反应混合物即所得的脂质体混悬液。作为泡囊形成后立即形成该H+梯度的结果，西地那非不仅在一个步骤中包封在脂质体中而且以稳定方式保持在其中。根据pH或H+梯度，按此方式包封在脂质体中的西地那非的量同样为每μmol总脂质(DPPC+胆固醇)约160nmol～230nmol的西地那非。
也可将活性成分他达那非和伐地那非以类似方式装载入脂质体。
为了比较目的，也在类似处理条件下制备脂质体包封的前列腺素E1。关于施用效果，参见实施例2。
实施例2脂质体包封的活性成分的使用A.脂质体中的西地那非、他达那非、伐地那非每1ml水凝胶Carbopol 981NF中0.5mg的在脂质体中的各种物质(以无盐活性成分计算)的制剂被选作用于人体试验的药物组合物，并由受试者以每次施用0.5ml～1.5ml的量施用，在每种情况下以其酸性盐的形式使用西地那非和伐地那非(分别为枸橼酸西地那非和三水合盐酸伐地那非)。
通过男性受试者外部施用于阴茎，女性受试者外部施用于阴道和/或阴蒂而使用所述凝胶。
结果a)男性在施用所述制剂后仅很短时间，即在几分钟之内，受试者体验到愉悦的、温暖的感觉和更强烈的性唤醒。随之是与以前没有施用所述制剂时通常或习惯的效果相比，更快更强的勃起以及实质上更长久的阴茎坚硬持续状态。使用三种活性成分制剂得到相似的效果。
b)女性所述脂质体活性成分凝胶的阴道/阴蒂施用立即导致血流增加的效果，从而导致愉悦、温暖的感觉和随之阴道分泌物的产生增加。此外，受试者报告阴道肌肉轻微收缩(类似于性欲高潮时)、性交时更强的性欲感觉和更强的性欲高潮感觉。
脂质体活性成分制剂的应用不仅导致性刺激和欲望的增强，而且更快地触发刺激，因此导致更快地达到性欲高潮。
单次施用后的作用持续时间在施用制剂后效果立即显现，上述感觉持续最长达3.5小时。所有三种制剂表现出明确的效果；受试者报告三种不同活性成分制剂间没有任何实质性的明显差异。
与Pfizer对女性进行的研究发现(参见New York Times，2004年2月28日，“Pfizer Gives Up Testing Viagra on Women”)相反，在任何比例下本发明的脂质体活性成分制剂甚至在女性外部施用时也显示出明显效果。它们因此也可例如用于女性性功能障碍(FSD)的治疗，例如用于女性性唤起障碍(FSAD)的治疗。
B.脂质体中的前列腺素E1在施用脂质体前列腺素E1后女性测试者也描述了类似的效果。采用的剂量为每1ml凝胶中0.1mg～0.5mg并因此稍稍低于西地那非、他达那非、伐地那非的剂量。
权利要求
1.一种优选用于局部施用的含有包封在脂质体中的活性成分的药物组合物，其特征在于所述脂质体在其内部具有水性介质，尤其是水性缓冲系统，并在其中含有至少一种对平滑肌有直接或间接松弛效果的活性成分，所述活性成分优选选自由前列腺素、腺苷酸环化酶、cAMP、AMP、ATP、NO-合成酶、一氧化氮(NO)、NO化合物、硝酸盐、鸟苷酸环化酶、cGMP、GMP、GTP和磷酸二酯酶组成的组，尤其选自由西地那非、他达那非和伐地那非这些物质组成的组。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于所述脂质体内部存在具有pH 2.5～5.5，尤其为5.0～5.5的水性介质，而所述脂质体外部存在具有中性或碱性pH，优选为pH 7～8的水性介质。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于所述脂质体内部的所述水性介质包含无机缓冲剂，尤其是硫酸铵。
4.如权利要求1～3中任一项所述的组合物，其特征在于所述脂质体内部的所述活性成分以质子化形式存在。
5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于所述脂质体外部的所述介质是5％葡萄糖溶液。
6.如权利要求1～5中任一项所述的组合物，其特征在于所述脂质体是单层的并具有脂质双层膜。
7.如权利要求1～6中任一项所述的组合物，其特征在于所述脂质体含有酰基链长度为至少14个碳原子，优选为至少16个碳原子的磷脂。
8.如权利要求1～7中任一项所述的组合物，其特征在于所述脂质体含有总脂质的0mol％～50mol％，优选为30mol％～45mol％的量的胆固醇。
9.如权利要求1～8中任一项所述的组合物，其特征在于所述脂质体具有150nm～500nm的平均尺寸。
10.如权利要求1～9中任一项所述的组合物，其特征在于所述脂质体含有浓度为每μmol脂质至少100nmol，尤其为150nmol～400nmol的所述活性成分。
11.如权利要求1～10中任一项所述的组合物，其特征在于所述组合物以混悬剂、洗剂、乳剂、酊剂或喷雾剂、凝胶剂、霜剂或软膏剂的形式存在，优选为无菌形式。
12.一种用于制备如权利要求1～11中任一项所述的药物组合物的方法，其特征在于通过将乙醇的脂质相注射入水相中而自发形成在其内部具有水性介质的脂质体，随之改变所述水相，尤其为稀释或交换所述水相，可选为中和所述水相或使所述水相碱性化，由此在所述脂质体的内部和外部间形成H+梯度，而其中活性成分a)最初包含于所述水相中并在所述脂质体自发形成过程中包封在所述脂质体内，和/或b)仅在泡囊形成完毕后加入到已改变的所述水相中并沿H+梯度迁移进入所述脂质体。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于所述水相的改变是在脂质体形成完毕后立即进行的。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于所述水相在改变前具有2.5～5.5，优选为3.5～4.5的pH并在之后具有7～8的pH。
15.如权利要求12～14中任一项所述的方法，其特征在于所述水相含有无机缓冲剂，尤其为硫酸铵，并通过使用中性或碱性缓冲剂，尤其为使用5％葡萄糖溶液进行稀释而实施所述改变。
16.如权利要求12～15中任一项所述的方法，其特征在于所述脂质相含有酰基链长度为至少14个碳原子，优选至少16个碳原子的磷脂。
17.如权利要求12～16中任一项所述的方法，其特征在于所述脂质相含有总脂质的0mol％～50mol％，优选为30mol％～45mol％的量的胆固醇。
18.如权利要求12～17中任一项所述的方法，其特征在于至少一种具有平滑肌松弛效果的物质是作为活性成分初始包含于水相中的和/或是在脂质体形成完毕后加入到已改变的所述水相中的，所述活性成分优选选自由由前列腺素、腺苷酸环化酶、cAMP、AMP、ATP、NO-合成酶、一氧化氮(NO)、NO化合物、硝酸盐、鸟苷酸环化酶、cGMP、GMP、GTP和磷酸二酯酶组成的组，尤其选自由西地那非、他达那非和伐地那非这些物质组成的组。
19.如权利要求12～18中任一项所述的方法，其特征在于所述药物组合物以混悬剂、洗剂、乳剂、酊剂或喷雾剂、凝胶剂、霜剂或软膏剂的形式，优选为无菌形式制备。
20.如权利要求1～11中任一项所述的药物组合物，该药物组合物用作局部施用，尤其是经皮和/或经粘膜施用于生殖区域的药物。
21.如权利要求1～11中任一项所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗男性勃起机能障碍的药物中的应用。
22.如权利要求1～11中任一项所述的药物组合物在制备用于治疗女性性功能障碍，尤其用于治疗女性性唤起障碍(FSAD)的药物中的应用。
23.如权利要求1～11中任一项所述的药物组合物在制备用于提高性欲望的药物中的应用。
24.如权利要求21或23所述的应用，其用于制备外部施用于阴茎的药物。
25.如权利要求22或23所述的应用，其用于制备阴道和/或阴蒂的外用药。
全文摘要
本发明涉及含有用于松弛平滑肌的活性成分的脂质体组合物、该组合物的制备方法及其治疗应用。具体地说，本发明涉及一种由包含在脂质体内的有效成分制得的用于局部施用的药物组合物，借此所述脂质体在其内部具有水性介质并在其中含有至少一种对平滑肌肉系统产生直接或间接松弛效果的活性成分，所述活性成分优选为选自由前列腺素、腺苷酸环化酶、cAMP、AMP、ATP、NO－合成酶、一氧化氮(NO)、NO化合物、硝酸盐、鸟苷酸环化酶、cGMP、GMP、GTP和磷酸二酯酶组成的组，尤其是西地那非。本发明还涉及一种制备所述组合物，可选为无菌形式的所述组合物的方法，以及各种盖仑制剂形式的装载有所述活性成分的脂质体在外部施用于生殖区域中的应用，以预防和/或治疗男性或女性的性障碍和/或提高性敏感性。
文档编号A61K9/127GK101043874SQ200580035669
公开日2007年9月26日 申请日期2005年10月14日 优先权日2004年10月18日
发明者安德拉希·瓦格纳, 卡罗拉·沃拉尔-乌尔, 赫尔曼·卡廷格尔 申请人:波利门科学生物免疫研究有限公司