用于协同放化疗和肝癌CT成像的多功能纳米粒子的制作方法

本发明属于纳米材料领域，具体涉及一种用于协同放化疗和ct成像的多功能纳米粒子。

背景技术：

肝癌(hcc)已经成为全球最常见的恶性肿瘤之一，其特征是难预测、死亡率高。虽然手术切除被认为是长期控制疾病的最佳选择，但大多数晚期hcc患者不符合手术切除肿瘤标准，无法采用手术切除治疗肝癌。而其他治疗癌症的方法，如化疗、外放疗、射频消融，则存在治疗效果单一有限的缺陷。因此，迫切需要多模式治疗来改善治疗效果并延长不适宜手术的肝癌患者生命。最近，肿瘤化疗和放疗手段的持续发展，大量研究精力集中于针对不适宜手术的肝癌患者的放疗和化疗的协同治疗，并取得了突破性进展。然而，化学抗性和非选择性的细胞毒性导致了治疗功效差和严重的副作用，而放射抗性和照射剂量的限制导致不能排除肝癌的缺氧灶。此外，这种协同治疗仍然不能令人满意，因为放射治疗和抗癌药物在同一肝癌区域不会同时发生。因此，非常需要使用有效的放射增敏剂来增强对放射疗法的反应，从而探索靶向策略以发挥最大的协同放化疗作用同时具有最小的副作用。

鉴于纳米技术在生物医学中的整合，纳米平台的出现已经能使诊疗一体化介质优先递送到肿瘤病灶的同时降低全身毒性。在各种无机纳米载体中，金纳米粒子由于其在生物医学中的突出特性和潜在应用而引起了广泛的研究兴趣。除了可调的表面等离子体共振光热疗法之外，金纳米粒子也因其高辐射吸收而成为有效的放射增敏剂。大量的临床前研究丰富了我们对金纳米粒子放射增敏作用的理解。籍其化学和生物效应，如肿瘤积聚和活性氧簇生成，从而使健康组织的损伤最小化并提高辐射功效。而纳米粒子介孔二氧化硅具有优异的性能，包括比表面积大，表面容易改性，生物相容性好。因此，现有技术中已经开发了几种纳米材料——将金纳米粒子包封于介孔二氧化硅壳体中，以使金纳米粒子具有协同性质。

如中国专利cn105641696a公开了一种金钆复合纳米材料、制备方法及其用途，其中公开了金钆复合纳米材料包括二氧化硅修饰的金纳米棒的内核，及包覆在内核外侧的含钆的二氧化硅层。其中金纳米棒制备分为两步，第一步制备金纳米颗粒种子溶液，使用十六烷基三甲基溴化铵水溶液、氯金酸水溶液和硼氢化钠水溶液，混合后搅拌3min，置于27℃恒温反应2-5h，第二步制备金纳米棒，使用十六烷基三甲基溴化铵水溶液、氯金酸水溶液、硝酸银水溶液、硫酸水溶液、抗坏血酸水溶液以及第一步得到的金纳米颗粒种子溶液，混合后置于30℃恒温反应12h，得到金纳米棒溶液。二氧化硅包被金纳米棒制备方法为使用氢氧化钠调节ph值为10，之后每隔30min加入正硅酸乙酯甲醇溶液，在磁力搅拌下于26℃反应24h。得到的二氧化硅修饰的金纳米棒，二氧化硅为介孔二氧化硅，厚度为25nm，介孔二氧化硅的孔径为3-4nm。上述方法制备得到的金钆复合纳米材料是将金纳米棒包封于介孔二氧化硅壳体中，以使金纳米粒子具有协同性质，但是由于上述的复合材料为对称结构，使得复合材料的抗癌药物负载表面积有限，且由于金纳米棒被包封在介孔二氧化硅壳体中，使得金纳米棒的放射吸收效率降低，从而削弱了金纳米棒的放化疗的协同作用。

技术实现要素：

因此，本发明要解决的技术问题是现有技术中金核介孔二氧化硅的复合材料负载药物表面积有限且放射吸收效率低的问题，进而提供一种药物负载表面积大且放射吸收效率高的用于协同放化疗和ct成像的多功能纳米粒子。

为此，本发明提供了一种多功能纳米粒子，包括二氧化硅纳米粒子以及修饰在所述二氧化硅纳米粒子表面的金纳米棒，所述金纳米棒在分布上是各向异性的。

所述的多功能纳米粒子，所述金纳米棒的粒径为10nm～80nm，长径比为1:1～1:7。

所述的多功能纳米粒子，所述二氧化硅棒的长度为70～450nm，所述介孔的孔径为1～5nm。

所述的多功能纳米粒子的比表面积为800～1200m²/g，累积孔体积不小于0.5cm³/g。

所述的多功能纳米粒子，所述多功能纳米粒子表面修饰有羧基。

所述的多功能纳米粒子，所述多功能纳米粒子表面担载有至少一种带正电荷的药物。

所述的多功能纳米粒子，所述带正电荷药物为盐酸阿霉素。

所述的多功能纳米粒子，所述多功能纳米粒子表面偶联有叶酸。

本发明提供了一种所述的多功能纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

取金纳米棒分散在水中，加弱碱性溶液，搅拌，加入含正硅酸乙酯体积浓度为18-22％的正硅酸乙酯的甲醇溶液，于18-20℃反应24-48小时，即得。

优选的，所述的制备方法，还包括制备金纳米棒的步骤，包括如下步骤：s1制备金纳米棒

s11：将氯金酸溶液、硼氢化钠溶液和水加入到十六烷基三甲基溴化铵溶液中配置成溶液a，反应1-3小时；

s12：将十六烷基三甲基溴化铵溶液、氯金酸溶液、硝酸银溶液和抗坏血酸溶液混合配置成溶液b；

s13：将溶液a与溶液b快速混合28-32℃恒温反应4-8h；

s14：将s13步骤得到的反应溶液离心、水洗，得到纯化的金纳米棒；

优选的，在s11步骤中，所述氯金酸溶液、水、硼氢化钠溶液和十六烷基三甲基溴化铵溶液的体积比为1:3-5:2-3:25-35。优选的为，所述体积比为1:4:2.4:30。优选的，上述的氯金酸溶液浓度为0.0005-0.005mol/l，所述硼氢化钠溶液浓度为0.005-0.05mol/l，所述十六烷基三甲基溴化铵溶液浓度为0.05-0.5mol/l。优选的，上述的氯金酸溶液浓度为0.001mol/l，所述硼氢化钠溶液浓度为0.01mol/l，所述十六烷基三甲基溴化铵溶液浓度为0.1mol/l。

优选的，在s12步骤中，所述十六烷基三甲基溴化铵溶液、氯金酸溶液、硝酸银溶液和抗坏血酸溶液的体积比为150-200:8-10:1-2:1。优选的为，所述体积比为181.81:9.09:1.81:1。优选的，上述十六烷基三甲基溴化铵溶液的浓度为0.05-0.5mol/l，氯金酸溶液浓度为0.0005-0.005mol/l，硝酸银溶液浓度为0.005-0.05mol/l，抗坏血酸溶液浓度为0.05-0.15mol/l。优选的为，上述十六烷基三甲基溴化铵溶液的浓度为0.1mol/l，氯金酸溶液浓度为0.001mol/l，硝酸银溶液浓度为0.01mol/l，抗坏血酸溶液浓度为0.1mol/l。

优选的，在s13步骤中，将溶液a与溶液b快速混合30℃恒温反应6h。

优选的，在s14步骤中将s13步骤得到的反应溶液以6000-10000r/min离心8-12分钟。优选的，以8000r/min离心10分钟。

优选的，所述的制备方法，具体包括如下步骤：

s2制备金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子

s21：将s1步骤制得的金纳米棒均匀分散在0.5-3体积份的水中，加入8-10体积份的十六烷基三甲基溴化铵水溶液，超声30-50min使混合溶液分散均匀，加入0.3-1体积份的碱性溶液调ph值至碱性，80-120r/min磁力搅拌30-40min，加入20-40体积份的含正硅酸乙酯体积浓度为18-22％的醇溶液，30-50℃反应20-40min；所述十六烷基三甲基溴化铵水溶液浓度为3-6mg/ml；优选的，所述十六烷基三甲基溴化铵水溶液浓度为5mg/ml。

s22：将s21步骤得到的产物在醇溶液中离心清洗2-6次。

优选的，所述的制备方法，具体包括如下步骤：

s2制备金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子

s21：将s1步骤制得的全部金纳米棒均匀分散在1体积份的水中，加入9体积份的十六烷基三甲基溴化铵水溶液，超声40min使混合溶液分散均匀，加入0.5体积份的含氨体积浓度为28％的水溶液，调ph值为9-10，100r/min磁力搅拌，加入30体积份的含正硅酸乙酯体积浓度为20％的甲醇溶液，40℃反应30min；所述重量份与体积份的关系为mg/ml；

s22：将s21步骤得到的产物在乙醇溶液中离心清洗3次。

优选的，所述的制备方法还包括以下步骤：

s23：将步骤s22得到的金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子在50-70体积份硝酸铵-乙醇溶液中回流10-14小时以除去十六烷基三甲基溴化铵，经分离、水洗、干燥，即得所述金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子。所述重量份与体积份的关系为mg/ml。

优选的，所述硝酸铵-乙醇溶液中硝酸铵的浓度为8-12mg/ml。优选的，所述硝酸铵-乙醇溶液中硝酸铵的浓度为10mg/ml。

所述的制备方法，将制备得到的多功能纳米粒子进行羧基化，包括如下步骤：

将制备得到的多功能纳米粒子分散于醇溶液中，加入硅烷偶联剂，于103-107℃下回流3-5h，经分离、洗涤、干燥，得到氨基化的多功能纳米粒子；将所述氨基化的多功能纳米粒子加入到含有丁二酸酐的醇溶液中，于室温搅拌，经分离、洗涤，得到羧基化的多功能纳米粒子。

优选的，所述的制备方法，

s3：金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子表面羧基化修饰

s31：将制备得到的多功能纳米粒子0.8-1.2重量份分散于0.8-1.2体积份的乙醇溶液中，加入0.5-1.5体积份的硅烷偶联剂，于103-107℃下回流3-5h，经分离、洗涤、干燥，得到氨基化的多功能纳米粒子；

s32：将所述氨基化的多功能纳米粒子1-2重量份加入到8-12体积份含有丁二酸酐的乙醇溶液中，室温搅拌22-26h，经分离、洗涤，得到羧基化的多功能纳米粒子。所述重量份与体积份的关系为mg/ml。

优选的，s31：将制备得到的多功能纳米粒子1重量份分散于1体积份的乙醇溶液中，加入1体积份的硅烷偶联剂，于105℃下回流4h，经分离、洗涤、干燥，得到氨基化的多功能纳米粒子；

s32：将所述氨基化的多功能纳米粒子1重量份加入到10体积份含有丁二酸酐的醇溶液中，25℃搅拌24h，经分离、洗涤，得到羧基化的多功能纳米粒子。所述重量份与体积份的关系为mg/ml。

优选的，所述硅烷偶联剂为氨基丙基三甲氧基硅烷。优选的，氨基丙基三甲氧基硅烷的体积浓度为95-98％，优选的体积浓度为97％。

优选的，所述含有丁二酸酐的醇溶液中丁二酸酐的浓度为45-55mg/ml。优选的为50mg/ml。

所述的制备方法，将所述羧基化多功能纳米粒子表面偶联叶酸，包括如下步骤：取edc/nhs水溶液加入到羧基化金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子的悬浮液中，超声处理，然后将fa-peg-nh2加入上述混合液中反应，离心除去过量的试剂，洗涤，得到表面偶联有叶酸的金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子。

优选的，s41：取1重量份所述的羧基化金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子加入到1体积份的pbs缓冲液中，加入0.01体积份的edc/nhs水溶液，超声处理20-40分钟；s42：然后将0.1重量份的fa-peg-nh2加入s41步骤中上述混合液中反应，8000-12000rpm离心除去过量的试剂，洗涤，得到表面偶联有叶酸的金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子。所述重量份与体积份的关系为mg/ml。

优选的，edc/nhs水溶液中edc浓度为100mg/ml，nhs浓度为100mg/ml。

所述的制备方法，将所述多功能纳米粒子分散在盐酸阿霉素溶液中，搅拌过夜，收集得到担载盐酸阿霉素的多功能纳米粒子。

优选的，将所述多功能纳米粒子8-12重量份分散在盐酸阿霉素溶液8-12体积份中。优选的，所述盐酸阿霉素溶液的浓度为0.3-0.7mg/ml。

优选的，将所述多功能纳米粒子10重量份分散在盐酸阿霉素溶液10体积份中。优选的，所述盐酸阿霉素溶液的浓度为0.5mg/ml。

优选的，s43:将步骤s42制得的表面偶联有叶酸的金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子分散在盐酸阿霉素溶液中，搅拌过夜，收集得到担载盐酸阿霉素并且表面偶联有叶酸的金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子。

优选的，还包括在步骤s32后进行以下步骤：s5：将步骤s3制得的羧基化金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子分散在盐酸阿霉素溶液中，搅拌过夜，收集得到担载盐酸阿霉素的金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子

本发明提供了一种药物复合物，所述药物复合物包括所述的多功能纳米粒子。

本发明提供了一种利用所述的多功能纳米粒子或所述的药物复合物在放化疗和ct成像中的用途。

优选的，利用所述的多功能纳米粒子或所述的药物复合物在放化疗和肝癌ct成像中的用途。

本发明技术方案具有如下优点：

1.本发明提供的多功能纳米粒子，其载体金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子因其各向异性的多功能性表面，能够为癌症治疗提供多个功能部件。通过设计可以实现肝癌细胞的荧光成像和光热疗法。

2.本发明提供的多功能纳米粒子，其载体金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子具有优异的比表面积、spr和介孔性能。

3本发明提供的多功能纳米粒子，介孔二氧化硅体上叶酸靶向配体的表面缀合有效增强了其对hcc靶向和内化。通过ph敏感接头加入dox至二氧化硅表面，可以在hcc细胞内化后实现受控的ph响应性药物释放行为。更重要的是，化学疗法与放疗相结合，在体外诱导协同抗癌作用，可以显着降低系统毒性。

4.本发明提供的多功能纳米粒子，其载体金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子通过改性溶胶-凝胶法进行制备，简化了实验步骤，制备方法较简便，有利于其工业化生产和应用。

5.本发明提供的多功能纳米粒子，展示了其作为靶向ct显像剂进行hcc诊断的可行性。

6.本发明提供的多功能纳米粒子，其载体金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子可以作为协同放化疗的有效和安全的纳米药物开发。突出显示了具有双重功能的纳米平台对于多方面hcc诊疗的潜力。

附图说明

图1为本发明实施例1中金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子的透射电镜照片；

图2为本发明实验例1中smmc-7721细胞的clsm图像；其中图2a为fa-gsjns，非靶向gsjns或fa-gsjns+fa孵育3小时的smmc-7721细胞的clsm图像；图2b为smmc-7721细胞中12.5μg/mlfitc标记的fa-gsjns内在化的定量分析结果；

图3为本发明实验例1中hl-7702细胞的clsm图像；其中图3a为fa-gsjns或非靶向gsjns孵育3小时的hl-7702细胞的clsm图像；图3b为smmc-7721细胞中12.5μg/mlfitc标记的fa-gsjns内在化的定量分析结果；

图4为本发明实验例2中dox在细胞中的释放效果；

图5为本发明实验例3多功能纳米粒子对smmc-7721细胞和hl-7702细胞的细胞毒性的影响；其中图5a为不同浓度的gsjns，fa-gsjns，游离dox，gsjns-dox和fa-gsjns-dox处理smmc-7721细胞24小时的细胞毒性，图5b为不同浓度的gsjns，fa-gsjns，游离dox，gsjns-dox和fa-gsjns-dox处理hl-7702细胞24小时的细胞毒性，图5c为在无x射线照射或有x射线照射情况下，gsjns，fa-gsjns，游离dox，gsjns-dox和fa-gsjns-dox处理对smmc-7721细胞的影响；图5d为在无x射线照射或有x射线照射情况下，gsjns，fa-gsjns，游离dox，gsjns-dox和fa-gsjns-dox处理对hl-7702细胞的影响；

图6为本发明实验例4中多功能纳米粒子的ct成像和生物分布；其中图6a和图6b表示fa-gsjns-dox在0.05-5mg/ml范围内的ct图像；图6c表示小鼠肿瘤部位在fa-gsjns-dox和gsjns-dox组中的ct信号，基于横截面图像；图6d表示fa-gsjns-dox和gsjns-dox的生物分布；

图7为本发明实验例5中多功能纳米粒子在体内抗癌作用及系统安全性评价结果，其中图7a-c表示多功能纳米粒子处理下肿瘤生长情况；图7d和图7e表示多功能纳米粒子处理下小鼠的体重变化情况；图7f表示磷酸肌酸激酶(ck)水平；

图8为本发明实验例5中多功能纳米粒子处理裸鼠后组织学评估结果。

具体实施方式

以下通过具体实施例来说明本发明的实施方式，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法均采用本技术领域常规技术。

实施例1

本实施例提供一种多功能纳米粒子的制备方法，具体步骤如下：

s1.制备金纳米棒

s11.将0.25ml氯金酸(浓度为0.001mol/l)、1ml超纯水、0.6ml硼氢化钠(浓度为0.01mol/l)溶液一次加入到7.5ml十六烷基三甲基溴化铵(浓度为0.1mol/l)溶液中配置a，25℃保持2小时使其充分反应；

s12.将100ml十六烷基三甲基溴化铵(浓度为0.1mol/l)溶液，5ml氯金酸(浓度为0.001mol/l)溶液、1ml硝酸银(浓度为0.01mol/l)溶液、0.55ml抗坏血酸(浓度为0.1mol/l)溶液混合配置成溶液b；

s13.将溶液a快速加入溶液b中30℃恒温保持反应6小时。

s14.将s13步骤得到的反应溶液8000r/min离心10分钟水洗两次，即得纯化的金纳米棒。

制备得到的金纳米棒的直径为50nm，长径比为1:4。

s2.制备金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子

s21.将s1步骤制得的金纳米棒均匀的分散在1ml水中，加入9ml分散均匀的十六烷基三甲基溴化铵水溶液(浓度为5mg/ml)中，超声40min使混合溶液分散均匀。加入0.5ml氨水(体积浓度为28％)，调节ph为9-10，40℃恒温，100r/min磁力搅拌。之后加入30ml含正硅酸乙酯体积浓度为20％的甲醇溶液，40℃恒温搅拌30min反应终止。

s22.将21步骤得到的产物在乙醇溶液中离心清洗3次。

s23.将步骤s22得到的金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子在60ml硝酸铵-乙醇溶液(浓度为10mg/ml)中回流12小时以除去十六烷基三甲基溴化铵，将金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子进行分离、水洗、干燥，即得金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子，即gsjns。

如图1所示，利用电镜透射制备得到的金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子，金纳米棒在二氧化硅纳米粒子表面，金纳米棒的分布是各向异性的，制备得到的二氧化硅棒的长度为260nm，所述介孔的孔径为3nm。所述多功能纳米粒子的比表面积为1100m²/g，累积孔体积为0.6cm³/g。

实施例2

本实施例提供一种多功能纳米粒子的制备方法，具体步骤如下：

s1.制备金纳米棒

s11.将0.25ml氯金酸(浓度为0.0005mol/l)、0.75ml超纯水、0.5ml硼氢化钠(浓度为0.005mol/l)溶液一次加入到6.25ml十六烷基三甲基溴化铵(浓度为0.05mol/l)溶液中配置a，25℃保持1小时使其充分反应；

s12.将82.5ml十六烷基三甲基溴化铵(浓度为0.05mol/l)溶液，4.4ml氯金酸(浓度为0.0005mol/l)溶液、0.55ml硝酸银(浓度为0.005mol/l)溶液、0.55ml抗坏血酸(浓度为0.05mol/l)溶液混合配置成溶液b；

s13.将溶液a快速加入溶液b中28℃恒温保持反应4小时。

s14.将s13步骤得到的反应溶液10000r/min离心6分钟，水洗两次，即得纯化的金纳米棒。

制备得到的金纳米棒的直径为10nm，长径比为1:7。

s2.制备金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子

s21.将s1步骤制得的全部金纳米棒均匀的分散在0.5ml水中，加入8ml分散均匀的十六烷基三甲基溴化铵水溶液(浓度为3mg/ml)中，超声40min使混合溶液分散均匀。加入0.3ml氨水(体积浓度为28％)，调节ph为9-10，40℃恒温，100r/min磁力搅拌。之后加入20ml含正硅酸乙酯体积浓度为18％的甲醇溶液，50℃恒温搅拌20min反应终止。

s22.将21步骤得到的产物在乙醇溶液中离心清洗2次。

s23.将步骤s22得到的全部金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子在50ml硝酸铵-乙醇溶液(浓度为8mg/ml)中回流10小时以除去十六烷基三甲基溴化铵，将金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子进行分离、水洗、干燥，即得金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子，即gsjns。

制备得到的金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子，金纳米棒在二氧化硅纳米粒子表面，金纳米棒的分布是各向异性的，二氧化硅棒的长度为70nm，所述介孔的孔径为1nm。所述多功能纳米粒子的比表面积为800m²/g，累积孔体积不小于0.5cm³/g。

实施例3

本实施例提供一种多功能纳米粒子的制备方法，具体步骤如下：

s1.制备金纳米棒

s11.将0.25ml氯金酸(浓度为0.005mol/l)、1.25ml超纯水、0.75ml硼氢化钠(浓度为0.05mol/l)溶液一次加入到8.75ml十六烷基三甲基溴化铵(浓度为0.5mol/l)溶液中配置a，25℃保持2小时使其充分反应；

s12.将110ml十六烷基三甲基溴化铵(浓度为0.5mol/l)溶液，5.5ml氯金酸(浓度为0.005mol/l)溶液、1.1ml硝酸银(浓度为0.05mol/l)溶液、0.55ml抗坏血酸(浓度为0.15mol/l)溶液混合配置成溶液b；

s13.将溶液a快速加入溶液b中32℃恒温保持反应8小时。

s14.将s13步骤得到的反应溶液6000r/min离心12分钟，水洗两次，即得纯化的金纳米棒。

制备得到的金纳米棒的直径为80nm，长径比为1:1。

s2.制备金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子

s21.将s1步骤制得的全部金纳米棒均匀的分散在3ml水中，加入10ml分散均匀的十六烷基三甲基溴化铵水溶液(浓度为6mg/ml)中，超声50min使混合溶液分散均匀。加入1ml氨水(体积浓度为28％)，调节ph为9-10，40℃恒温，100r/min磁力搅拌。之后加入40ml含正硅酸乙酯体积浓度为22％的甲醇溶液，30℃恒温搅拌40min反应终止。

s22.将21步骤得到的产物在乙醇溶液中离心清洗6次。

s23.将步骤s22得到的全部金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子在70ml硝酸铵-乙醇溶液(浓度为12mg/ml)中回流14小时以除去十六烷基三甲基溴化铵，将金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子进行分离、水洗、干燥，即得金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子，即gsjns。

制备得到的金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子，金纳米棒在二氧化硅纳米粒子表面，金纳米棒的分布是各向异性的，制备得到的二氧化硅棒的长度为450nm，所述介孔的孔径为5nm。所述多功能纳米粒子的比表面积为1200m²/g，累积孔体积0.55cm³/g。

实施例4

本实施例提供将制备得到的多功能纳米粒子进行羧基化的方法，具体步骤如下：

s3：金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子表面羧基化修饰

s31：将实施例1中s2步骤制备得到的金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子1mg加入到1ml乙醇中，超声分散后加入硅烷偶联剂氨基丙基三甲氧基硅烷(体积浓度为97％)1ml，反应液105℃温度下回流4h，分离、洗涤、干燥，制备得到氨基化的金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子；

s32将1mg氨基化的金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子加入到10ml丁二酸酐的乙醇溶液(浓度为50mg/ml)，25℃搅拌24h，反应产物经磁性分离、洗涤，制备得羧基化金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子，即gsjns-cooh；

实施例5

本实施例提供将制备得到的多功能纳米粒子进行羧基化的方法，具体步骤如下：

s3：金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子表面羧基化修饰

s31：将实施例2中s2步骤制备得到的金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子0.8mg加入到0.8ml乙醇中，超声分散后加入硅烷偶联剂氨基丙基三甲氧基硅烷(体积浓度为95％)0.5ml，反应液103℃温度下回流3h，分离、洗涤、干燥，制备得到氨基化的金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子；

s32将1mg氨基化的金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子加入到8ml丁二酸酐的乙醇溶液(浓度为45mg/ml)，25℃搅拌22h，反应产物经磁性分离、洗涤，制备得羧基化金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子，即gsjns-cooh；

实施例6

本实施例提供将制备得到的多功能纳米粒子进行羧基化的方法，具体步骤如下：

s3：金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子表面羧基化修饰

s31：将实施例3中s2步骤制备得到的金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子1.2mg加入到1.2ml乙醇中，超声分散后加入硅烷偶联剂氨基丙基三甲氧基硅烷(体积浓度为98％)1.5ml，反应液107℃温度下回流5h，分离、洗涤、干燥，制备得到氨基化的金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子；

s32.将2mg氨基化的金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子加入到12ml丁二酸酐的乙醇溶液(浓度为55mg/ml)，25℃搅拌26h，反应产物经磁性分离、洗涤，制备得羧基化金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子，即gsjns-cooh；

实施例7

本实施例提供一种羧基化多功能纳米粒子表面偶联叶酸的制备方法，具体步骤如下：

s4.金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子表面偶联叶酸

s41.将实施例4中制备得到的1mggsjns-cooh分散在1mlpbs缓冲液中，加入10μledc/nhs水溶液，其中edc浓度为100mg/ml，nhs浓度为100mg/ml，室温活化30分钟；

s42.将100μgfa-peg-nh2(叶酸)加入到s41步骤中的混合悬浮液中再反应12小时。10000rpm离心除去过量的试剂，并用水洗涤三次，得到表面偶联有叶酸的金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子，即fa-gsjns。

实施例8

本实施例提供一种羧基化多功能纳米粒子表面偶联叶酸的制备方法，具体步骤如下：

s4.金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子表面偶联叶酸

s41.将实施例5中制备得到的0.5mggsjns-cooh分散在0.5mlpbs缓冲液中，加入5uledc/nhs水溶液，其中edc浓度为100mg/ml，nhs浓度为100mg/ml，室温活化20分钟；

s42.将50μgfa-peg-nh2(叶酸)加入到s41步骤中的混合悬浮液中再反应10小时。12000rpm离心除去过量的试剂，并用水洗涤三次，得到表面偶联有叶酸的金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子，即fa-gsjns。

实施例9

本实施例提供一种羧基化多功能纳米粒子表面偶联叶酸的制备方法，具体步骤如下：

s4.金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子表面偶联叶酸

s41.将实施例6中制备得到的1.5mggsjns-cooh分散在1.5mlpbs缓冲液中，加入15uledc/nhs水溶液，其中edc浓度为100mg/ml，nhs浓度为100mg/ml，室温活化40分钟；

s42.将150μgfa-peg-nh2(叶酸)加入到s41步骤中的混合悬浮液中再反应14小时。8000rpm离心除去过量的试剂，并用水洗涤三次，得到表面偶联有叶酸的金纳米棒介孔二氧化硅纳米粒子，即fa-gsjns。

实施例10

本实施例提供一种多功能纳米粒子担载盐酸阿霉素的制备方法，具体步骤如下：

s43.将10mg实施例7制备的fa-gsjns分散在10ml盐酸阿霉素溶液(doxorubicin，dox，浓度为0.5mg/ml)中，搅拌过夜后收集含dox的fa-gsjns和上清液，即fa-gsjns-dox。

实施例11

本实施例提供一种多功能纳米粒子担载盐酸阿霉素的制备方法，具体步骤如下：

s43.将8mg实施例8制备的fa-gsjns分散在8ml盐酸阿霉素溶液(doxorubicin，dox，浓度为0.3mg/ml)中，搅拌过夜后收集含dox的fa-gsjns和上清液，即fa-gsjns-dox。

实施例12

本实施例提供一种多功能纳米粒子担载盐酸阿霉素的制备方法，具体步骤如下：

s43.将12mg实施例9制备的fa-gsjns分散在12ml盐酸阿霉素溶液(doxorubicin，dox，浓度为0.7mg/ml)中，搅拌过夜后收集含dox的fa-gsjns和上清液，即fa-gsjns-dox。

实施例13

本实施例提供一种多功能纳米粒子担载盐酸阿霉素的制备方法，具体步骤如下：

s5.将10mg实施例4制备的gsjns-cooh分散在10ml盐酸阿霉素溶液(doxorubicin，dox，浓度为0.5mg/ml)中，搅拌过夜后收集含dox的gsjns和上清液，即gsjns-dox。

实施例14

本实施例提供一种多功能纳米粒子担载盐酸阿霉素的制备方法，具体步骤如下：

s5.将8mg实施例5制备的gsjns-cooh分散在8ml盐酸阿霉素溶液(doxorubicin，dox，浓度为0.3mg/ml)中，搅拌过夜后收集含dox的gsjns和上清液，即gsjns-dox。

实施例15

本实施例提供一种多功能纳米粒子担载盐酸阿霉素的制备方法，具体步骤如下：

s5.将12mg实施例6制备的gsjns-cooh分散在12ml盐酸阿霉素溶液(doxorubicin，dox，浓度为0.7mg/ml)中，搅拌过夜后收集含dox的gsjns和上清液，即gsjns-dox。

实验例

为了考察本发明制备的多功能纳米粒子进行下述实验，下述实验例中的所涉及的材料均为市售产品，如人肝癌细胞系(smmc-7721)、人肝胚胎细胞系(hl-7702)、细胞培养基为rpmi-1640和荧光染料(fitc)均可购买得到。下述实验例中涉及的gsjns，fa-gsjns，gsjns-dox和fa-gsjns-dox均为按照本发明实施例制备得到，具体的，gsjns由实施例1制备得到，fa-gsjns由实施例7制备得到，gsjns-dox由实施例13制备得到，fa-gsjns-dox由实施例10制备得到。

实验例1肝癌靶向评估

选用人肝癌细胞系(smmc-7721)和人肝胚胎细胞系(hl-7702)进行实验。细胞培养基为rpmi-1640，含有10％fbs、1％青霉素和1％链霉素。为了测量fa-gsjns的细胞摄取行为，将荧光染料(fitc)标记的fa-gsjns(12.5μg/ml)与细胞孵育3小时。在fa(叶酸)竞争测定中，将1mm的fa与12.5μg/ml的fa-gsjns共温育细胞3小时。然后，将细胞洗涤三次，用hoechst33258染色5分钟。最后，通过共聚焦激光扫描显微镜(clsm)(olympusfv1000显微镜)观察细胞。为了进一步定量hcc靶向效率，用12.5μg/ml的gsjns，12.5μg/ml的fa-gsjns，12.5μg/ml的fa-gsjns+1mm的fa处理细胞3小时。洗涤细胞，胰蛋白酶消化并重悬浮以用于流式细胞仪检测。

如图2和图3所示，人肝癌细胞系和人肝胚胎细胞系在3小时孵育后都能够吸收fa-gsjns和gsjns。观察到大量fa-gsjns和gsjns在两种细胞系中积累并与lysotracker共同定位。这一观察结果表明，fa-gsjns可能被肝细胞摄取并且内化于酸性溶酶体中以有效释放药物。更重要的是，与非靶向gsjns相比，fa-gsjns表现出更强的smmc-7721细胞的细胞摄取能力，而fa-gsjns和gsjns在hl-7702细胞中表现出相似的细胞摄取行为。在smmc-7721细胞上，在有1mm游离fa时fa-gsjns的强荧光显著减弱，进一步表明fa介导细胞摄取，表明本发明的fa-gsjns对肝癌细胞具有很好的靶向性。

实验例2dox释放

将实施例10中制备得到的fa-gsjns-dox在smmc-7721或hl-7702细胞上孵育3小时，收集细胞，并在20μl裂解缓冲液中裂解。通过hplc检测由温育的每个细胞裂解物样品中各组的裂解物中完全提取的dox，fa-gsjns中dox的药物加载量和加载效率分别为21.8％和61.7％。如图4所示，在24小时内在ph5.5环境下超过40％的dox释放，而在ph7.4的环境下的释放只有5％，说明dox可以通过其胺类基团在酸性条件下的质子化和解离而释放到环境中。因此，这种ph敏感的dox释放现象可能发生在酸性内溶酶体或肝癌细胞的局部环境中，从而增强肿瘤组织的治疗能力，而对正常组织中造成较少的副作用。

实验例3细胞毒性评价

将smmc-7721或hl-7702细胞暴露于各种浓度的gsjns，fa-gsjns，游离dox，gsjns-dox和fa-gsjns-dox中，其中gsjns的浓度分别为25μg/ml，12.5μg/ml，6.25μg/ml，3.125μg/ml和1.5625μg/ml；fa-gsjns的浓度分别为25μg/ml，12.5μg/ml，6.25μg/ml，3.125μg/ml和1.5625μg/ml，游离dox的浓度分别为5μg/ml，2.5μg/ml，1.25μg/ml，0.625μg/ml和0.3125μg/ml，fa-gsjns-dox的浓度分别为25μg/ml，12.5μg/ml，6.25μg/ml，3.125μg/ml和1.5625μg/ml，在无x射线照射和x射线照射分别培养24小时，其中x射线照射以平均剂量率为1gy/min的标准和压扁过滤器的6mv照射束进行辐射，辐射剂量为5gy，照射时间为5分钟。使用之前使用的传统srb测定评估化疗，放疗和协同放化疗效果。使用以下公式计算对照的细胞存活率：a/b×100％，其中a是来自实验细胞的od值，b是来自对照细胞的od值。为了进一步研究fa-gsjns-dox和x射线辐射的协同作用，计算fa-gsjns-dox，x射线和fa-gsjns-dox加x射线组的ic50值。最后，组合指数(ci50)根据先前报道的方程确定。ci50<1.0表示协同作用，ci50＝1.0表示加成效应，ci50>1.0表示拮抗作用。

细胞毒性的检测结果如图5a-d所示，在没有dox的情况下，fa-gsjns和gsjns安全剂量达12.5μg/ml。在smmc-7721细胞中与游离dox相比，gsjns-dox表现出了相似的毒性，fa-gsjns显著改善了dox的抗癌作用。然而，hl-7702细胞比smmc-7721细胞更脆弱，而dox负载的多功能纳米粒子显著降低了损伤。暴露于辐射而不用叶酸或dox进行任何处理的smmc-7721细胞保持高细胞活力。相比之下，用无论有或没有负载dox的多功能纳米粒子(fa-gsjns-dox和gsjns-dox)处理并暴露于辐射的细胞的活力都显著降低。然而，hl-7702细胞中化学放射治疗细胞毒性小于smmc-7721细胞。这些现象与以前报道的其他基于msn的纳米平台化学放射治疗一致。fa-gsjns-dox组和x射线辐射组的ic50值分别为9.38μg/ml和6.47gy，明显高于fa-gsjns-dox+x射线组(3.83μg/ml加1.53gy)。fa-gsjns-dox型放射化疗组合指数(ci)为0.63，进一步证实了本发明的fa-gsjns-dox与x射线辐射的协同作用。因此，本发明的fa-gsjns-dox能够通过靶向和协同放化疗选择性地杀死hcc细胞。

实验例4ct成像和生物分布测量

使用discoveryct590rt扫描仪进行多功能纳米粒子溶液和小鼠的ct扫描。通过imagej软件分析目标区域的hounsfield单位(hu)。为了证明fa-gsjns-dox用于体内ct成像的靶向积累，以50mg/kg的剂量静脉内注射fa-gsjns-dox(5mg/ml)或gsjns-dox(5mg/ml)到smmc-7721肿瘤裸鼠，24h后扫描。为了量化fa-gsjns-dox的生物分布，处死小鼠，然后将肿瘤，心脏，肺，肝脏，脾脏，肾脏取出并称重。使用电感耦合等离子体质谱仪(icp-ms)测量溶液中的金总量，并计算每个器官的内容物并对其进行标准化。

如图6a和图6b所示，随着多功能纳米粒子浓度的增加，观察到的图像更明亮，ct信号的强度增强，hu与多功能纳米粒子浓度之间的关系呈线性相关，r2＝0.9922。如图6c所示，相应的小鼠肿瘤部位在fa-gsjns-dox和gsjns-dox组中均显示出明显的ct信号，基于横截面图像。用fa-gsjns-dox处理的小鼠的肿瘤部位的ct值远高于用gsjns-dox处理的小鼠的ct值。因此，本发明的fa-gsjns-dox可以选择性地累积在肿瘤部位，表明本发明的多功能纳米粒子是用作高效ct成像造影剂的理想候选者。如图6d所示的多功能纳米粒子的生物分布显示了它们在网状内皮系统(res)的肝脏，脾脏和肾脏中的主要积累。与gsjns-dox相比，fa-gsjns-dox具有更高的肿瘤积累能力。

实验例5体内抗癌作用及系统安全性评价

将小鼠(smmc-7721异种移植裸鼠模型)随机分为8组(n＝3)，当肿瘤体积达到60-100mm³的时候分别给予盐水(对照组con)，fa-gsjns，单独放疗(rt)，dox(1mg/kg)，gsjns-dox(5mg/kg)，fa-gsjns-dox(5mg/kg)，gsjns-dox(5mg/kg)+ir和fa-gsjns-dox(5mg/kg)+每3天进行尾静脉注射的ir(放疗)。在ir，gsjns-dox(5mg/kg)+ir和fa-gsjns-dox(5mg/kg)+ir组中，根据组的要求，通过临床线性加速器(turebeam，varianmedicalsystem，paloalto，ca，usa)小鼠接受5gy的x射线辐射。每隔一天用数字卡尺测量每组中的小鼠，并计算公式：length×width2×0.52。在接下来的23天内，处死所有小鼠。然后，收集血清，测定磷酸肌酸激酶(ck)的水平。取出各组三只小鼠的心脏，肺，肝，脾，肾，并固定he染色。

如图7a-f所示，fa-gsjns组中的小鼠显示与对照组con相似的肿瘤生长，表明单独的fa-gsjns具有很小的抗肿瘤作用，而其他6组的肿瘤显示出时间依赖性的体积减少和肿瘤重量减少。其中，与其他组相比，fa-gsjns-dox+ir组显示出最显著的肿瘤生长延迟。fa-gsjns-dox和gsjns-dox组肿瘤生长速度比dox更快，这可能归因于其在皮下异种移植物中的不令人满意的积累。在dox组中，体重和脾脏的器官重量指数大大降低，心脏毒性是临床dox治疗的已知副作用。仅在dox组中观察到增加的磷酸肌酸激酶(ck)水平(图7f)。除了dox诱导的副作用外，其他组小鼠中没有观察到的体重减轻，器官重量指数变化或心脏毒性。如图8所示，组织学评估证实在治疗期间主要器官没有病理损伤，表明fa-gsjns-dox具有优异的生物相容性，并且在肝癌化放疗中副作用较小。因此，fa-gsjns-dox将是hcc靶向化放疗在体内的有效和安全的治疗方式。

上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。