专利名称：重组酵母基因工程菌pPICZαA－K1－VEGF165/GS115的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种重组酵母基因工程菌pPICZαA-K1-VEGF165/GS115的制备方法。
背景技术：
恶性肿瘤即癌症，是威胁人类健康的最严重的疾病之一。恶性实体肿瘤的常规治疗包括手术摘除、化学治疗、放射治疗等，这些治疗方法存在易复发，对人体的毒副作用大，会诱导抗药性产生等不理想之处。生命科学基础研究的突破和生物技术的发展，为恶性肿瘤的最终攻克提供了其他更加有效和可行的手段。
20世纪70年代初，Folkman博士提出“肿瘤增殖具有血管依赖性”的观点，即体积超过1mm3～2mm3的肿瘤需要新生血管维持营养和氧气的供给并且排出代谢产物，还需要新生血管提供转移的通道。从这个观点出发，提出一种治疗肿瘤的新策略，即不直接从正面攻击肿瘤，而是阻断肿瘤的营养供应，间接地抑制肿瘤生长，使其处于休眠状态。这就是抗血管生成疗法，也被形象地称为肿瘤的“饿死疗法”。
抗血管生成疗法是近几年来肿瘤生物治疗研究的热点，与以往的方法相比，有着显著的优越性①广泛的抑瘤谱；②不易产生耐药性；③无明显毒副作用；④药物易于到达靶部位；⑤可同时治疗肿瘤的转移；⑥与化疗和放疗有协同作用。目前已发现了多种血管生成抑制剂，有数百种药物进入了临床试验阶段，大多数处于二期临床，有十几种药物进入了三期临床，它们都显示出了初步疗效和光明的治疗前景。
血管抑素(Angiostatin)是人纤溶酶原(Plasminogen)的kringle 1-kringle4区域，具有抑制血管内皮细胞增殖的能力。目前血管抑素已进入一期临床试验。其中Kl(Kringle 1)不仅能有效抑制内皮细胞的增殖，还具有结合赖氨酸的能力(可以用赖氨酸亲和柱纯化蛋白)。
血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)是一种特异作用于血管内皮细胞的强有力的多功能细胞因子。它强烈而特异地促使内皮细胞分裂增殖、增生、转移，增加血管通透性并促进新血管生成。它促进血管内皮细胞的有丝分裂作用是通过存在于内皮细胞表面VEGF的特异性受体所介导的。VEGF是一种分子量为46kDa的二聚体糖蛋白，由两个分子量相同(23kDa)的亚基经二硫键结合而成。VEGF是由多个成员组成的家族，不同形式的VEGF是同一基因不同方式的mRNA水平剪接而形成的。根据VEGF含有的氨基酸数量的不同，一共有4种不同的VEGFs形式，它们分别是VEGF165，VEGF165，VEGF189和VEGF206。其中，VEGF165和VEGF165是分泌型的蛋白质。
VEGF可在很多正常成人和动物组织中表达，但一般水平较低。在病理情况下，特别是在肿瘤细胞中，VEGF无论是在mRNA水平还是在蛋白质水平均有过量表达，VEGF能靶向性地结合到内皮细胞的VEGFR(血管内皮生长因子受体)上，从而促进血管新生。
本发明构建了一种重组酵母基因工程菌pPICZαA-K1-VEGF165/GS115，目的是通过毕赤酵母表达体系得到重组蛋白K1-VEGF165，利用VEGF165的靶向性，将具有血管生成抑制活性的K1蛋白运送到血管内皮细胞周围，从而抑制血管新生。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组酵母基因工程菌pPICZαA-K1-VEGF165/GS115的制备方法，目的是利用毕赤酵母真核表达系统对重组基因pPICZαA-K1-VEGF165进行表达，期望得到一种多靶点、多功能、高效的抗肿瘤血管生成基因重组融合蛋白K1-VEGF165。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案一种重组酵母基因工程菌pPICZαA-K1-VEGF165/GS115的制备方法，其特征在于该方法，包括以下步骤a.重组质粒pPICZαA-K1-VEGF165的构建融合基因K1-VEGF165包括2个功能域片段和1段连接臂，2个功能域片段分别是K1基因和VEGF165基因；1段连接臂是连接K1基因和VEGF165基因的柔性连接臂(Gly)3；其构建方法包括如下步骤(1)重组质粒pPICZαA-K1的构建；(2)重组质粒pPICZαA-K1-VEGF165的构建；b.重组酵母基因工程菌pPICZαA-K1-VEGF165/GS115的构建；上述的重组质粒pPICZαA-K1的构建方法为以K1的cDNA为模板进行PCR扩增，得到约300bp的K1片段，K1片段用EcoRI和KpnI双酶切后插入质粒pPICZαA的EcoRI/KpnI之间，构成重组质粒pPICZαA-K1。转化大肠杆菌TOP10F’，挑选出抗Zeocin的阳性克隆。
上述的重组质粒pPICZαA-K1-VEGF165的构建的方法为提取人脐静脉内皮细胞的总RNA，设计引物进行RT-PCR，得到VEGF165的cDNA。以VEGF165的cDNA为模板进行PCR扩增，得到约500bp的VEGF165基因，VEGF165片段用KpnI和NotI双酶切后插入重组质粒pPICZαA-K1的KpnI/NotI之间，构成重组质粒pPICZαA-K1-VEGF165；转化大肠杆菌TOP10F’，挑选出抗Zeocin的阳性克隆。
上述的重组酵母基因工程菌pPICZαA-K1-VEGF165/GS115的构建的方法为重组质粒pPICZαA-K1-VEGF165用Sac I线性化后，电击转化毕赤酵母GS115，将电击后的混合液涂布在Zeocin浓度分别为100，250，500和1000ug/ml的YPDS平板上，30℃培养2～4天，待克隆长出。
毕赤酵母是真核表达系统，能以甲醇为唯一碳源，pPICZαA是分泌型表达质粒，含有醇氧化酶的强启动子(PAOX1)，在甲醇的诱导下能表达外源蛋白，并能分泌到胞外，方便蛋白的提取与纯化。毕赤酵母能通过发酵罐发酵生产大量的目的蛋白，不需要外加热源，成本低，规模大。
图1为重组质粒pPICZαA-K1-VEGF165的构建流程图具体实施方式
本发明主要包括两大部分重组质粒pPICZαA-K1-VEGF165的构建，重组酵母基因工程菌pPICZαA-K1-VEGF165/GS115的构建。
具体方案叙述如下1重组质粒pPICZαA-K1-VEGF165的构建和鉴定融合基因K1-VEGF165包括2个功能域片段和1段连接臂，2个功能域片段分别是K1基因和VEGF165基因；1段连接臂是连接K1基因和VEGF165基因的柔性连接臂(Gly)3。实验操作时，参见图1，将K1基因和VEGF165基因通过连接臂(Gly)3连接，构建重组质粒pPICZαA-K1-VEGF165。
1.1重组质粒pPICZαA-K1的构建和鉴定根据K1的核苷酸序列设计K1的上下游引物上游引物5’-GCCGAATTCGTGTATCTCTCAGAG-3’；下游引物5’-TTTGGTACCGCCACCTTCCTCTTCACAC-3’。
以K1的cDNA为模板进行PCR扩增，得到约300bp的K1片段，回收纯化扩增产物。K1片段用EcoRI和Kpn I双酶切后插入质粒pPICZαA的EcoRI/Kpn I之间，构成重组质粒pPICZαA-K1。转化大肠杆菌TOP10F’，挑选出抗Zeocin的阳性克隆。重组质粒pPICZαA-K1用EcoRI和Kpn I双酶切，得到300bp和3.6kb两个片段，与预期结果相符。DNA序列测定表明，K1基因的序列正确。
1.2构建重组质粒pPICZαA-K1-VEGF165根据VEGF165的核苷酸序列设计其上下游引物上游引物5’-TTTGGTACCGCACCCATGGCAGAAGGAG-3’；下游引物5’-GGGTCTAGATTCCGCCTCGGCTTGTCACATC-3’。
提取人脐静脉内皮细胞的总RNA，利用VEGF165的上下游引物，通过一步法RT-PCR得到VEGF165的cDNA。以VEGF165的cDNA为模板进行PCR扩增，得到约500bp的VEGF165基因。VEGF165片段用Kpn I和NotI双酶切后插入重组质粒pPICZαA-K1的KpnI/NotI之间，构成重组质粒pPICZαA-K1-VEGF165。转化大肠杆菌TOP10F’，挑选出抗Zeocin的阳性克隆。
重组质粒pPICZαA-K1-VEGF165用EcoRI和NotI双酶切，得到800bp和3.6kb两个片段，与预期结果相符。DNA序列测定表明，K1-VEGF165基因的序列正确。
2重组酵母基因工程菌pPICZαA-K1-VEGF165/GS115的构建和鉴定重组质粒pPICZαA-K1-VEGF165用Sac I线性化后，电击转化毕赤酵母GS115，将电击后的混合液涂布在Zeocin浓度分别为100，250，500和1000ug/ml的YPDS平板上，30℃培养2～4天，待克隆长出。挑选Zeocin浓度为1000ug/ml平板上长出的克隆。用玻璃珠法提取重组酵母的染色体组，以其为模板，以K1的上游引物和VEGF165的下游引物进行PCR扩增，得到800bp大小的片段，说明融合基因K1-VEGF165成功地整合到了酵母染色体上。
3重组菌株的遗传稳定性将重组酵母菌pPICZαA-K1-VEGF165/GS115传代10次以上后，PCR分析表明目的基因仍稳定地整合在染色体上。
最终获得的重组融合基因K1-VEGF165的核苷酸序列为GCACCCATGGCAGAAGGAGGAGGGCAGAATCATCACGAAGTGGTGAAGTTCATGGATGTCTATCAGCGCAGCTACTGCCATCCAATCGAGACCCTGGTGGACATCTTCCAGGAGTACCCTGATGAGATCGAGTACATCTTCAAGCCATCCTGTGTGCCCCTGATGCGATGCGGGGGCTGCTGCAATGACGAGGGCCTGGAGTGTGTGCCCACTGAGGAGTCCAACATCACCATGCAGATTATGCGGATCAAACCTCACCAAGGCCAGCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTACAGCACAACAAATGTGAATGCAGACCAAAGAAAGATAGAGCAAGACAAGAAAATCCCTGTGGGCCTTGCTCAGAGCGGAGAAAGCATTTGTTTGTACAAGATCCGCAGACGTGTAAATGTTCCTGCAAAAACACAGACTCGCGTTGCAAGGCGAGGCAGCTTGAGTTAAACGAACGTACTTGCAGATGTGACAAGCCGAGGCGGAATCTAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATAGCGCCGTCGACCATCATCATCATCATCATTGAGTTTGTAGCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCA
GAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTTATTTCCCACTCGTCTTCAGAGTACAGAAAGATTAAGTGAGACCTTCGTTTGTGCGGATCCCCCACACACCATAGCTTCAAAATGTTTCTACTCTTTTTACTCTTCAGATTTTCTCGGACTCCCGCGCATCGTCGTACACTTCAAACACCCGAGCACAGCATACTAAATTCCCCTCGTTC
权利要求
1.一种重组酵母基因工程菌pPICZαA-K1-VEGF165/GS115的制备方法，其特征在于该方法，包括以下步骤a.重组质粒pPICZαA-K1-VEGF165的构建融合基因K1-VEGF165包括2个功能域片段和1段连接臂，2个功能域片段分别是K1基因和VEGF165基因；1段连接臂是连接K1基因和VEGF165基因的柔性连接臂(Gly)3；其构建方法包括如下步骤(1)重组质粒pPICZαA-K1的构建；(2)重组质粒pPICZαA-K1-VEGF165的构建；b.重组酵母基因工程菌pPICZαA-K1-VE6F165/GS115的构建。
2.根据权利要求1所述的重组酵母基因工程菌pPICZαA-K1-VEGF165/GS115的制备方法，其特征在于所述的重组质粒pPICZαA-K1的构建方法为根据K1的核苷酸序列设计K1的上下游引物上游引物5’-GCCGAATTCGTGTATCTCTCAGAG-3’；下游引物5’-TTTGGTACCGCCACCTTCCTCTTCACAC-3’。以K1的cDNA为模板进行PCR扩增，得到约300bp的K1片段，K1片段用EcoRI和KpnI双酶切后插入质粒pPICZαA的EcoRI/KpnI之间，构成重组质粒pPICZαA-K1。转化大肠杆菌TOP10F’，挑选出抗Zeocin的阳性克隆。
3.根据权利要求1所述的重组酵母基因工程菌pPICZαA-K1-VEGF165/GS115的制备方法，其特征在于所述的重组质粒pPICZαA-K1-VEGF165的构建的方法为根据VEGF165的核苷酸序列设计其上下游引物上游引物5’-TTTGGTACCGCACCCATGGCAGAAGGAG-3’；下游引物5’-GGGTCTAGATTCCGCCTCGGCTTGTCACATC-3’。提取人脐静脉内皮细胞的总RNA，设计引物进行RT-PCR，得到VEGF165的cDNA。以VEGF165的cDNA为模板进行PCR扩增，得到约500bp的VEGF165基因，VEGF165片段用KpnI和NotI双酶切后插入重组质粒pPICZαA-K1的KpnI/NotI之间，构成重组质粒pPICZαA-K1-VEGF165；转化大肠杆菌TOPI0F’，挑选出抗Zeocin的阳性克隆。
4.根据权利要求1所述的基因重组融合蛋白K1-VEGF165的制备方法，其特征在于所述的重组酵母基因工程菌pPICZαA-K1-VEGF165/GS115的构建的方法为重组质粒pPICZαA-K1-VEGF165用SacI线性化后，电击转化毕赤酵母GS115，将电击后的混合液涂布在Zeocin浓度分别为100，250，500和1000ug/ml的YPDS平板上，30℃培养2～4天，待克隆长出。
全文摘要
本发明涉及一种重组酵母基因工程菌pPICZαA－K1－VEGF165/GS115的制备方法。该方法包括以下步骤重组质粒pPICZαA－K1－VEGF165的构建(包括重组质粒pPICZαA－K1的构建、重组质粒pPICZαA－K1－VEGF165的构建)、重组酵母基因工程菌pPICZαA－K1－VEGF165/GS115的构建。毕赤酵母是真核表达系统，能以甲醇为唯一碳源，pPICZαA是分泌型表达质粒，含有醇氧化酶的强启动子(P
文档编号C12N15/62GK1955278SQ20061002620
公开日2007年5月2日 申请日期2006年4月28日 优先权日2006年4月28日
发明者黄筱颖, 陈宇光 申请人:上海大学