甜菜碱治疗肺动脉高压的制药用途的制作方法

本发明涉及甜菜碱的应用，特别涉及甜菜碱作为治疗肺动脉高压药物的用途。

背景技术：

肺动脉高压(pulmonaryarterialhypertension，pah)是一组由异源性疾病和不同发病机制引起的以肺血管阻力持续增加，并导致右心室衰竭及死亡为特征的肺血管重构性疾病，具有高发病率、高致残率、高死亡率，被认为是“假恶性肿瘤”。炎症反应引起的肺血管内皮损伤导致的血管平滑肌细胞增殖和肺血管重构、肺动脉闭塞被认为是肺动脉高压发病机制及病理改变的主要特征。由于肺血管阻力的增加和右心室后负荷的增高，引起右心室重构，最终导致右心室衰竭。随着对肺动脉高压发病机制和病理生理学研究的深入，以及新型药物的临床应用，肺动脉高压患者的预后己有所改观，但长期有效性有限，5年存活率仅为49％。因此，寻找具有抑制甚至逆转肺血管重构、抑制细胞增殖、针对右心室功能且价格低廉的药物，将有助于临床的早期干预与治疗，具有深远的研究意义。

枸杞(lyciumbarbaruml)是宁夏特色回药材和重要的药食两用的名贵资源，有中国西北“红金子”之美誉。其性味甘、微温，归肝、肾、肺经，功能滋补肝肾、明目、润肺，主治肝肾亏虚，头晕目眩，目视不清，虚劳咳嗽、消渴引饮等证。甜菜碱(betaine)又名三甲基甘氨酸，是从枸杞中首次分离得到的一种氨基酸衍生物，安全性高，属于实际无毒类药物。国内外研究表明甜菜碱能促进脂肪代谢，降低体内高半胱氨酸；具有抗脂肪肝、保护肾脏、降血压、抗肿瘤、缓和应激等药理作用，但关于其对肺动脉高压抑制作用目前鲜见文献报道。

技术实现要素：

本发明的目的是通过对甜菜碱的药理作用研究，提供甜菜碱作为治疗肺动脉高压的药物的用途。

本发明通过以下技术方案来实现发明目的：

本发明提供甜菜碱作为治疗肺动脉高压药物的用途，所述甜菜碱的结构式如式(1)所示：

具体地，所述肺动脉高压为大鼠腹部皮下一次性注射野百合碱50mg/kg21天后诱导形成的肺动脉高压。

进一步地，所述甜菜碱单次应用剂量为100～400mg/kg.

优选地，所述甜菜碱单次应用剂量为200～400mg/kg。

优选地，所述甜菜碱单次应用剂量为300～400mg/kg。

优选地，所述甜菜碱单次应用剂量为400mg/kg。

具体地，所述甜菜碱单次应用剂量为不引起中枢抑制的剂量。

具体地，所述药物的剂型为药剂学上允许的口服剂型或注射剂型。

本发明提供的甜菜碱作为治疗肺动脉高压药物的用途具有以下有益效果：

(1)甜菜碱能显著降低平均肺动脉压和右心室收缩压、减少右心肥厚指数和肺中小动脉重构；

(2)甜菜碱能抑制炎症作用，显著抑制了肺动脉高压大鼠肺组织中nf-κb、tnf-α、il-1β蛋白的表达。

实验结果表明甜菜碱具有治疗肺动脉高压作用，可用于制备肺动脉高压的治疗药物。

附图说明

图1：甜菜碱显著降低肺动脉高压大鼠平均肺动脉压(mpap)图；

图2：甜菜碱显著降低肺动脉高压大鼠右心室收缩压(rvsp)图；图3：甜菜碱显著降低肺动脉高压大鼠右心肥厚指数(rvhi)图；

图4：甜菜碱显著降低肺动脉高压大鼠管壁厚度百分比(wt％)图；

图5：甜菜碱显著降低肺动脉高压大鼠管壁面积百分比(wa％)图；

图6：甜菜碱对肺动脉高压大鼠肺组织病理变化影响的he染色图(×400)；

图7：甜菜碱对肺动脉高压大鼠右心室心尖组织病理变化影响的he染色图(×400)；

图8：甜菜碱显著降低肺动脉高压大鼠心肌细胞直径(ad)图；

图9：甜菜碱显著降低肺动脉高压大鼠心肌细胞核密度(mnd)图；

图10：甜菜碱对肺动脉高压大鼠肺组织胶原纤维变化影响的masson染色图(×400)；

图11：甜菜碱对肺动脉高压大鼠肺组织中mcp-1表达的影响免疫组化图(×400)；

图12：甜菜碱对肺动脉高压大鼠肺组织中et-1表达的影响免疫组化图(×400)；

图13：甜菜碱对肺动脉高压大鼠肺组织中nf-κb蛋白表达水平的影响(与正常组比较：^##p<0.01，与模型组比较：^＊p<0.05，^＊＊p<0.01(n＝6))；

图14：甜菜碱对肺动脉高压大鼠肺组织中tnf-α蛋白表达水平的影响(与正常组比较：^##p<0.01，与模型组比较：^＊p<0.05，^＊＊p<0.01(n＝6))；

图15：甜菜碱对肺动脉高压大鼠肺组织中il-1β蛋白表达水平的影响(与正常组比较：^##p<0.01，与模型组比较：^＊p<0.05，^＊＊p<0.01(n＝6))；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明，实施例中所用的甜菜碱均为前述的式(1)所示的化合物。

实施例1

甜菜碱作为治疗肺动脉高压药物的用途，其中，甜菜碱单次应用剂量为大鼠100mg/kg，药物的剂型为溶液剂型。

实施例2

甜菜碱作为治疗肺动脉高压药物的用途，其中，甜菜碱单次应用剂量为大鼠200mg/kg，药物的剂型为粉针剂型。

实施例3

甜菜碱作为治疗肺动脉高压药物的用途，其中，甜菜碱单次应用剂量为大鼠400mg/kg，药物的剂型为粉针剂型。

下面的动物实验进一步说明了上述实施例1至3的效果：

一、实验材料

1.1动物处理

成年雄性sd大鼠，260-300g，购自宁夏医科大学实验动物中心，动物生产许可证号：ncxk(宁)2016-0005。喂养条件包括标准饲料，自来水，室温保持在(24±2)℃，湿度50-60％，每日光照与黑暗时间各12h。实验前，将动物置于实验环境适应3天。

1.2实验药品及仪器

甜菜碱(美国sigma公司)，以生理盐水配制，浓度分别为100mg/ml、200mg/ml、400mg/ml，现配现用。masson染色液(购自南京建成生物工程研究所)，兔抗nf-κb、tnf-α、il-1β、mcp-1、et-1多克隆抗体(购自abcam公司)，酶标仪(1510，thermofisher公司)，电泳仪、电转仪(powerpacbasic,美国bio-rad公司)，凝胶成像分析仪(js-860b,上海培清公司)。

1.3实验动物分组及给药

sd大鼠随机分为正常对照组、模型组、阳性药物西地那非组、甜菜碱不同剂量组。正常对照组腹部皮下注射生理盐水，其余各组大鼠在腹部皮下一次性注射野百合碱50mg/kg，造模后的第22天开始按100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg剂量每天灌胃给药。正常对照组和模型组同法给予等量的生理盐水。在连续给药后的第22天进行血流动力学、组织病理与形态学改变、分子生物学表达变化等药效学评价。

1.4sd大鼠肺动脉高压(pah)模型建立

称取野百合碱后置于15ml离心管中，用hcl(1mol/l)溶解后在用naoh(1mol/l)调节ph值至7.0～7.2，然后用蒸馏水补齐体积。取280g左右的大鼠，一次性腹部皮下注射野百合碱50mg/kg，选择腹部皮下注射方式是据文献记载：腹部皮下注射可形成典型的“炎性”肺动脉高压。注射后正常饲养，饮食自由，在第三周形成肺动脉高压。

二、实验过程

(一)血流动力学测定

1.1实验方法：

实验末次给药24h后，乌拉坦腹腔注射麻醉大鼠，分离右颈外静脉，结扎远心端，在近心端倾斜45°剪一小口，将与压力换能器相连接并充满肝素的大鼠专用右心导管插入右颈外静脉，左旋并向前推进进入右心室，记录右心室收缩压(rvsp)，转向肺动脉，记录平均肺动脉压(mpap)。

1.2实验结果：

由图1,2可以看出在注射野百合碱后的第42天，与对照组大鼠相比，模型组大鼠平均肺动脉压和右心室收缩压显著上升(p＜0.01)。与模型组相比，给予甜菜碱治疗的大鼠平均肺动脉压和右心室收缩压显著降低(p＜0.01，p＜0.05)。提示甜菜碱(100mg/kg，200mg/kg，400mg/kg)可以改善野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压。

(二)右心肥厚指数检测

2.1实验方法

大鼠血流动力学指标检测结束后，打开胸腔，将连接灌注装置的针头经右心室插入至肺动脉，用生理盐水冲洗肺。取出心脏，分离右心室、左心室加室间隔，分别称重，计算右心室肥厚指数(rvhi)＝右心室(rv)/左心室+室间隔(lv+s)。

2.2实验结果：

由图3可以看出在注射野百合碱后的第42天，与对照组大鼠相比，模型组大鼠右心肥厚指数显著上升(p＜0.01)。与模型组相比，给予甜菜碱治疗的大鼠右心肥厚指数显著降低(p＜0.01，p＜0.05)，右心室重构得到改善。提示甜菜碱(100mg/kg，200mg/kg，400mg/kg)可以改善野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压。

(三)肺中小动脉重构指标检测

3.1实验方法

取右下肺，10％甲醛固定48h，常规石蜡包埋，取5um厚连续切片，伊红-苏木素(he)染色，中性树脂封片，显微镜下检查并照相。随机选取管径在50-100um肺小动脉各10根，用显微镜进行摄片，image-proplus图像分析软件系统进行图像分析，计算肺小动脉管壁厚度(wallthickness,wt)占管径的百分比wt％、管壁面积(wallarea,wa)占血管总面积的百分比wa％，将wt％和wa％作为肺血管重构的指标。

3.2实验结果

由图4,5可以看出在注射野百合碱后的第42天，与对照组大鼠相比，模型组大鼠肺小动脉管壁厚度占管径的百分比wt％、管壁面积占血管总面积的百分比wa％显著上升(p＜0.01)。与模型组相比，给予甜菜碱治疗的大鼠肺小动脉管壁厚度占管径的百分比wt％、管壁面积占血管总面积的百分比wa％显著降低(p＜0.01，p＜0.05)，肺中小动脉重构得到改善。提示甜菜碱(100mg/kg，200mg/kg，400mg/kg)可以改善野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压。

(四)肺组织病理变化he染色图

4.1实验方法

取右下肺，10％甲醛固定48h，梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡2小时，常规石蜡包埋，取5um厚连续切片，伊红-苏木素(he)染色，

4.2实验结果

由图6可以看出在光镜下观察可见，对照组大鼠肺动脉血管内皮细胞连续扁平，细胞分布较均匀，血管腔完整，肺泡腔内结构完整，未见炎性细胞浸润；模型组大鼠肺动脉血管内皮细胞肿胀、脱落，血管平滑肌细胞明显增生、肥大，管腔不规则增厚，管腔狭窄，甚至闭塞，血管腔内残留有大量红细胞，肺泡腔内见大量炎性细胞浸润；治疗组大鼠肺动脉管腔增厚厚度介于对照组及模型组之间，内皮细胞部分脱落，血管平滑肌细胞亦出现增生，但轻于模型组，肺泡腔内亦可见炎性细胞浸润，但炎性细胞浸润程度较轻。提示甜菜碱(100mg/kg，200mg/kg，400mg/kg)可以改善野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压。

(五)右心室病理变化he染色图

5.1实验方法

取右心室心尖组织，10％甲醛固定48h，梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡2小时，常规石蜡包埋，取5um厚连续切片，伊红-苏木素(he)染色。

5.2实验结果

图7结果表明在光学显微镜下观察心肌细胞发现，对照组大鼠心肌细胞排列整齐，细胞连续性好且细胞间隙较小；同对照组相比，模型组大鼠心肌细胞明显排列明显紊乱，心肌细胞明显肥大，心肌细胞之间间隙变窄，同解剖时与肉眼观察右心室肥厚情况相符。而西地那非和甜菜碱治疗后的大鼠心肌细胞直径普遍减小，心肌细胞排列也稍显整齐。反映出甜菜碱治疗后出现明显缓解心肌细胞肥大、右室肥厚、右室重构的效果。提示甜菜碱(100mg/kg，200mg/kg，400mg/kg)可以改善野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压。

(六)甜菜碱对右心室心肌细胞的影响

6.1实验方法

取右心室心尖组织，10％甲醛固定48h，梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡2小时，常规石蜡包埋，取5um厚连续切片，伊红-苏木素(he)染色。image-proplus图像分析软件系统进行图像分析，计算心肌细胞直径(ad)、心肌细胞核密度(mnd)，将ad和mnd作为肺血管重构的指标。

6.2实验结果

图8,9.甜菜碱对肺动脉高压大鼠右心室心肌细胞直径和心肌细胞核密度的影响。

通过测量比较发现，mct组大鼠心肌细胞平均直径(ad)和心肌细胞核密度(mnd)明显高于对照组大鼠，而tet组大鼠也表现出也肌细胞直径(ad)变小，也肌细胞核密度(mnd)降低，反映出甜菜碱治疗后能明显缓解心肌细胞肥大、右室肥厚、右室重构的效果，而测量结果同样说明其产生的效果类似于西地那非治疗。提示甜菜碱(100mg/kg，200mg/kg，400mg/kg)可以改善野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压。

(七)肺组织masson染色图

7.1实验方法

取右下肺组织，10％甲醛固定48h，梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡2小时，常规石蜡包埋，取5um厚连续切片，行masson染色。

7.2实验结果

图10：甜菜碱对肺动脉高压大鼠肺组织胶原纤维变化影响的masson染色图(×400)。

对照组大鼠肺组织切片masson染色可见中小动脉血管壁胶原纤维结构清晰，排列整齐，肺泡结构清晰，模型组大鼠中小动脉血管壁及周围组织则见到大量胶原纤维增殖，结构紊乱，肺泡明显萎缩甚至堵塞，甜菜碱治疗组大鼠肺组织情况较模型组有明显改善，胶原纤维增生减少，肺泡结构也较清晰，同西地那非组大鼠情况相近。提示甜菜碱(100mg/kg，200mg/kg，400mg/kg)可以改善野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压。

(八)肺组织免疫组化实验

8.1实验方法

取右下肺组织，10％甲醛固定48h，梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡2小时，常规石蜡包埋，取5um厚连续切片，按步骤进行免疫组化实验，一抗浓度为mcp-1(1:200)，et-1(1:1000)。

8.2实验结果

由图11,12可以看出，与对照组相比，模型组大鼠肺组织中mcp-1，et-1表达显著增加，而给予甜菜碱治疗以后大鼠肺组织中mcp-1，et-1表达降低，结果与西地那非组相似。提示甜菜碱(100mg/kg，200mg/kg，400mg/kg)可以改善野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压。

(九)肺组织westernblot实验

9.1实验方法

取适量冻存肺组织，经液氮研磨后，加入全组织蛋白抽提液提取组织蛋白，测定蛋白含量，并统一稀释后在沸水中煮10min，室温冷却后，-82℃冰箱保存备用；根据待测蛋白分子的大小制备适宜浓度的sds凝胶，加入蛋白样品及标准蛋白标志物，电泳分离蛋白质后，转印蛋白于硝酸纤维素膜。

载有蛋白的硝酸纤维素膜经5％脱脂牛奶封闭后，加入nf-κb，tnf-α，il-1β及内参照β-actin等一抗4℃过夜，经pbs换洗后，加相应二抗孵育，再经pbs换洗后曝光，测定各蛋白条带光密度值并计算相应的光密度比值。

9.2实验结果

由图13,14,15可以看出，与正常对照组大鼠相比，模型组大鼠肺组织中nf-κb，tnf-α，il-1β的蛋白表达量显著上升(p＜0.01)，而进行甜菜碱治疗组大鼠肺组织中nf-κb，tnf-α，il-1β的蛋白表达量显著降低(p＜0.01)。提示甜菜碱(100mg/kg，200mg/kg，400mg/kg)可以改善野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。