专利名称：盐芥花时相关基因、编码蛋白及其克隆方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种盐芥的花时相关基因ThFLC、编码蛋白及其克隆方法和应用。
背景技术：
生长在华东地区海滩盐土上的本土植物盐芥，可以在超过500mM NaCl的土壤中完成生活史，还能忍受-15℃的低温，是科学家们研究植物抗逆性的宝贵资源。盐芥属十字花科，Thellungiella属，具有作为模式材料的优良特征1.个体小，与模式植物拟南芥相当；2.自花传粉，需要时亦可方便地进行杂交；3.基因组简单(基因组大小约为拟南芥的两倍)；其基因序列与拟南芥基因序列具有很高的同源性。但美中不足的是，盐芥的生命周期太长，实验室培养条件下，从播种到开花需要10-12个月左右，经过1个月左右的4℃低温处理，即春化处理后，其生活史才能缩短到3-4个月。盐芥过长的生命周期以及对春化作用的强烈依赖，不仅带来操作上的不便，而且大大减慢了遗传分析的进程。这是盐芥作为模式研究材料的一大缺陷。
发明内容
本发明的目的之一在于提供盐芥的花时相关基因ThFLC。
本发明的目的之二在于提供盐芥的花时相关基因ThFLC的编码蛋白。
本发明的目的之三在于提供盐芥的花时相关基因ThFLC的克隆方法。
本发明的目的之四在于提供一种在早花型拟南芥中表达盐芥的花时相关基因ThFLC推迟早花型拟南芥的开花时间的方法。
本发明的目的之五在于提供一种抑止盐芥中花时相关基因ThFLC缩短盐芥开花时间的方法。
一定时期的低温处理促进植物开花的现象称为春化作用。自然界中存在一类植物，只有在营养生长阶段经历一段时间低温，才能够在适宜的条件来临时转入生殖发育，启动开花。如果没有经历低温，植物开花时间将大为推迟。春化处理的生理学研究表明植物感受低温春化信号的部位是茎尖。春化处理与植物最终开花之间有一段时间间隔，表明春化作用实际上是使植物处于待命开花的状态而非迅速诱导开花。春化处理后的植物能够“记忆”此前的春化经历；换句话说，春化处理给予了植株开花的指令但植株只有在适宜的条件下才执行指令。一旦低温春化完成，转至适宜的温度条件下(没有诱导信号)，细胞仍可以通过有丝分裂在当代忠实地保持和传递这种“记忆”，但春化效应不能经过减数分裂传递“遗传”到下一代，子代的植物又恢复了对春化作用的要求。从这一层面上，春化作用具有表观遗传的特点(Michaels et al.，2000)。
模式植物拟南芥的FLOWERING LOCUS C(FLC)基因编码一个含MADS域的转录因子，是主要的开花抑制因子，其表达量高低与拟南芥开花早晚呈负相关。春化作用主要通过降低FLCmRNA的水平而提前开花。作为主要的开花抑制基因，FLC的表达还受到多个其它基因的调控。FLC受到自主开花途经的负调控，自主开花途经基因突变体中FLC的表达量升高，突变体表现花期延迟(Michales and Amasino，2001)。春化作用对FLC mRNA表达水平的抑制具有表观遗传的特点低温处理一定时期后，FLC mRNA表达量随处理时间延长逐渐降低，春化处理完成后在温暖的生长条件下，植株内FLC的表达仍保持受抑制状态。对拟南芥而言，春化处理实质上是通过抑制FLC的表达而促进植物花芽分化，到子代，FLC重新恢复高水平的表达。
自然界中的拟南芥大部分为晚花生态型[late-flowering accession；又称冬季型(winter annual)]，少数为早花生态型[early-flowering accession；或称夏季型(summerannual)]。晚花生态型具有长的生命周期，春化处理促进开花。早花生态型无需春化处理即能抽穗开花。晚花表型主要由两个显性位点FRI和FLC协同控制(Lee etal，1994)。FRI和FLC对花时的调控，是协同增效作用，两者缺一不可。FRI通过促进FLC mRNA的高水平表达抑制开花，另一方面，FLC的表达也只有在FRI存在的条件下才能积累到较高水平。春化作用可以解除晚花生态型的晚花表型春化作用对FLC负调控效果强于FRI对FLC的正调控效果，最终降低FLC的表达水平，从而促进冬季生态型开花。FRI或FLC任一位点发生突变都能削弱或克服晚花表型，表现提早开花。自然界中拟南芥的早花生态型即是由于FRI或FLC基因之一(或二者)发生突变(无效等位基因)进化而来。实验室常用的拟南芥生态型，Landsberg erecta(Ler)、Wassilewskija(Ws)和Columnbia(Col)，均属于早花生态型，其fri或flc基因功能缺失或被削弱。生命周期短是研究者们选择这几类生态型开展研究工作的重要原因。
盐芥与拟南芥同属十字花科，对盐芥cDNA文库克隆随机测序结果显示，盐芥中参与光合作用等基础新程代谢的基因与拟南芥对应基因cDNA序列间的同源性达90％以上(Inan et al，2004)。表明盐芥与拟南芥有很近的亲缘关系，推测盐芥存在与拟南芥相似的春化机制。
根据上述机理，本发明采用如下技术方案一种盐芥的花时相关基因ThFLC，其特征在于该基因具有SEQ NO 4所示的碱基序列。
一种根据权利要求1所述的盐芥的花时相关基因ThFLC编码蛋白，其特征在于具有SEQ NO 5所示的氨基酸序列。
一种根据权利要求1所述的盐芥的花时相关基因ThFLC的克隆方法，其特征在于该方法具有如下步骤a.以Arabidopsis FLC(AtFLC)序列为主要参考，避开保守的MADS盒序列设计引物LP15’-CGCTTAGTATCTCCGGCGACTTGAAC-3’，LP25’-GTAGTGGGAGAGTCACCGGAAGATT-3’；b.以盐芥cDNA为模板，用RT-PCR方法扩增出盐芥ThFLC保守的cDNA片段；c.设计3’-接头引物，即5’-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3’，借助3’-RACE的方法，以锚定引物和基因特异性引物LP3，即5’-ATGGGAAGGAAAAAACTAGAAATCAA-3’获得3’末端序列，借助限制性内切酶StuI拼接得到盐芥的花时相关基因ThFLC。
一种在早花型拟南芥中表达盐芥的花时相关基因ThFLC推迟早花型拟南芥的开花时间的方法，其特征在于该方法是首先构建基因表达载体ThFLC-pPZP211质粒，再以传统的Floral dip法转化拟南芥，最后进行转基因植株的筛选，即得到晚花型拟南芥。
一种抑制盐芥中花时相关基因ThFLC缩短盐芥开花时间的方法，其特征在于该方法具体为首先构建基因沉默载体ThFLC-pART27质粒，通过农杆菌介导法，用卡那霉素作为筛选标记筛选转基因植株，即得到早花型盐芥。
综上所述，盐芥有很多符合作为遗传研究模式系统的标准，是一种很好的耐盐模式植物，但是它最大的弱点是生命周期长，自然界中没有天然的早花盐芥，这严重阻碍了科学家耐盐机制的科研进程。拟南芥有早花和晚花两种生态型，这两个生态型的差别在于FLC和FRI这两个关键基因。由于盐芥和拟南芥具有很近的亲缘关系，本发明借鉴拟南芥春化作用途径花时调控分子机制，克隆盐芥中与拟南芥FLC同源基因ThFLC全长cDNA序列；分析春化处理促进盐芥开花与ThFLC表达量的关系；同时用功能补偿方法在模式植物拟南芥中验证了ThFLC功能(抑制开花)；丰富了我们对植物春化作用的认识；更进一步地，通过转录后基因沉默的方法，培育出不依赖于春化处理即能启动生殖发育程序的早花盐芥，加速以盐芥为耐盐模式材料的科研进程。
对ThFLC的基因工程应用可以培育出改变开花时间的其它植物，包括重要的农作物和花卉等。本发明的方法对于培育新型耐盐快速生长的盐芥和农作物具有重要的实用价值和经济效益。另外本发明首次摸索农杆菌floral dip法转化盐芥，并用卡那霉素筛选转基因植株，为盐芥成为植物分子生物学研究新的模式植物奠定了基础。
图1为盐芥经过春化处理前后开花时的莲座叶数目。
图2为盐芥的花时相关基因ThFLC在春化处理前后Northern表达分析。
图3为将盐芥的花时相关基因ThFLC导入拟南芥，转基因株的晚花表型。
图4为拟南芥的早花表型。
图5为盐芥的花时相关基因ThFLC基因沉默载体结构示意6为盐芥的转基因株的早花表型。
图7为盐芥的晚花表型。
具体实施例方式实施例一ThFLC全长编码区的克隆与分析从genbank中调出不同物种中与开花有关的FLC基因组序列，cDNA序列，promoter序列，UTR序列，比较发现，它们在不同物种中有很高的同源性，以Arabidopsis FLC(AtFLC)序列为主要参考，避开保守的MADS盒序列设计引物LP1(5’-CGCTTAGTATCTCCGGCGACTTGAAC-3’)LP2(5’-GTAGTGGGAGAGTCACCGGAAGATT-3’)以盐芥cDNA为模板，用RT-PCR方法扩增出盐芥ThFLC保守的cDNA片段，测序结果表明该片段与AtFLC相应序列有90％的同源性，说明该cDNA片段是盐芥中FLC同源基因片段；由于该片段中已经包含了启始子ATG和部分5’-UTR序列，所以设计3’-接头引物(5’-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3’)，借助3’-RACE的方法，以锚定引物和基因特异性引物LP3(5’-ATGGGAAGGAAAAAACTAGAAATCAA-3’)获得3’末端序列。借助限制性内切酶StuI拼接得到ThFLC全长编码区，测序鉴定结果表明，cDNA全长是724bp，其中ORF是594bp，在71nt处有ATG，662nt是终止子TAG，Vector NTI8.0软件的分析结果显示，最长读码框编码了一个含197个氨基酸的蛋白，蛋白分子量大小为21.98kDa，等电点为7.15的碱性蛋白，命名为ThFLC。
利用BLAST程序对ThFLC预测得到的氨基酸序列分析发现，它与拟南芥FLC有高度同源性，其中核苷酸序列的同源性达到90.6％，氨基酸序列的同源性达到89.4％，并且与蓝型油菜FLC序列也有很高的同源性，并且都有高度保守的MADS盒，这些说明花时基因FLC在春化依赖型的植物中是高度保守的，它在这些物种中可能有着相似的功能。
实施例二春化处理抑制ThFLC的表达为了研究春化处理与盐芥开花时间及ThFLC表达量的关系，本发明做了以下验证。
在长日照条件下，未经春化处理的盐芥等到长出大约400片莲座叶才抽苔启动开花，整个生命周期大约需要10个月时间，而经过6周(5℃±1℃)的春化处理，大大地缩短了开花时间，莲座叶大大减少(图1)，只需要大约3个月时间就可以完成整个生活史，说明春化处理大大促进了盐芥开花。
为了进一步说明春化促进盐芥开花与ThFLC表达水平的关系，把7周盐芥幼苗放到4℃冷库冷处理6周，然后收集材料提取RNA(同时提取对照组RNA)，用1.2％含甲醛的变性琼脂糖凝胶电泳分离40μg总RNA，在碱性条件下转移到带正电荷的尼龙膜上，实验以ThFLC基因片段为探针，做Northern杂交发现，与野生型相比，春化处理后ThFLC表达量明显下降(图2)。这些结果表明，春化抑制盐芥晚花表型与ThFLC表达下降是一致的，说明盐芥中存在着与春化处理促进拟南芥开花相似的分子机制。
实施例三ThFLC在模式植物拟南芥中的功能补偿(一)用于拟南芥功能补偿的表达载体的构建借助引物引入法，在靶基因ThFLC的5’及3’端加上限制性内切酶NcoI和XbaI酶切位点，引物如下(1)ThFLC(+)(加入NcoI酶切位点)5’-CATG GAAGGAAAAAACTAGAAATC-3’边框内为NcoI识别位点；
(2)ThFLC(-)(加入XbaI酶切位点)5’-CTAG CTAATTAAGCAGTGGGAGA-3’边框内为XbaI识别位点；用构建好的TA克隆作为模板，以ThFLC(+)/(-)为引物进行PCR扩增得到全长ThFLC，用NcoI/XbaI分别双酶切PCR产物和克隆载体pAVA321，回收目的片段，用T4连接酶连接，对阳性克隆进行酶切和测序鉴定。
然后用BamHI/KpnI分别双酶切上步构建的重组载体和双元穿梭载体pPZP211，将含靶基因的片段插入到双元载体的BamHI/KpnI两个酶点之间，并进行PCR和酶切鉴定。检测后-80℃保存质粒及菌种；(二)传统的Floral dip法转化拟南芥(1)将已经构建好的重组质粒电击转化入农杆菌(GV3101菌株)(2)在准备转化前两天，用牙签挑取单克隆于3ml LB(含相应抗性)培养液中，250rpm，28℃过夜培养(3)将3ml菌液转入50ml含相应抗性的LB培养液中，250rpm，28℃培养至OD值至少为1.0(4)6000rpm，离心10分钟收集细胞，用适量infiltration media重悬沉淀，使转化液终浓度的OD值为0.8(5)用枪头将转化液轻轻滴在植物刚开的花上，10分钟后用清水冲洗(6)将转化的材料放在避光处16小时以保持其湿度(7)隔天再加强转化一次(8)收集干种子，在选择培养基上筛选转化体。
(三)转基因植株的筛选和表型观察种子放于1.5ml EP管中，开口晾干，除去果荚皮等杂质，只留种子。转入目的基因和空载体的拟南芥种子灭菌后种于含50mg/L Kana的1/2MS培养基上，筛选抗性苗。转基因植株长大后观察其表型，与野生型相比，转目的基因的植株出现明显的晚花表型(图3)，而转空载体的抗性苗与野生型一样，属于典型的早花拟南芥(图4)。这些说明ThFLC基因在进化过程中是非常保守的，它能够补偿近亲模式植物拟南芥的早花表型，进一步证明了ThFLC抑制花时的功能。本发明推而广之，ThFLC可以应用于其它十字花科如油菜等其他植物开花机制的探索和作物改良的研究。
实施例四通过基因工程改造，培育早花(短生命周期)盐芥(一)基因沉默载体的构建应用NTI VECTOR软件分析盐芥ThFLC与拟南芥AtFLC的编码区核苷酸序列，选择不含保守区段、长度合适的一段(位于ThFLC全长cDNA的271bp-579bp之间序列，用Primer Premier软件设计两对引物。
(1)ThFLC-KpnI引物(加入KpnI多克隆位点)5′端5’-GG GGTTCACACCATGAGCTA-3’边框内为KpnI识别位点；3′端5’-GG GAGAGTTACCGGAAGATT-3’边框内为KpnI识别位点。
(2)ThFLC-BamHI引物(加入BamHI多克隆位点)5′端5’-CG GGTTCACACCATGAGCTA-3’边框内为BamHI识别位点；3′端5’-CG GAGAGTTACCGGAAGATT-3’边框内为BamHI识别位点。
载体构建具体步骤如下(结构示意图见图5)A、PCR反应以第一对引物进行高保真PCR反应，用PCR产物快速胶回收试剂盒回收PCR产物；B、酶切反应KpnI酶切PCR回收产物，酶切完全后用快速胶回收试剂盒回收酶切产物(K片断)，同时用KpnI酶切pHANNIBAL载体，酶切完全后用SAP去磷酸反应，然后用快速胶回收试剂盒回收酶切产物；C、连接反应取适量的酶切产物，用T4DNA连接酶16℃连接过夜；D、检测连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂LB固体培养基平板(含50mg/L Kan)，37℃培养约16小时，挑单克隆，扩大培养后提质粒，用鉴定引物进行PCR检测，分别用限制性内切酶AlwNI、StyI酶切检测ThFLC插入片段，验证K片断是否正确插入到pHANNIBAL载体上，选取阳性克隆测序；E、第二片断(B片断)的插入以第二对引物、限制性内切酶BamHI重复上述反应；F、将经检测证明该基因的K片断和B片断以正确方向插入到pHANNIBAL载体上的重组子(ThFLC-pHANNIBAL)转化大肠杆菌DH5α，提质粒检测后-80℃保存质粒及菌种；G、基因沉默载体的构建NotI酶切ThFLC-pHANNIBAL和pART27载体，回收酶切产物，进行连接反应。NotI酶切ThFLC-pHANNIBAL产生两个片断，如果K和B片断都已正确插入，大片断长度分别为3579bp，回收该大片断进行连接反应；H、连接产物转化大肠杆菌DH5α，扩大培养(Kana、Spec抗性)，提质粒，进行PCR、酶切检测，回收PCR及酶切产物，测序验证K、B片断是否已正确插入pART27载体中，检测外源片断插入正确无误的质粒分别称为ThFLC-pART27质粒，保存菌种。
(二)转化用农杆菌的准备(1)农杆菌的转化将构建好的ThFLC-pART27质粒导入农杆菌GV3101；(2)检测从转化后的农杆菌GV3101中提取质粒，PCR及酶切检测，验证ThFLC-pART27质粒是否已正确导入农杆菌GV3101，保存检测效果好的菌种，并划板备用；(3)转化用浓杆菌菌液的制备挑取农杆菌GV3101单克隆，50ml液体LB培养基中扩大培养(加相应的抗生素)，28℃，250rpm震荡培养至菌液OD600为0.8左右，倒入大离心管中，3,000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用渗透培养基重悬，最终菌液OD600在0.8～1.0左右，即可用于转化。
(三)Floral dip法转化盐芥临转化前在农杆菌菌液中加入Silwet L-77(300μl/L)。用枪头将菌液滴在盐芥花序上，用保鲜膜封好保持湿度，25℃暗培养过夜后，再移至温室正常培养，视情况可再浸染一次，盐芥转化效率相对较低、耐逆能力较强，可以多浸染一次。每周浸染一次，其间要注意农杆菌对植株的影响(是否引起大量的花败育)，来调整菌液浓度及浸染次数。
(四)卡那霉素筛选转基因植株种子放于1.5ml EP管中，开口晾干，除去果荚、皮等杂质，只留种子。转基因盐芥种子灭菌后种于含50mg/L Kana的1/2MS培养基上，筛选抗性苗。盐芥要放在23℃光照培养箱中，两周发芽，一个月后移到23℃培养室。盐芥对卡那霉素的抗性较大，需要在一个月后转一次培养基，以保证营养的供应，再一个月后就可以得到抗性苗。
(五)转基因植株的表型转基因植株长大后观察其表型，与野生型相比，转目的基因转基因盐芥出现明显的早花表型(图6)，而转空载体抗性转基因盐芥与野生型一样，仍然属于典型的晚花盐芥(图7)。野生型和对照组盐芥均需要大约10个月左右才能完成整个生命周期，而转靶基因盐芥大大缩短了从营养生长到生殖生长的转换，完成整个生活使只需要大约2-3个月时间，这样便利了盐芥遗传学等其他生物学的研究。
序列表<110>上海大学
<120>盐芥花时相关基因ThFLC、编码蛋白及其克隆方法和应用<160>11<210>1<211>26<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>1cgcttagtat ctccggcgac ttgaac26<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>2gtagtgggag agtcaccgga agatt 25<210>3<211>26<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3atgggaagga aaaaactaga aatcaa26
<210>4<211>724<212>DNA<213>盐芥(Thellungiella halophila)<220>
<221>CDS<222>(71)...(664)<400>4gtatctccgg cgacttgaac cgtacctgag gatcaaatta gggcacggag gcctctcgga60gacagaagcc atg gga agg aaa aaa cta gaa atc aag cga att gag aac 109Met Gly Arg Lys Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ile Glu Apn1 5 10aaa agt agc cga caa gtc acc ttc tcc aaa cga cgc aac ggt ctc atc 157Lys Ser Ser Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Apn Gly Leu Ile15 20 25gag aaa gca cgt cag ctt tct gtt ctc tgc gat gca tcc gtc gct ctt 205Glu Lys Ala Arg Gln Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Ser Val Ala Leu30 35 40 45ctc gtt gtc tcc gcc tcc ggc aag ctc tac agc ttc tcc tcc ggc gat 253Leu Val Val Ser Ala Ser Gly Lys Leu Tyr Ser Phe Ser Ser Gly Asp50 55 60aac ctg gtc aag atc ctt gat cga tat gga aaa caa cat gct gat gat 301Apn Leu Val Lys Ile Leu Asp Arg Tyr Gly Lys Gln His Ala Asp Asp65 70 75ctt aag gcc ttg gat ctt cag tca aaa gct ctg agc tat ggt tca cac 349Leu Lys Ala Leu Asp Leu Gln Ser Lys Ala Leu Ser Tyr Gly Ser His80 85 90cat gag cta cta gaa ctt gtg gaa agc cag ctt gtg gac tca agt gtc 397His Glu Leu Leu Glu Leu Val Glu Ser Gln Leu Val Asp Ser Ser Val95 100 105gat aat gcc agt gtc gat tcc ctc gct cag ctg gag gat cac ctt gag 445Asp Apn Ala Ser Val Asp Ser Leu Ala Gln Leu Glu Asp His Leu Glu110 115 120 125act gcc ctc tcc gta act aga gct agg aag aca gaa cta atg ttg aag 493
Thr Ala Leu Ser Val Thr Arg Ala Arg Lys Thr Glu Leu Met Leu Lys130 135 140ctt gtt gat agc ctc aaa gaa aag gag aaa ttg ctg aaa aga gag aac 541Leu Val Asp Ser Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Leu Lys Arg Glu Apn145 150 155cag gtt ttg gct agc cag atg gag aag aat caa cat gtg gga gca gaa 589Gln Val Leu Ala Ser Gln Met Glu Lys Apn Gln His Val Gly Ala Glu160 165 170gct gat aat atg gag atg tcg cct gga caa atc tcc gac agc aat ctt 637Ala Asp Apn Met Glu Met Ser Pro Gly Gln Ile Ser Asp Ser Apn Leu175 180 185ccg gta act ctc cca ctg ctt aat tag ccacctttaa ccggcggtta684Pro Val Thr Leu Pro Leu Leu Apn190 195aaccatcgta aacatgtatt tcaaaaaaat gaaaaaaaaa 724<210>5<211>197<212>PRT<213>盐芥(Thellungiella halophila)<400>5Met Gly Arg Lys Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ile Glu Apn Lys Ser Ser1 5 10 15Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Apn Gly Leu Ile Glu Lys Ala20 25 30Arg Gln Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Ser Val Ala Leu Leu Val Val35 40 45Ser Ala Ser Gly Lys Leu Tyr Ser Phe Ser Ser Gly Asp Apn Leu Val50 55 60Lys Ile Leu Asp Arg Tyr Gly Lys Gln His Ala Asp Asp Leu Lys Ala65 70 75 80Leu Asp Leu Gln Ser Lys Ala Leu Ser Tyr Gly Ser His His Glu Leu
85 90 95Leu Glu Leu Val Glu Ser Gln Leu Val Asp Ser Ser Val Asp Apn Ala100 105 110Ser Val Asp Ser Leu Ala Gln Leu Glu Asp His Leu Glu Thr Ala Leu115 120 125Ser Val Thr Arg Ala Arg Lys Thr Glu Leu Met Leu Lys Leu Val Asp130 135 140Ser Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Leu Lys Arg Glu Apn Gln Val Leu145 150 155 160Ala Ser Gln Met Glu Lys Apn Gln His Val Gly Ala Glu Ala Asp Apn165 170 175Met Glu Met Ser Pro Gly Gln Ile Ser Asp Ser Apn Leu Pro Val Thr180 185 190Leu Pro Leu Leu Apn195<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>6catgccatgg gaaggaaaaa actagaaatc 30<210>7<211>29<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物
<400>7ctagtctaga ctaattaagc agtgggaga 29<210>8<211>26<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>8ggggtaccgg ttcacaccat gagcta 26<210>9<211>26<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>9ggggtaccga gagttaccgg aagatt 26<210>10<211>26<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>10cgggatccgg ttcacaccat gagcta 26
<210>11<211>26<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>11cgggatccga gagttaccgg aagatt 2权利要求
1.一种盐芥的花时相关基因ThFLC，其特征在于该基因具有SEQ NO 4所示的碱基序列。
2.一种根据权利要求1所述的盐芥的花时相关基因ThFLC编码蛋白，其特征在于具有SEQ NO 5所示的氨基酸序列。
3.一种根据权利要求1所述的盐芥的花时相关基因ThFLC的克隆方法，其特征在于该方法具有如下步骤a.以Arabidopsis FLC序列为主要参考，避开保守的MADS盒序列设计引物LP1 5’-CGCTTAGTATCTCCGGCGACTTGAAC-3’，LP2 5’-GTAGTGGGAGAGTCACCGGAAGATT-3’；b.以盐芥cDNA为模板，用RT-PCR方法扩增出盐芥ThFLC保守的cDNA片段；c.设计3’-接头引物，即5’-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3’，借助3’-RACE的方法，以锚定引物和基因特异性引物LP3，即5’-ATGGGAAGGAAAAAACTAGAAATCAA-3’获得3’末端序列，借助限制性内切酶StuI拼接得到盐芥的花时相关基因ThFLC。
4.一种在早花型拟南芥中表达盐芥的花时相关基因ThFLC推迟早花型拟南芥的开花时间的方法，其特征在于该方法是首先构建基因表达载体ThFLC-pPZP211质粒，再以传统的Floral dip法转化拟南芥，用卡那霉素作为筛选标记筛选转基因植株，最后进行转基因植株的筛选，即得到晚花型拟南芥。
5.一种抑止盐芥中花时相关基因ThFLC缩短盐芥开花时间的方法，其特征在于该方法具体为首先借鉴转录后基因沉默技术，构建植物高效沉默载体ThFLC-pART27质粒，通过农杆菌介导法转化盐芥，用卡那霉素作为筛选标记筛选转基因植株，即得到早花型盐芥。
全文摘要
本发明涉及一种盐芥花时相关基因ThFLC、编码蛋白及其克隆方法和应用。本发明借鉴拟南芥春化作用途径花时调控分子机制，克隆盐芥中与拟南芥FLC同源基因ThFLC全长cDNA序列；分析春化处理促进盐芥开花与ThFLC表达量的关系；同时用功能补偿方法在模式植物拟南芥中验证了ThFLC功能(抑制开花)；丰富了我们对植物春化作用的认识；更进一步地，通过转录后基因沉默的方法，培育出不依赖于春化处理即能启动生殖发育程序的早花盐芥，加速以盐芥为耐盐模式材料的科研进程。
文档编号C12N15/65GK1958795SQ200610026208
公开日2007年5月9日 申请日期2006年4月28日 优先权日2006年4月28日
发明者宋任涛, 许政暟, 李杉, 方巧云 申请人:上海大学