本发明涉及镁合金支架，具体地，涉及一种担载药物/基因纳米粒的镁合金支架及其制备方法。
背景技术：
冠心病即冠状动脉粥样硬化性心脏病，是最常见的心血管疾病，发病急、病死率高。主要症状表现为冠状动脉粥样硬化后产生斑块，造成血管狭窄，斑块破裂后形成急性血栓，并伴随冠状动脉痉挛，进而导致冠状动脉血流急剧减少或中止，最终导致心肌供血不足。经皮冠状动脉支架置入术是目前治疗冠状动脉疾病的重要手段。目前常用的des多为永久性支架，载体材料多为不锈钢、镍钛合金和钴钛合金等，无法在体内降解。表面药物涂层耗尽后，这些永久性支架可能造成长期血管内膜功能失调、血管内皮化过程延迟、致栓塞反应、永久性机械牵拉或损伤、慢性炎症反应、直接置入部分与非支架置入部分血管运动不协调及由此引发的冠脉血管瘤等风险。支架永久存在与无法适应血管生长变化的矛盾也会大大增加日后再行外科血运重建手术的难度。冠脉支架置入术后患者需长期服用双重或三重抗血小板药物，增加了患者的医疗费用和长期双重或三重抗血小板治疗的出血风险。此外，长期内皮修复不完全，会刺激内膜增生导致再狭窄。基于以上永久性des的缺点和可能诱发的远期风险，需对des重新评价和优化，并开发新型完全生物可降解支架。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种担载药物/基因纳米粒的镁合金支架及其制备方法，解决了目前常用的des多为永久性支架，载体材料多为不锈钢、镍钛合金和钴钛合金等，无法在体内降解的问题。同时本发明制备的镁合金支架通过担载药物/基因纳米粒，可以降低支架内再狭窄及血栓形成的发生风险。
为了实现上述目的，本发明提供了一种担载药物/基因纳米粒的镁合金支架的制备方法，所述制备方法包括：
（1）将乙醇和硅烷偶联剂混合，制得偶联剂混合液；
（2）将镁合金试片浸入偶联剂混合液中，得到改性镁合金试片；
（3）将改性镁合金试片浸入依维莫司/壳聚糖溶液中，烘干后得到担载药物纳米颗粒的镁合金支架；或
将改性镁合金试片浸入microrna-130a/壳聚糖溶液中，烘干后得到担载基因纳米颗粒的镁合金支架。
本发明还提供了一种担载药物/基因纳米粒的镁合金支架，所述担载药物/基因纳米粒的镁合金支架由上述的制备方法制得。
通过上述技术方案，本发明提供了一种担载药物/基因纳米粒的镁合金支架的制备方法，所述制备方法包括：将乙醇和硅烷偶联剂混合，制得偶联剂混合液；将镁合金试片浸入偶联剂混合液中，得到改性镁合金试片；将改性镁合金试片浸入依维莫司/壳聚糖溶液中，烘干后得到担载药物纳米颗粒的镁合金支架；或将改性镁合金试片浸入microrna-130a/壳聚糖溶液中，烘干后得到担载基因纳米颗粒的镁合金支架。通过上述方法制得的担载药物纳米颗粒的镁合金支架或担载基因纳米颗粒的镁合金支架可完全生物降解，在治疗血管阻塞的同时，可降低再狭窄，减少晚期血栓、慢性炎症和机械损伤的风险，镁合金支架表面担载有药物或基因纳米粒可以解决裸镁合金金属支架降解速度较快，降解部位不均匀的问题，包被在支架外层的特种药物可长期有效地调节血药浓度，发挥长久抗炎症感染、抗血栓形成、抗有丝分裂等作用，阻止冠脉血管内病态的细胞增殖，包被在支架外层的基因纳米粒可以起到抑制炎症反应的作用。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明提供了一种担载药物/基因纳米粒的镁合金支架的制备方法，所述制备方法包括：
（1）将乙醇和硅烷偶联剂混合，制得偶联剂混合液；
（2）将镁合金试片浸入偶联剂混合液中，得到改性镁合金试片；
（3）将改性镁合金试片浸入依维莫司/壳聚糖溶液中，烘干后得到担载药物纳米颗粒的镁合金支架；或
将改性镁合金试片浸入microrna-130a/壳聚糖溶液中，烘干后得到担载基因纳米颗粒的镁合金支架。
在本发明的一种优选的实施方式中，为了进一步提高制得的镁合金支架生物降解性能和其药物或基因功效，偶联剂混合液的体积分数为4-6%。
在本发明的一种优选的实施方式中，为了进一步提高制得的镁合金支架生物降解性能和其药物或基因功效，步骤（1）中混合的时间为8-12s。
在本发明的一种优选的实施方式中，为了进一步提高制得的镁合金支架生物降解性能和其药物或基因功效，依维莫司/壳聚糖溶液的配制方法为：将0.1mg/ml的依维莫司溶液和1mg/ml的壳聚糖溶液按照体积比为0.8-1.2:10的比例进行混合。
在本发明的一种优选的实施方式中，为了进一步提高制得的镁合金支架生物降解性能和其药物或基因功效，microrna-130a/壳聚糖溶液的配制方法为：将0.1mg/ml的microrna-130a溶液和1mg/ml的壳聚糖溶液按照体积比为0.8-1.2:10的比例进行混合。
在本发明的一种优选的实施方式中，为了进一步提高制得的镁合金支架生物降解性能和其药物或基因功效，将改性镁合金试片浸入依维莫司/壳聚糖溶液中后，以4-6cm/min的恒定速度垂直提拉改性镁合金试片，提拉次数为3-5次。
在本发明的一种优选的实施方式中，为了进一步提高制得的镁合金支架生物降解性能和其药物或基因功效，将改性镁合金试片浸入microrna-130a/壳聚糖溶液中后，以4-6cm/min的恒定速度垂直提拉改性镁合金试片，提拉次数为3-5次。
在本发明的一种优选的实施方式中，为了进一步提高制得的镁合金支架生物降解性能和其药物或基因功效，烘干的条件包括：温度为35-45℃，时间为22-26h。
在本发明的一种优选的实施方式中，为了进一步提高制得的镁合金支架生物降解性能和其药物或基因功效，所述制备方法包括：镁合金试片需利用金相砂纸由800目打磨到2000目，依次用丙酮、无水乙醇除去表面油污，后在去离子水中超声清洗，晾干备用。
本发明还提供了一种担载药物/基因纳米粒的镁合金支架，所述担载药物/基因纳米粒的镁合金支架由上述的制备方法制得。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，以下实施例中，各原料的制备方法如下：
1mg/ml的壳聚糖溶液：将壳聚糖溶于0.1mol/l的醋酸中（壳聚糖规格：脱乙酰度≥95%，粘度100-200mpa.s；采用去rna酶水），磁力搅拌12h，待壳聚糖完全溶解后，用氢氧化钠调节ph至5，将溶液经0.22um的滤膜过滤除去杂质，低温保存。
1mg/ml的依维莫司溶液：将依维莫司溶于无水乙醇中，遮光密封保存，防止乙醇挥发。
0.1mg/ml的依维莫司溶液：以1mg/ml的依维莫司溶液为母液配制0.1mg/ml的依维莫司溶液。
0.1mg/ml的microrna-130a溶液：将microrna-130a冻存粉瞬时离心，溶于去rna酶水中，配制成0.1mg/ml的rna溶液。
实施例1
将乙醇和硅烷偶联剂混合8s，制得偶联剂混合液（体积分数为4%）；将镁合金试片（镁合金试片需利用金相砂纸由800目打磨到2000目，依次用丙酮、无水乙醇除去表面油污，后在去离子水中超声清洗，晾干备用）浸入偶联剂混合液中，得到改性镁合金试片；将改性镁合金试片浸入依维莫司/壳聚糖溶液（将0.1mg/ml的依维莫司溶液和1mg/ml的壳聚糖溶液按照体积比为0.8:10的比例进行混合得到）中，以4cm/min的恒定速度垂直提拉改性镁合金试片，提拉次数为3次，烘干（温度为35℃，时间为22h）后得到担载药物纳米颗粒的镁合金支架；将改性镁合金试片浸入microrna-130a/壳聚糖溶液（将0.1mg/ml的microrna-130a溶液和1mg/ml的壳聚糖溶液按照体积比为0.8:10的比例进行混合得到）中，以4cm/min的恒定速度垂直提拉改性镁合金试片，提拉次数为3次，烘干后得到担载基因纳米颗粒的镁合金支架。
实施例2
将乙醇和硅烷偶联剂混合12s，制得偶联剂混合液（体积分数为6%）；将镁合金试片（镁合金试片需利用金相砂纸由800目打磨到2000目，依次用丙酮、无水乙醇除去表面油污，后在去离子水中超声清洗，晾干备用）浸入偶联剂混合液中，得到改性镁合金试片；将改性镁合金试片浸入依维莫司/壳聚糖溶液（将0.1mg/ml的依维莫司溶液和1mg/ml的壳聚糖溶液按照体积比为1.2:10的比例进行混合得到）中，以6cm/min的恒定速度垂直提拉改性镁合金试片，提拉次数为5次，烘干（温度为45℃，时间为26h）后得到担载药物纳米颗粒的镁合金支架；将改性镁合金试片浸入microrna-130a/壳聚糖溶液（将0.1mg/ml的microrna-130a溶液和1mg/ml的壳聚糖溶液按照体积比为1.2:10的比例进行混合得到）中，以6cm/min的恒定速度垂直提拉改性镁合金试片，提拉次数为5次，烘干后得到担载基因纳米颗粒的镁合金支架。
实施例3
将乙醇和硅烷偶联剂混合10s，制得偶联剂混合液（体积分数为5%）；将镁合金试片（镁合金试片需利用金相砂纸由800目打磨到2000目，依次用丙酮、无水乙醇除去表面油污，后在去离子水中超声清洗，晾干备用）浸入偶联剂混合液中，得到改性镁合金试片；将改性镁合金试片浸入依维莫司/壳聚糖溶液（将0.1mg/ml的依维莫司溶液和1mg/ml的壳聚糖溶液按照体积比为1:10的比例进行混合得到）中，以5cm/min的恒定速度垂直提拉改性镁合金试片，提拉次数为4次，烘干（温度为40℃，时间为24h）后得到担载药物纳米颗粒的镁合金支架；将改性镁合金试片浸入microrna-130a/壳聚糖溶液（将0.1mg/ml的microrna-130a溶液和1mg/ml的壳聚糖溶液按照体积比为1:10的比例进行混合得到）中，以5cm/min的恒定速度垂直提拉改性镁合金试片，提拉次数为3次，烘干后得到担载基因纳米颗粒的镁合金支架。
测试例
cck8检测
取生长状态良好的对数生长期的细胞，每孔按4×103个接种至96孔板中，每组设置6个复孔，置于细胞培养箱中培养，待细胞转染和加药物处理，继续培养48h后，弃含药培养基，每孔加入新鲜配制的含10ｕl的毒性检测液cck8，置于培养箱中继续培养4h后，用酶标仪测波长为450nm的od值。实验重复3次，取实验结果的平均值作为最终实验结果。将microrna-130a的模拟序列、对照序列及对应的表征载基因纳米粒分别加入细胞中，检测对细胞的毒性，经分析，转染模拟序列组（mir-130amimic）与转染模拟序列对照组（mir-130anc）比较，没有统计学差异（p＞0.05）；转染模拟序列与表征载基因纳米粒组（mir-130amimic+nano-particles）与转染模拟序列对照与表征载基因纳米粒组（mir-130anc+nano-particles）比较，没有统计学差异（p＞0.05）；表征载基因纳米粒组（nano-particles）与对照组（control）比较，有统计学差异（p＜0.05）。
细胞周期检测
取生长状态良好的对数生长期的细胞，每孔按4×103个接种至12孔板中，每组设置3个复孔，置于细胞培养箱中培养，待细胞转染和加药物处理，继续培养48h后，pbs洗细胞两次，加70%乙醇固定，用流式检测仪检测细胞周期。将microrna-130a的模拟序列、对照序列及对应的表征载基因纳米粒分别加入细胞中，检测对细胞周期的影响，经分析，各组对细胞周期的差异影响不大，表征载基因纳米粒、表征载基因纳米粒与对照序列、表征载基因纳米粒与模拟序列的加入对g1/s期的有一定的影响，但不显著。
细胞凋亡检测
取生长状态良好的对数生长期的细胞，每孔按4×103个接种至12孔板中，每组设置3个复孔，置于细胞培养箱中培养，待细胞转染和加药物处理，继续培养48h后，pbs洗细胞两次，用annexinv/pi检测试剂盒，用流式检测仪检测细胞凋亡。将microrna-130a的模拟序列、对照序列及对应的表征载基因纳米粒分别加入细胞中，检测对细胞凋亡的影响，经分析，表征载基因纳米粒、表征载基因纳米粒与对照序列、表征载基因纳米粒与模拟序列的加入细胞凋亡数量增加。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。