一种真皮修复支架制备方法与流程

本发明涉及一种真皮修复支架制备方法，属于医用敷料领域。

背景技术：

由创伤、烧伤及难愈性溃疡等导致的全层皮肤缺损在临床上十分常见，如何实现有效的创面修复和功能重建是亟待解决的重大问题之一。真皮修复材料作为诱导真皮再生的模板，为临床深度皮肤缺损的治疗提供了一条较为理想的途径，但以天然生物材料，如胶原等，作为基质的真皮修复材料仍存在原位诱导再生修复能力不足的问题。究其原因，主要为天然材料的支架在体内外力学环境中极易受压变形难以保持本身原有的三维多孔结构，从而使组织、细胞及血管的长入受到限制。因此，如何改善天然生物材料真皮修复材料的机械支撑问题，并在此基础之上对构建的真皮修复材料进行必要的功能化修饰，使其更好地激发创面微环境的生物学响应成为当务之急。

目前，有一些真皮修复支架制备方法是将plga、pga或pla等高分子编织物与胶原基质进行整合，但是plga、pga、pla这类高分子材料对储存环境要求苛刻。常温条件下胶原基质含有的水分会导致产品过早降解，从而影响其货架保存时间，目前这类产品常温条件最多只能保存5个月。如需长期保存需要将其存放于0℃以下的环境中，保存条件苛刻，严重制约了这类产品的应用范围。

有鉴于此，本发明人对此进行研究，专门开发出一种真皮修复支架制备方法，本案由此产生。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种真皮修复支架制备方法，可得到一种货架保存时间长、不易降解、生物相容性好的真皮修复支架。

为了实现上述目的，本发明的解决方案是：

一种真皮修复支架制备方法，包括如下步骤：

网状支撑层制备：采用胶原线编织成网状支撑层；或者，采用胶原膜打孔制成网状支撑层；

多孔海绵层溶液制备：分别配制质量浓度为0.2~2%的胶原溶液和硫酸软骨素溶液，将硫酸软骨素溶液滴加至胶原溶液中，搅拌均匀，得到胶原-硫酸软骨素溶液，其中硫酸软骨素质量占比为1%~50%；

将网状支撑层铺于冻干模具底部，再将胶原-硫酸软骨素溶液倒入模具中，真空冷冻干燥，得到相互结合的网状支撑层和多孔海绵层；

将上述网状支撑层和多孔海绵层放于0.01%~2%的戊二醛、甲醛或碳化二亚胺溶液中交联1~48小时，然后反复清洗5~10遍，再次冻干，得到真皮修复支架。

作为优选，所述真皮修复支架制备方法还包括以下步骤：

将硅凝胶涂于聚氨酯薄膜或硅胶膜上，再将真皮修复支架的多孔海绵层与硅凝胶相粘结，得到贴膜型真皮修复支架。

作为优选，在将网状支撑层放置于冻干模具之前，先在冻干模具底部倒入胶原-硫酸软骨素溶液，冻干后形成多孔海绵层，接着将网状支撑层铺于多孔海绵层上，再将胶原-硫酸软骨素溶液倒入模具中，真空冷冻干燥，得到相互依次结合的多孔海绵层、网状支撑层和多孔海绵层。

作为优选，所述胶原膜制备过程为：将胶原溶液加入戊二醛、甲醛或碳化二亚胺溶液进行交联，25-40℃热风烘干，制成胶原膜。

作为优选，所述胶原膜制备过程为：将胶原溶液先通过25-40℃热风烘干，然后用紫外灯交联，制成胶原膜。

作为优选，制备得到的网状支撑层设有多个网孔。

作为优选，制备得到的多孔海绵层设有多个相互贯通的微孔。

作为优选，所述网状支撑层网孔面积为0.0025~1cm²。

作为优选，所述网孔为圆形、方形、菱形、椭圆形或多边形。

作为优选，所述多孔海绵层微孔孔径为50~400μm。

通过上述真皮修复支架制备方法得到一种真皮修复支架，网状支撑层和多孔海绵层均为胶原蛋白制成，胶原蛋白的耐老化性能优于其他人工合成的可降解高分子材料，因而制得的真皮修复支架货架寿命更长。其次，通过网状支撑层和多孔海绵层叠置，三维结构稳定，力学强度好，便于手术缝合。而且制得的真皮修复支架成分简单，无有毒降解产品，细胞毒性低，生物相容性良好，有利于创面修复。因而，更利于临床上的应用及推广。

以下结合附图及具体实施例对本发明做进一步详细描述。

附图说明

图1为实施例1的真皮修复支架剖面示意图；

图2为实施例1的网状支撑层部分结构示意图；

图3为实施例1的多孔海绵层微观结构图；

图4为实施例2的真皮修复支架剖面示意图；

图5为实施例3的真皮修复支架剖面示意图。

具体实施方式

实施例1

一种真皮修复支架的制备方法，包括如下步骤：

胶原制备：取新鲜牛跟腱，去除筋壳及杂质，清洗干净，使用切片机将牛跟腱切成2~3mm厚的片状，按照固液比1:50的比例，加入0.1mol/l的氢氧化钠溶液，于20~30℃浸泡10小时，过滤，备用；将上述过滤得到的牛跟腱，在流动的纯化水下不断漂洗，使其酸碱度在6~8之间；将上述牛跟腱在粉碎机内充分粉碎；将粉碎的牛跟腱浸入ph为2~3的醋酸酶解液中，其中胃蛋白酶含量为500mg/l，于2~8℃酶解24小时；将上述酶解液放入离心机中，于5000r/min离心10分钟；取上清液，缓缓加入氯化钠粉末，轻轻搅动，收集盐析产物；将上述盐析产物装入透析袋中每3小时换一次水，透析24小时，得到胶原；

网状支撑层1制备：取直径为0.20~0.249mm的鼠尾胶原线，编织成长、宽分别为20cm的网状支撑层1，网孔面积约为0.04cm²，网状支撑层1厚度约为0.4mm。

多孔海绵层溶液制备：将上述胶原配制成浓度为1%的胶原溶液，然后按胶原：硫酸软骨素=99:1的比例在4℃条件下缓缓加入硫酸软骨素粉末，加入过程中维持搅拌，制得胶原-硫酸软骨素液；

将由胶原线编织得到的网状支撑层1浸湿后平铺于20×20cm的冻干模具底部，再倒入胶原-硫酸软骨素液，将溶液高度控制在2~3mm之间，真空冷冻干燥得到相互结合的网状支撑层1和多孔海绵层2；

将上述网状支撑层1和多孔海绵层2浸没于浓度为1%的戊二醛溶液中，于4℃交联12小时，然后在蒸馏水中反复冲洗5次，再次放入冻干机中进行二次冻干；

将上述冻干得到的真皮修复支架粘贴上硅胶膜，然后得到贴膜型真皮修复支架。硅胶膜可以保护创面，防止创面水分蒸发。

通过上述制备方法得到的一种真皮修复支架，如图1-3所示，包括依次设置的网状支撑层1、多孔海绵层2和保护层3，通过网状支撑层1支撑多孔海绵层2。其中，所述网状支撑层1为网格状，设有多个网孔11，所述多孔海绵层2设有多个微孔21，多个微孔21的设置，一方面为细胞生长提供空间，另一方面可使其具有一定的弹性及吸湿性，多孔海绵层2制备材料包括胶原蛋白、硫酸软骨素等活性生物材料。所述保护层3为硅胶膜，覆盖在多孔海绵层2上。

所述网状支撑层1网孔为菱形，横截面积约为0.04cm²，网孔也可以根据不同工艺设为圆形、方形、椭圆形或多边形等。所述多孔海绵层微孔21孔径为50~150μm，所述网状支撑层1的厚度约为0.4mm；所述多孔海绵层2的厚度为1mm。

上述结构的真皮修复支架在临床使用时，先覆盖在人体创口上，通过缝合与创口周围组织相接触。所述网状支撑层1、保护层3与多孔海绵层2相比，具有一定硬度，在缝合时可以促使保护层3和网状支撑层1同时受力支撑，从而保证整个真皮修复支架缝合后结构更加稳定，可以促进新生组织更好的长入到多孔海绵层2中。网状支撑层1由胶原蛋白制成，相比较传统的plga、pga或pla等高分子编织物，胶原蛋白的耐老化性能优于其他人工合成的可降解高分子材料，常温储存条件下货架寿命更长，通常可达3~4年，不易降解；并且其降解产物主要是氨基酸，可被人体吸收，无细胞毒性，具有良好的生物相容性，有利于创面修复。所述多孔海绵层2是由胶原蛋白、硫酸软骨素等活性生物材料制成的，且分布着大量相互贯通的微孔21，这些微孔21提供了细胞生长的空间，胶原蛋白等活性物质则提供了细胞生长的营养物质。

实施例2

一种真皮修复支架的制备方法，包括如下步骤：

胶原制备：取新鲜牛跟腱，去除筋壳及杂质，清洗干净，使用切片机将牛跟腱切成2~3mm厚的片状，按照固液比1:50的比例，加入0.1mol/l的氢氧化钠溶液，于20~30℃浸泡10小时，过滤，备用；将上述过滤得到的牛跟腱，在流动的纯化水下不断漂洗，使其酸碱度在6~8之间；将上述牛跟腱在粉碎机内充分粉碎；将粉碎的牛跟腱浸入ph为2~3的醋酸酶解液中，其中胃蛋白酶含量为500mg/l，于2~8℃酶解24小时；将上述酶解液放入离心机中，于5000r/min离心10分钟；取上清液，缓缓加入氯化钠粉末，轻轻搅动，收集盐析产物；将上述盐析产物装入透析袋中每3小时换一次水，透析24小时，得到胶原；

网状支撑层制备：取直经为0.300~0.349mm的天然鼠尾胶原线，编织成网状支撑层1，其厚度约为0.5mm，网孔面积为0.08cm²；

多孔海绵层溶液制备：将上述胶原配制成浓度为0.2%的胶原溶液，然后按胶原：硫酸软骨素=10:1的比例在4℃条件下缓缓加入硫酸软骨素粉末，加入过程中维持搅拌，制得胶原-硫酸软骨素液；

将由胶原线编织得到的网状支撑层1浸湿后平铺于20×20cm的模具底部，再倒入胶原-硫酸软骨素液，将溶液高度控制在2~3mm之间，冷冻干燥得到网状支撑层1和多孔海绵层2；

将上述网状支撑层1和多孔海绵层2浸没于浓度为0.01%的碳化二亚胺溶液中，于4℃交联48小时，然后在蒸馏水中反复冲洗7次，再次放入冻干机中进行二次冻干；

将上述冻干得到的真皮修复支架进行适当的裁切，得到不贴膜型真皮修复支架。

通过上述制备方法得到的一种真皮修复支架，如图4所示，包括叠置的网状支撑层1和多孔海绵层2，所述网状支撑1层位于多孔海绵层2底部。所述网状支撑层1为网格状，设有多个网孔，所述多孔海绵层2设有多个微孔，多个微孔的设置，一方面为细胞生长提供空间，另一方面可使其具有一定的弹性及吸湿性，多孔海绵层2制备主材料为胶原蛋白。

所述网状支撑层1网孔为方形，面积约为0.08cm²，网孔也可以是圆形、菱形、椭圆形或多边形等。所述多孔海绵层微孔孔径约为150~250μm，所述网状支撑层1的厚度为0.5mm；所述多孔海绵层2的厚度为5mm。

实施例3

一种真皮修复支架的制备方法，包括如下步骤：

胶原制备：取新鲜牛跟腱，去除筋壳及杂质，清洗干净，使用切片机将牛跟腱切成2~3mm厚的片状。按照固液比1:50的比例，加入0.1mol/l的氢氧化钠溶液，于20~30℃浸泡10小时，过滤，备用；将上述过滤得到的牛跟腱，在流动的纯化水下不断漂洗，使其酸碱度在6~8之间；将上述牛跟腱在粉碎机内充分粉碎；将上述粉碎的牛跟腱浸入ph为2~3的醋酸酶解液中，其中胃蛋白酶含量为500mg/l，于2~8℃酶解24小时；将上述酶解液放入离心机中，于5000r/min离心10分钟；取上清液，缓缓加入氯化钠粉末，轻轻搅动，收集盐析产物；将上述盐析产物装入透析袋中每3小时换一次水，透析24小时，得到胶原；

网状支撑层制备：配制浓度为1%的胶原溶液，在4℃条件下混合均匀。将该溶液倒入底面平整的不锈钢模具中，高度在3mm左右，于30℃条件下热风烘干，再用紫外灯交联4小时。取出胶原膜，使用冲孔设备，在胶原膜上进行冲孔，孔径为2mm，孔间距为4mm，得到网状支撑层1；

多孔海绵层溶液制备：将上述胶原配制成浓度为2%的胶原溶液，然后按胶原：硫酸软骨素=2:1的比例在4℃条件下缓缓加入硫酸软骨素粉末，得到胶原-硫酸软骨素溶液；

将上述胶原-硫酸软骨素溶液浇注于冻干模具中，浇注的高度大约为1mm。将该模具放入-40℃冻结4小时；

将网状支撑层1平铺于上述冻结的胶原-硫酸软骨素溶液上，再立即浇注上胶原-硫酸软骨素溶液，放入-40℃进行二次冻结；

将冻干机板层温度预冷至-20℃，将上述冻干模具放入冻干机进行冻干，得到多孔海绵层2、网状支撑层1、多孔海绵层2三层结构的真皮修复支架；双层多孔海绵层的设置，可以使多孔海绵层和网状支撑层结合更紧密，避免在某些情况下网状支撑层与多孔海绵层分离；

将上述真皮修复支架浸没于浓度为2%的甲醛溶液中，于4℃交联24小时，然后在纯化水中反复漂洗10次，然后再将产品放入冻干机中进行二次冻干；

将上述冻干得到的真皮修复支架通过硅凝胶粘贴上聚氨酯膜，既得贴膜型真皮修复支架。

通过上述方法得到的一种真皮修复支架，如图5所示，包括依次设置的多孔海绵层2、网状支撑层1、多孔海绵层2和保护层3，所述网状支撑层1为网格状，设有多个网孔；所述多孔海绵层2设有多个微孔21，多个微孔21的设置，一方面为细胞生长提供空间，另一方面可使其具有一定的弹性及吸湿性，多孔海绵层2制备主材料为胶原蛋白。所述保护层3覆盖在其中一个多孔海绵层2上，保护层3为聚氨酯膜。

所述网状支撑层1网孔孔径为2mm，网孔为圆形。所述多孔海绵层微孔孔径为200~400μm，所述网状支撑层1的厚度约为300μm；所述多孔海绵层2的厚度为3mm。

上述实施例和图式并非限定本发明的产品形态和式样，任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化或修饰，皆应视为不脱离本发明的专利范畴。