专利名称：一种新型ldr肿瘤药物基因组检测系统的制作方法
技术领域：
本发明所采用的是以LDR为核心的oligo芯片检测技术，成功的将高温连接酶检测反应技术和基因芯片技术结合，开发稳定的肿瘤药物基因组临床检测系统。
背景技术：
随着人类基因组计划(Human genome project)的完成，人们对基因功能的研究不断的加强，已经有越来越多的基因突变与致病机理被广为发现。同时，药物基因组学(Pharmacogenomics)作为一种新的生物产业化方向也随之蓬勃发展起来。
研究发现，在人类基因组的DNA序列中每600个碱基中便有一个碱基是有多态性的，即人们常说的SNP(Single nucleotide polymorphisms，单核苷酸多态性)。对疾病相关DNA多态性的检测，最常见的是基于对SNP的检测。SNP作为一种遗传标记，与疾病的相关性较为稳定，是遗传学研究的新工具，在基因研究和药物设计中被广泛应用，临床上具有重大意义。
目前，国内外所采用的DNA多态性检测手段主要有DNA测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、变性高效液相色谱(dHPLC)、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)、根据DNA列阵的微测序法、动态等位基因特异的杂交、寡聚核苷酸特异的连接、DNA芯片以及TaqMan系统等。
DNA测序技术快速、准确，但是成本较高，目前不可能在大中型医院中推广。RFLP方法只能检测一部分DNA的多态性，通量较低。SSCP技术既费时费力，又不易实现自动化，而且DNA链的二级结构易造成人工假相，使结果出现偏差，不适宜于临床DNA多态性的检测。dHPLC技术则由于其设备昂贵等原因，难以在临床诊断中推广。Taqman方法采用荧光淬灭及双末端标记技术，探针标记成本较高且存在荧光淬灭难以彻底的问题，同时，PCR扩增时采用外切酶活性，因此荧光定量时受酶性能的影响，亦可能影响结果判读。
发明内容
1、发明目的随着对肿瘤化疗药物的研究，人们发现一些药物的毒副作用和某些基因位点紧密相关，其机理往往是若干位点的变化使药物代谢基因的活性下降，有些则直接造成该基因活性的丧失，从而使药物代谢产生障碍引起一系列严重的化疗毒副作用。由此，如果能对这些基因位点进行检测，预判药物对病人产生的不良作用，实现化疗药物的针对性用药(个体化用药)，就能从根本上缓解病人痛苦，提高病人在化疗过程中的生存概率。而国内外现有的各种方法或是由于技术上不适于临床操作，或是由于设备过于昂贵，在我国目前的国情下均无法在实际临床检测中推广。
本发明旨在建立以LDR(Ligase detection reaction，连接酶检测反应)为核心的肿瘤化疗药物疗效和毒副作用临床检测系统，开发适合中国国情的快速、可靠、稳定的DNA多态性检测试剂盒，以提高肿瘤病人治愈率和生活质量、延长生存期为目标，全力对患者负责，最大限度的保护病人的利益。
2、技术构思本发明所采用的是以LDR为核心的oligo芯片检测技术，成功的将高温连接酶检测反应技术和芯片技术结合，开发稳定的肿瘤药物基因组临床检测系统。
基因芯片技术是现代分子生物学与计算机等技术高度综合的产物，具有“高通量、高集成、并行化、微型化、自动化、连续化”等重要特征。基于高温连接酶的连接酶检测反应是一项操作简单、稳定的DNA多态性检测技术，该方法有较强的特异性，能在低拷贝数的情况下对SNP进行检测。
结合芯片自身固有的“高通量、高灵敏度”优点，本发明的新型LDR肿瘤药物基因组检测必将为我国的基因芯片产业带来一次技术上的飞跃，同时为大力推进我国肿瘤化疗药物个体化用药进程做出实质性的贡献。
3、技术方案本发明的技术方案原理如
图1。
如图2，新型LDR临床检测基因芯片和传统芯片的结果相比(1)结果唯一确定，非此即彼；(2)没有假阳性假阴性结果；(3)操作简单，结果稳定，可重复性强。
本发明针对一些常用的肿瘤药物，对若干相关基因位点同时进行检测，给予临床肿瘤化疗药物用药指导性提示信息。检测所相关的药物包括紫杉醇、顺氯氨铂(顺铂)、5-氟尿嘧啶、CTP-11、奥沙利铂(乐沙定)、6-巯基嘌呤、6-巯代鸟嘌呤、草酸铂，检测的相关基因包括谷光甘肽S转移酶M1、谷光甘肽S转移酶Pi、二氢嘧啶脱氢酶、UDP-葡萄糖醛酸转移酶、DNA修复蛋白XRCC1、5，10亚甲基四氢叶酸还原酶和巯嘌呤甲基转移酶。详见下表
相关基因和化疗药物介绍
4、显著优点和技术进步DNA多态性检测可以广泛应用于病原体疾病的分型诊断、多基因复杂疾病诊断以及个体化用药等多个方面。但是，目前国内外的多态性检测技术主要还是作为实验室的科研工具，并未能在临床诊断与治疗中广泛使用。
与其他相关技术相比，本发明的新型LDR肿瘤药物基因组检测系统具有以下多项优势(1)准确度高、结果稳定可靠本发明的技术手段不会出现其他检测方法的假阴性/假阳性状况，LDR技术可以准确的对SNP进行分型；(2)操作简单和目前的PCR技术相似，LDR检测技术操作简单，对技术人员没有特殊的专业要求，只要接受简单的分子生物学操作培训即可；(3)成本低使用LDR检测系统只需现有的PCR仪等分子实验室仪器，无需再投入大量的资金购置仪器；(4)通用性强成熟的LDR检测系统可以适用于各种SNP位点的分型；(5)高通量LDR检测系统可以同时对多达上百个SNP位点进行分型，大大提高了检测效率，满足复杂疾病及药物基因组诊断需求；(6)所选基因检测位点完全适应中国人群的基因状况。
具体实施例方式
LDR肿瘤药物基因组芯片点样方案 芯片扫描图判读说明1.最左边的竖排是阳性对照，用以检验杂交效果；2.左起第2竖排是阴性对照，洗脱效果好的话应该是完全看不见的；3.左起第3-5竖排(3个平行)灯亮说明是一种基因型，右起第1-3竖排(3个平行)灯亮说明是另一种基因型，两边都亮说明是杂合子。
如图3的LDR肿瘤药物基因组芯片扫描结果，得以下与芯片上位置对应的位点分型结果
权利要求
1.以LDR(Ligase detection reaction，连接酶检测反应)为核心的基因芯片技术应用于肿瘤化疗药物疗效和毒副作用检测。
2.如上述1项记载的方法用于肿瘤化疗个体化用药指导中。
3.作为临床检测手段，包括对肿瘤患者用上述1-2项记载的技术方案。
全文摘要
本发明公开的是适合中国国情的快速、可靠的新型LDR肿瘤化疗药物疗效和毒副作用临床检测系统。该技术方案成功的将基于高温连接酶的连接酶检测反应(Ligase detection reaction，LDR)技术和基因芯片技术相结合，开发稳定的肿瘤药物基因组检测试剂盒，以推进我国肿瘤化疗药物个体化用药的全面实现。该检测系统具有准确度高、结果稳定可靠、操作简单、成本低、通用性强及高通量等多项优势。本发明对提高肿瘤病人治愈率和生活质量、延长生存期，最大限度的保护病人的利益，将做出巨大贡献。
文档编号C12Q1/68GK101063167SQ20061002601
公开日2007年10月31日 申请日期2006年4月25日 优先权日2006年4月25日
发明者陈轶群, 李婷 申请人:上海翼和应用生物技术有限公司