专利名称：重组人甲状旁腺激素1－84的制备方法
技术领域：
本发明涉及甲状旁腺激素1-84的活性蛋白的制备，具体涉及利用基因工程技术制备重组人甲状旁腺激素1-84。
背景技术：
人甲状旁腺激素(human parathyroid hormone，hPTH)是由人甲状旁腺主细胞分泌的一种直链肽类激素，成熟肽全长84个氨基酸，是体内重要的调节钙平衡和骨重建的激素，可以作为一种安全有效的治疗骨质疏松药物研究开发。目前治疗骨质疏松症的药物主要破骨细胞抑制剂，只作用于破骨细胞，可减慢或抑制破骨细胞活性，抑制骨的吸收，而对骨的形成作用很差，不能刺激成骨细胞产生强壮的新骨，也不能使已遭受破坏的骨进行骨重建，只能延缓骨吸收速度。因此，这些药物只能预防和稳定而不能治愈骨质疏松症。与之不同，hPTH小剂量间歇给药，可以同时作用于破骨细胞和成骨细胞，刺激净新骨生成，改善骨质量，促进骨重建，hPTH不仅阻止骨的损失，还可以逆转骨丢失，以全新的机制有效治疗骨质疏松。利用多肽合成技术化学全合成hPTH 1-84成本太高，所以采用基因工程技术生产hPTH 1-84是解决问题的有效手段。
先前的研究表明大肠杆菌分泌表达hPTH 1-84产量低，并无实际生产意义。另外，大肠杆菌表达外源蛋白，往往会在氨基端引入甲硫氨酸；hPTH基因5’端含有一个内源核糖体结合位点(iRBS)，可能会被作为翻译的起始位点，导致表达产物含有hPTH 8-84；另外，hPTH的mRNA和蛋白产物对大肠杆菌内源酶敏感，容易降解，所以在非分泌表达hPTH 1-84的研究中，大肠杆菌直接表达hPTH 1-84基因也遇到了产物不均一、产量不高的问题。最有效的直接表达体系是，Oshika，Y等利采用T7启动子，在大肠杆菌系统表达了设计合成的hPTH 1-84基因，表达水平可达100mg/l，纯化后得率为27mg/l。非分泌表达的另一个策略是融合表达，这种策略可以减少mRNA和蛋白降解，也可以排除iRBS对翻译起始的影响。Paulsen，J.等采用lambda噬菌体pR启动子表达beta-半乳糖苷酶-hPTH融合蛋白，经包涵体收集、甲酸裂解、中和复性、反相层析等步骤得到[Pro1]-hPTH1-84(hPTH 1-84类似物，氨基端引入脯氨酸)，最终得率260mg/l。Forsberg，G.采用IgG结合蛋白作为融合伴侣，在大肠杆菌包内表达可溶的hPTH融合蛋白，经亲和层析、牛凝血酶/枯草芽孢杆菌蛋白酶H64A酶切、阳离子交换层析、凝胶层析和反相层析等得到hPTH 1-84，最终得率为5～8mg/l。现有的rhPTH 1-84制备方法存在的问题是产量低，大部分为包涵体表达需要复性步骤，纯化步骤中普遍包括反相层析，不易放大生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单、易放大、产量高的利用基因工程技术制备重组人甲状旁腺激素(rhPTH 1-84)的方法，以克服现有技术的不足。
本发明的第一方面，提供了一种编码人甲状旁腺激素1-84蛋白的人工DNA序列(序列表序列1)TCTGTGAGTGAAATTCAGCTGATGCATAACCTGGGGAAACATCTGAACTCGATGGAGCGTGTAGAATGGCTGCGTAAGAAGCTGCAGGATGTGCACAATTTTGTTGCCCTGGGTGCCCCGCTGGCTCCGCGCGATGCTGGTTCCCAGCGTCCGCGTAAAAAGGAAGACAATGTCTTGGTTGAGAGCCATGAAAAAAGCCTGGGCGAGGCAGACAAAGCCGATGTGAATGTATTAACTAAAGCTAAATCCCAG该编码序列包括252个核苷酸。本序列与hPTH 1-84的cDNA(Hendy，G.N.等，1981)相比，8.3％的碱基和21.4％的密码子发生了改变。设计本序列时，在不改变所编码氨基酸序列前提下，采用大肠杆菌偏爱密码子，适合在大肠杆菌中表达。本发明提供的编码人甲状旁腺激素1-84的DNA序列与目前任何已报道的表达hPTH 1-84的基因均不相同。本序列编码hPTH1-84的氨基酸序列序列如下NH2-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-Val-Ala-Leu-Gly-Ala-Pro-Leu-Ala-Pro-Arg-Asp-Ala-Gly-Ser-Gln-Arg-Pro-Arg-Lys-Lys-Glu-Asp-Asn-Val-Leu-Val-Glu-Ser-His-Glu-Lys-Ser-Leu-Gly-Glu-Ala-Asp-Lys-Ala-Asp-Val-Leu-Thr-Lys-Ser-Gln-COOH本发明的第二方面，提供了一种含有hPTH 1-84编码序列、肠激酶识别序列(DDDDK)的编码序列、限制酶识别位点的人工DNA序列(序列表序列2)CTGGGTACCGATGACGATGACAAGTCTGTGAGTGAAATTCAGCTGATGCATAACCTGGGGAAACATCTGAACTCGATGGAGCGTGTAGAATGGCTGCGTAAGAAGCTGCAGGATGTGCACAATTTTGTTGCCCTGGGTGCCCCGCTGGCTCCGCGCGATGCTGGTTCCCAGCGTCCGCGTAAAAAGGAAGACAATGTCTTGGTTGAGAGCCATGAAAAAAGCCTGGGCGAGGCAGACAAAGCCGATGTGAATGTATTAACTAAAGCTAAATCCCAGTGATAAGCTTGCG序列2在序列1的5’-端插入CTGGGTACCGATGACGATGACAAG共24个核苷酸的片断，其中GGTACC是限制酶Kpn I识别位点，GATGACGATGACAAG是肠激酶识别位点(DDDDK)的编码序列；3’-端插入TGATAAGCTTGCG共13个核苷酸的片断，该片断包含限制酶Hind III识别位点AAGCTT，同时其中的TGATAA位于阅读框构成终止密码。
本发明的第三方面，提供了一种含有序列2所示的核苷酸序列的表达质粒，序列2所示的核苷酸序列与表达质粒可操作地连接。
在一个优选的方案中，表达质粒选用pET32a(+)，序列2所示的核苷酸序列插入到pET32a(+)的Kpn I和Hind III位点之间，得到pET32a(+)-PTH84质粒。
本发明的第四方面，提供了一种带有pET32a(+)-PTH84质粒的大肠杆菌菌株。
在一个优选的方案中，大肠杆菌菌株选用大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明的第五方面，提供了一种表达人甲状旁腺激素1-84活性蛋白的方法，包括如下步骤序列2所示的DNA片断和质粒pET32a(+)通过Kpn I和Hind III双酶切连接，转化大肠杆菌受体菌，获得pET32a(+)-PTH84质粒；将pET32a(+)-PTH84质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)，得到表达转化子；培养表达转化子，得到重组甲状旁腺激素1-84融合蛋白。
本发明的第六方面，提供了一种纯化重组人甲状旁腺激素1-84活性蛋白的方法，包括以下步骤培养pET32a(+)-PTH84质粒转化的大肠杆菌BL21(DE3)，收集菌体，破碎；菌体裂解液进行镍离子螯合层析，收集洗脱液；上步得到的洗脱液中加入肠激酶进行酶切反应；酶切反应产物，依次进行阴离子交换层析、阳离子交换层析、凝胶层析，获得人甲状旁腺激素1-84纯品。
本发明设计合成了采用大肠杆菌偏爱密码子，适合在大肠杆菌中表达的rhPTH 1-84编码基因，并在其上游插入了肠激酶识别位点(DDDDK)的编码序列，使得rhPTH 1-84可以在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达，经肠激酶切割后可得到N端正确的rhPTH 1-84活性蛋白，效果优良。
本发明选择质粒pET32a(+)作为表达载体，大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主菌。由于pET32a(+)含有采用大肠杆菌自身的硫氧还蛋白作为融合伴侣，不仅提高了融合蛋白的可溶性，还使mRNA翻译效率提高，有效避免宿主菌内源酶对mRNA和蛋白本身的攻击。同时，由于BL21(DE3)宿主菌缺乏ompT和Lon蛋白酶，也减少了表达和纯化过程中对蛋白的降解作用。
总体而言，与现有技术相比，本发明的优点是目标蛋白rhPTH 1-84在大肠杆菌细胞内以可溶形式表达，省去复性步骤；纯化步骤中不含反相层析，尽量采用吸附作用层析，处理量，易放大；产量高，最终纯品得率可达300mg/l，具有生产意义，为rhPTH 1-84的工业化生产奠定了基础。
图1显示了本发明制备rhPTH 1-84的工艺流程图；图2显示了质粒pET32a(+)-PTH84构建过程；图3显示了rhPTH 1-84纯化过程电泳图谱(其中泳道1为菌体裂解上清液；泳道2为亲和层析穿出峰；泳道3为亲和层析洗脱峰；泳道4为肠激酶酶切后混合液；泳道5为DEAE Sepharose FF穿出峰；泳道6为SPSepharose FF洗脱峰；泳道7为Superdex 75洗脱主峰)；具体实施方式
本发明使用的缩写中，rhPTH 1-84指重组人甲状旁腺激素、Trx指硫氧还蛋白，His tag意为组氨酸纯化标签，pET32a(+)-PTH84指序列2所示的DNA片断和质粒pET32a(+)通过Kpn I和Hind III双酶切连接获得的表达质粒。
其他的技术术语包括融合表达本发明采用pET32a(+)表达载体，把编码人甲状旁腺激素1-84蛋白的基因插入到大肠杆菌自身的蛋白-硫氧还蛋白(Trx)的下游，可以增加目标蛋白表达的溶解性和稳定性。
肠激酶切割序列2在人甲状旁腺激素编码序列的5’-端插入肠激酶识别位点(DDDDK)的编码序列GATGACGATGACAAG，因此在表达出的融合蛋白中，硫氧还蛋白和rhPTH 1-84之间，带有肠激酶酶切位点DDDDK。融合蛋白经肠激酶切割，可以释放出N端正确加工的rhPTH 1-84蛋白。
金属螯合层析本发明采用的pET32a(+)表达载体中，融合蛋白包含6个组氨酸组成的His tag，His tag用于金属螯合层析纯化提取融合蛋白，本发明采用Ni2+-Chelating Sepharose FF镍离子螯合柱。
本发明所说的“可操作地连接”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连接于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能翻译的位置时，那么它是可操作地连接于编码序列。本发明用于合成rhPTH 1-84基因的PCR引物由上海捷倍思基因技术有限公司合成，肠激酶按Vozza，L.A.等(Production of a recombinant bovineenterokinase catalytic subunit in the methylotrophic yeast Pichia pastoris，Biotechnology(NY)，1996 Jan；14(1)77-81)公开的方法制备。表达质粒pET32a(+)、大肠杆菌BL21(DE3)以及DH5α均购于Novagen公司，限制性内切酶购于Takara公司，采用的层析介质包括Ni2+-Chelating Sepharose FF、DEAE Sepharose FF、SP Sepharose FF以及Superdex 75均购于AmershamBiosciences公司，玻璃层析柱购于华美生物工程公司。
下面结合实施例，对本发明做进一步地说明，其目的仅在于更好的理解本发明而绝非限制本发明的保护范围，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明的权利要求所定义的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，《分子克隆实验室手册》(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1工程菌构建目的基因合成目的基因设计如序列2所示，全长289bp。采用交叠延伸聚合酶链反应法(gene splicing by over lap extension PCR，SOE PCR)获得，首先合成以下5个引物(Primer)片断Primer1(5’CTGGGTACCGATGACGATGACAAGTCTGTGAGTGAAATTCAGCTGATGCATAACCTGGGGAAACATCTGAACT3’)，Primer2(5’AAAATTGTGCACATCCTGCAGCTTCTTACGCAGCCATTCTACACGCTCCATCGAGTTCAGATGTTTCCCCAGG3’)，Primer3(5’TACGCGGACGCTGGGAACCAGCATCGCGCGGAGCCAGCGGGGCACCCAGGGCAACAAAATTGTGCACATCCTGCA3’)，Primer4(5’TCTGCCTCGCCCAGGCTTTTTTCATGGCTCTCAACCAAGACATTGTCTTCCTTTTTACGCGGACGCTGGGAACCA3’)，Primer5(5’CGCAAGCTTATCACTGGGATTTAGCTTTAGTTAATACATTCACATCGGCTTTGTCTGCCTCGCCCAGGCTTTT3’).
进行四轮PCR，合成设计序列。第一轮PCR中，primer 1和primer 2被分别用作正义和反义引物。primer 1共73个bp，与设计序列的1～73bp一致；同时primer 2的73bp与设计序列的54～126bp互补。这样，primer 1和primer 2的3’端有20bp是互补的，所以primer 1和primer 2可以互为引物和模板，合成的产物与设计序列的1～126完全一致。第一轮的产物与Primer3(互补于设计序列的107～181bp)的3’端也有20bp是互补的。所以在第二轮PCR中，第一轮的产物与Primer3互为引物和模板，并且将产物延伸到1～181bp。依此类推，用四轮SOE PCR合成了序列2所示的目的基因。
表达载体pET32a(+)-PTH84构建上述PCR产物和pET32a(+)经过KpnI和Hind III双酶切连接构建成载体pET32a(+)-PTH84，转化至表达宿主E.coli DH5α，筛选阳性克隆，提取质粒经DNA测序确认无误。
工程菌建立用常规CaCl2法，将pET32a(+)-PTH84转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，从氨苄抗性菌落中分离获得转化子BL21(DE3)/pET32a(+)-PTH84。工程菌经发酵培养，IPTG诱导，SDS-PAGE检测，所得工程菌细胞质内表达一种分子量为27Kd的融合蛋白，表达量30％。
实施例2工程菌BL21(DE3)/pET32a(+)-PTH84发酵发酵在NLF-22发酵罐(BIOENGINEERING，Switzerland)进行，10L培养基接入500ml种子液，控制培养温度30℃，pH7.0，补料恒溶氧(30％)培养，OD600达到35，加入终浓度为0.2mmol的IPTG，诱导3小时终止发酵，收集菌体。
实施例3rhPTH 1-84纯化将实施例2得到的菌体悬浮于裂解液(50mM imidazole，pH7.0，20mMPhosphate Buffer(PB))，高压匀质机破壁，离心；上清液过以裂解液平衡的镍离子螯合柱Ni2+-Chelating Sepharose FF(Amersham Biosciences，Sweden)，洗脱液(200mM imidazole，pH7.0，20mM PB)洗脱，收集洗脱峰；测定蛋白浓度，稀释至5mg/ml，加入肠激酶至终浓度为0.5U/ml，37℃，24小时；酶解液过DEAE Sepharose FF(Amersham Biosciences)柱(pH7.8，20mM PB)，收集穿出液；调pH至6.5，过SP Sepharose FF(AmershamBiosciences)柱(以pH6.5，20mM PB平衡)，400mM NaCl，pH6.5，20mM PB洗脱，收集洗脱峰；过Superdex-75(Amersham Biosciences)柱(pH7.0，20mMPB)，收集主峰。SDS-PAGE检测为rhPTH 1-84。纯度大于98％，得率可达300mg/l。
实施例4rhPTH 1-84冷冻干燥制成成品在一百级的洁净空气环境下，将实施例3得到的rhPTH 1-84纯品，加入医用甘露醇，用pH7.0，20mM PB稀释，至甘露醇终浓度5％，rhPTH 1-84终浓度为0.1mg/ml，0.22μm无菌滤膜过滤，分装至3ml西林瓶，1ml/支，FreeZone 12 Freeze-dry System(Labconco，USA)冷冻干燥48小时。
实施例5rhPTH 1-84的鉴定和检测N端和C端氨基酸序列分析委托中国科学院上海生物化学研究所进行，蛋白序列仪(PE，Inc.，model ABI-491A)。N端15个氨基酸和C端2个氨基酸的氨基酸序列分析结果分别为NH2-SVSEIQLMHNLGKHL和SQ-COOH，与理论序列完全一致。
质谱分析委托中国科学院上海生物化学研究所进行，质谱仪(LCQ-ClassicMALDITOF mass spectrometer)。测得重组PTH 1-84的分子量为9424，与理论分子量9424.3相符。
序列表<110>华东理工大学<120>重组人甲状旁腺激素1-84的制备方法<130>SPI068104<160>7<170>Patent In version 3.1<210>1<211>252<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<223>编码人甲状旁腺激素1-84<400>1TCTGTGAGTG AAATTCAGCT GATGCATAAC CTGGGGAAAC 40ATCTGAACTC GATGGAGCGT GTAGAATGGC TGCGTAAGAA 80GCTGCAGGAT GTGCACAATT TTGTTGCCCT GGGTGCCCCG120CTGGCTCCGC GCGATGCTGG TTCCCAGCGT CCGCGTAAAA160AGGAAGACAA TGTCTTGGTT GAGAGCCATG AAAAAAGCCT200GGGCGAGGCA GACAAAGCCG ATGTGAATGT ATTAACTAAA240GCTAAATCCC AG 252<210>2<211>289<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<400>2CTGGGTACCG ATGACGATGA CAAGTCTGTG AGTGAAATTC 40AGCTGATGCA TAACCTGGGG AAACATCTGA ACTCGATGGA 80GCGTGTAGAA TGGCTGCGTA AGAAGCTGCA GGATGTGCAC120AATTTTGTTG CCCTGGGTGC CCCGCTGGCT CCGCGCGATG160CTGGTTCCCA GCGTCCGCGT AAAAAGGAAG ACAATGTCTT200GGTTGAGAGC CATGAAAAAA GCCTGGGCGA GGCAGACAAA240GCCGATGTGA ATGTATTAAC TAAAGCTAAA TCCCAGTGAT280AAGCTTGCG 289
<210>3<211>73<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<400>3CTGGGTACCG ATGACGATGA CAAGTCTGTG AGTGAAATTC 40AGCTGATGCA TAACCTGGGG AAACATCTGA ACT 73<210>4<211>73<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<400>4AAAATTGTGC ACATCCTGCA GCTTCTTACG CAGCCATTCT 40ACACGCTCCA TCGAGTTCAG ATGTTTCCCC AGG 73<210>5<211>75<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<400>5TACGCGGACG CTGGGAACCA GCATCGCGCG GAGCCAGCGG 40GGCACCCAGG GCAACAAAAT TGTGCACATC CTGCA 75<210>6<211>75<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<400>6TCTGCCTCGC CCAGGCTTTT TTCATGGCTC TCAACCAAGA 40CATTGTCTTC CTTTTTACGC GGACGCTGGG AACCA 75
<210>7<211>73<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<400>7CGCAAGCTTA TCACTGGGAT TTAGCTTTAG TTAATACATT 40CACATCGGCT TTGTCTGCCT CGCCCAGGCT TTT 7权利要求
1.一种编码人甲状旁腺激素1-84的核苷酸序列，如序列1所示。
2.一种含有人甲状旁腺激素1-84编码序列的核苷酸序列，如序列2所示。
3.一种表达质粒，其特征在于，含有序列2所示的核苷酸序列。
4.如权利要求3所述的表达质粒，其特征在于，序列2插入到pET32a(+)质粒的Kpn I和Hind III限制酶位点之间。
5.一种表达人甲状旁腺激素1-84的大肠杆菌菌株，其特征在于，带有质粒pET32a(+)-PTH84。
6.如权利要求5所述的大肠杆菌菌株，其特征在于，所说的大肠杆菌菌株是大肠杆菌BL21(DE3)。
7.一种表达人甲状旁腺激素1-84活性蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤序列2所示DNA片断和质粒pET32a(+)通过Kpn I和Hind III双酶切连接，转化大肠杆菌受体菌，获得pET32a(+)-PTH84质粒；将pET32a(+)-PTH84质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)，得到表达转化子；培养表达转化子，得到重组甲状旁腺激素1-84融合蛋白。
8.一种纯化重组人甲状旁腺激素1-84活性蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤培养pET32a(+)-PTH84质粒转化的大肠杆菌BL21(DE3)，收集菌体，破碎；菌体裂解液进行镍离子螯合层析，收集洗脱液；上步得到的洗脱液中加入肠激酶进行酶切反应；酶切反应产物，依次进行阴离子交换层析、阳离子交换层析、凝胶层析，获得人甲状旁腺激素1-84纯品。
全文摘要
本发明公开了一种利用基因工程技术制备重组人甲状旁腺激素1－84的方法。采用大肠杆菌偏爱密码子，本发明设计合成了rhPTH 1－84的编码序列并构建了载体和工程菌。本发明以可溶形式在大肠杆菌胞质中高效表达含hPTH 1－84完整序列的融合蛋白，融合蛋白经金属螯合层析纯化后，以肠激酶酶切，再经离子交换、凝胶层析等进一步纯化，获得了纯度98％以上的rhPTH 1－84，得率可达300mg/l。
文档编号C12P21/02GK1861790SQ200610026019
公开日2006年11月15日 申请日期2006年4月25日 优先权日2006年4月25日
发明者刘清海, 陶欣艺, 熊玉春, 刘美云, 宋庆训, 马兴元, 杨忠, 童望宇, 魏东芝 申请人:华东理工大学