本发明属于组织工程
技术领域：
，特别涉及一种用于组织移植的脂肪组织及其制备方法。
背景技术：
：组织移植是将自体组织或人工材料等移植到身体的某一部位，以恢复由于先天性或后天性因素引起的畸形或组织缺损的一种技术。目前常见的组织移植包括皮肤移植、脂肪组织移植、骨组织移植等，其中脂肪组织移植对于乳腺癌患者来说，除治疗作用外还具有重要的美观作用。传统的解决方案是自体组织移植，虽然可以取得满意疗效，但它是以牺牲自体健康组织为代价，在伤害原有健康组织的同时会导致很多并发症及附加损伤。因此目前人工生物材料的填入成为热门的备选方案。人工生物材料是通过将组织细胞接种到人工材料载体上进行体外培养得到的培养物，具有生理活性好、采集组织细胞数量少、针对性和灵活性强等优点，并且如果采用患者自体组织细胞进行培养，还可以将移植后的排异反应降到最低，从而大大提高移植的安全性、降低患者的负担。而提高脂肪组织培养的速率和移植后的存活率，也是提高脂肪组织移植成功率的重要因素。技术实现要素：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于组织移植的脂肪组织及其制备方法。本发明具体技术方案如下：本发明一方面提供了一种用于组织移植的脂肪组织，包括生物支架、脂肪细胞以及细胞生长促进物质，所述脂肪细胞由种子细胞接种到所述生物支架中培养得到，所述种子细胞为间充质干细胞；所述生物支架包括ⅰ型胶原、硫酸软骨素、壳聚糖、氨基葡聚糖、聚乳酸、聚原酸酯、聚ε-己内酯以及聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的至少一种；生物支架应具有良好的生物降解性和吸收性、良好的生物兼容性、高孔隙率和适中的孔形态、与植入部位组织力学性能强匹配的结构强度等特性，上述材料均能满足上述特性，并且无毒害作用、安全性好，适宜应用到生物支架当中；所述细胞生长促进物质包括牛油果树果脂、积雪草苷、水解豌豆蛋白、肌酸、尿囊素以及海藻糖中的至少一种；上述物质均能促进细胞代谢、提高细胞的增值率，从而显著促进组织生长和伤口愈合。进一步地，每克所述生物支架中接种所述种子细胞的个数为106～107个。进一步地，所述生物支架包括重量份数比为1:1～4的聚原酸酯以及聚乳酸-羟基乙酸共聚物。聚原酸酯是多元原酸或多元原酸酯与多元醇类经在无水条件下缩合形成原酸酯键得到的产物，不溶于水，在水溶液中也不发生溶胀，可以从表面逐层降解，而不会碎裂成小块；聚乳酸-羟基乙酸共聚物由乳酸和羟基乙酸随机聚合而成，具有良好的生物相容性和生物降解性，无毒，并具有良好的成囊和成膜的性能；使用上述配比的原料制成的生物支架性能良好，能够满足使用需要。进一步地，所述细胞生长促进物质包括重量份数比为5:2～4:1～3的积雪草苷、肌酸以及尿囊素。积雪草苷可以加速细胞代谢和分裂、促进组织生长和伤口愈合；肌酸可以为细胞代谢快速提供能量、促进细胞生长和更新；尿囊素可以促进细胞生长、软化角质蛋白，从而加快组织更新和伤口愈合；使用上述配比的原料作为细胞生长促进物质，可以促进脂肪组织的更新，从而提高脂肪组织移植入人体后的生长速率。本发明另一方面提供了一种制备上述脂肪组织的方法，包括如下步骤：s1：提取间充质干细胞，原代培养2～3天，并对得到的细胞进行传代培养1～2周；s2：将步骤s1得到的细胞与生物支架按比例混合，添加预先经过超声处理的诱导培养基，轻轻振荡混匀，置于微重力旋转发生器中培养1～2周；s3：对步骤s2得到的培养物低速离心并弃去上清，添加细胞生长促进物质，即得到所述脂肪组织。进一步地，所述步骤s1包括如下步骤：s1.1：提取间充质干细胞，用胶原酶消化30～45min，低速离心并用pbs缓冲液洗涤2次，将得到的细胞接种到10ml原代培养基中，置于5％co2、37℃的培养箱中进行培养；s1.2：当细胞融合度达到80～90％时，收集贴壁细胞，消化后按1000～6000个细胞/cm2的接种量接种到10ml传代培养基中，置于5％co2、37℃的培养箱中进行培养，每3天换液一次，培养至细胞融合度达到80～90％时为止，离心、弃去培养液，并用pbs缓冲液洗涤2～3次。直接从组织提取的间充质干细胞中往往会掺杂少量其他细胞，因此培养时将接种量降低，使掺杂的其他细胞的含量更低，从而抑制其他细胞的增殖、提高获得的间充质干细胞克隆的纯度。进一步地，所述原代培养基为添加有体积分数10～15％的胎牛血清的dmem-f12培养液；所述传代培养基为添加有50～100mg/l的生长因子以及5mg/l的柑浓素的dmem-f12培养液，所述生长因子包括重量份数比为1:1～1.5的ege和bfgf。柑浓素是从柑橘皮中提取的一种天然混合物，具有极强的抗菌的作用，能抑制细菌等的生长增殖，并且无毒副作用、不会对细胞的生长造成影响，也不会使病原微生物产生抗药性。ege又称人寡肽-1，可以促进细胞增值分化、提高细胞更新速率；bfgf是重要的形态发生和分化的诱导因子，具有促进血管生长、促进创伤愈合与组织修复、参与神经再生等作用，并且在体外可以在较低浓度(1mg/ml)下发挥作用；采用上述配比的生长因子，可以有效促进间充质干细胞的分裂和更新，提高培养的速度和质量。进一步地，所述步骤s2包括如下步骤：s2.1：将步骤s1得到的细胞与所述生物支架按106～107个细胞/g生物支架的比例混合；s2.2：配置诱导培养基，并在25℃、40～100hz条件下超声振荡5～10min，超声结束后立即添加5～10ml所述诱导培养基至步骤s2.1得到的混合体系中，轻轻振荡混匀1～3min；所述诱导培养基为添加有10～20mg/l的吲哚美辛、20～50mg/l的维生素c以及10～20mg/l的β-甘油磷酸钠的dmem-f12培养液；通过超声处理，使诱导培养基内部分散成小液滴，从而提高培养基在细胞之间的渗透性；由于超声处理只是暂时改变了液体的物理形态，因此在超声结束后应立即将诱导培养基加入细胞中，以保证其渗透性；s2.3：将步骤s2.2得到的混合体系加入微重力旋转发生器中，静置30～45min，旋转5～10min后再静置30～45min，重复3～4次，以15r/min的转速开始旋转培养1～2周，每2天排空在旋转培养过程中产生的气泡，每3～4天更换一次培养基。进一步地，所述步骤s3中，添加所述细胞生长促进物质的方法如下：将所述细胞生长促进物质按2～8％的比例添加到植物源重组人血清白蛋白中混合均匀，在25℃、40～100hz条件下超声振荡5～10min，超声结束后立即添加2～10ml至步骤s2得到的培养物中，轻轻振荡混匀1～3min。由于超声处理只是暂时改变了液体的物理形态，因此在超声结束后应立即将细胞生长促进物质的溶液加入细胞中，以保证其渗透性；并且加入细胞生长促进物质的溶液后还需进行振荡，以便使溶液进一步渗透到细胞之间。植物源重组人血清白蛋白基于植物生产制造，能够提供与血清相当的营养成分，可以替代胎牛血清，从而在为细胞提供充足营养的同时降低成本。本发明的有益效果如下：本发明提供了一种用于组织移植的脂肪组织及其制备方法，通过将种子细胞接种到生物支架中而成，可以形成空间结构、防止脂肪组织植入体内后发生液化；同时添加细胞生长促进物质，可以促进脂肪组织植入体内后细胞的增殖和更新，从而加快组织更新和伤口愈合；传代培养基中添加细胞生长因子，可以有效促进间充质干细胞的分裂和更新，提高培养的速度和质量；为保证诱导培养基和细胞生长促进物质溶液可以充分渗透到细胞间隙中，事先对其进行超声处理，以便将液体分散成小液滴、提高其渗透性。通过上述手段，可以提高脂肪组织培养的速率和移植后的存活率，从而提高脂肪组织移植的成功率。具体实施方式主要试剂及培养基的配制a.dmem培养基：具体成分如下：序号化合物名称含量(mg/l)序号化合物名称含量(mg/l)1无水氯化钙265.0018l-丝氨酸42.002硝酸铁0.1019l-苏氨酸95.003氯化钾400.0020l-色氨酸16.004无水硫酸镁97.6721l-酪氨酸72.005氯化钠6400.0022l-缬氨酸94.006无水磷酸二氢钠109.0023d-泛酸钙4.007丁二酸75.0024酒石酸胆碱7.208丁二酸钠100.0025叶酸4.009l-盐酸精氨酸84.0026肌醇7.2010l-盐酸胱氨酸63.0027烟酰胺4.0011甘氨酸30.0028核黄素0.4012l-盐酸组氨酸42.0029盐酸硫胺4.0013l-异亮氨酸105.0030盐酸吡哆辛4.0014l-亮氨酸105.0031葡萄糖1000.0015l-盐酸赖氨酸146.0032丙酮酸钠110.0016l-甲硫氨酸30.0033酚红9.30.0017l-苯丙氨酸66.00b.pbs缓冲液：称取8gnacl、0.2gkcl、1.44gna2hpo4和0.24gkh2po4，溶于800ml蒸馏水中，用hcl调节溶液的ph值至7.4，最后加蒸馏水定容至1l即可。在15lbf/in2(1034×105pa)高压下蒸气灭菌(至少20min)，保存于室温或4℃冰箱中。下面结合以下实施例对本发明作进一步详细说明。实施例1一种用于组织移植的脂肪组织，包括生物支架、间充质干细胞以及细胞生长促进物质，每克所述生物支架中接种所述间充质干细胞的个数为106～107个；所述生物支架包括重量份数比为1:1的聚原酸酯以及聚乳酸-羟基乙酸共聚物；所述细胞生长促进物质包括重量份数比为5:4:1的积雪草苷、肌酸以及尿囊素。实施例2一种用于组织移植的脂肪组织，包括生物支架、间充质干细胞以及细胞生长促进物质，每克所述生物支架中接种所述间充质干细胞的个数为106～107个；所述生物支架包括重量份数比为1:5的聚原酸酯以及聚乳酸-羟基乙酸共聚物；所述细胞生长促进物质包括重量份数比为5:2:1的积雪草苷、肌酸以及尿囊素。实施例3一种制备用于组织移植的脂肪组织的方法，包括如下步骤：s1：提取间充质干细胞，原代培养2～3天，并对得到的细胞进行传代培养1～2周；s2：将步骤s1得到的细胞与生物支架按比例混合，添加预先经过超声处理的诱导培养基，轻轻振荡混匀，置于微重力旋转发生器中培养1～2周；s3：对步骤s2得到的培养物低速离心并弃去上清，添加细胞生长促进物质，即得到所述脂肪组织。实施例4一种制备用于组织移植的脂肪组织的方法，包括实施例3所述各步骤，其中步骤s1的具体方法如下：s1.1：提取间充质干细胞，用胶原酶消化30min，低速离心并用pbs缓冲液洗涤2次，将得到的细胞接种到10ml原代培养基中，置于5％co2、37℃的培养箱中进行培养；所述原代培养基为添加有体积分数10％的胎牛血清的dmem-f12培养液s1.2：当细胞融合度达到80～90％时，收集贴壁细胞，消化后按1000～6000个细胞/cm2的接种量接种到10ml传代培养基中，置于5％co2、37℃的培养箱中进行培养，每3天换液一次，培养至细胞融合度达到80～90％时为止，离心、弃去培养液，并用pbs缓冲液洗涤2～3次；所述传代培养基为添加有50mg/l的生长因子以及5mg/l的柑浓素的dmem-f12培养液，所述生长因子包括重量份数比为1:1的ege和bfgf。实施例5一种制备用于组织移植的脂肪组织的方法，包括实施例3所述各步骤，其中步骤s1的具体方法如下：s1.1：提取间充质干细胞，用胶原酶消化45min，低速离心并用pbs缓冲液洗涤2次，将得到的细胞接种到10ml原代培养基中，置于5％co2、37℃的培养箱中进行培养；所述原代培养基为添加有体积分数15％的胎牛血清的dmem-f12培养液s1.2：当细胞融合度达到80～90％时，收集贴壁细胞，消化后按1000～6000个细胞/cm2的接种量接种到10ml传代培养基中，置于5％co2、37℃的培养箱中进行培养，每3天换液一次，培养至细胞融合度达到80～90％时为止，离心、弃去培养液，并用pbs缓冲液洗涤2～3次；所述传代培养基为添加有100mg/l的生长因子以及5mg/l的柑浓素的dmem-f12培养液，所述生长因子包括重量份数比为1:1.5的ege和bfgf。实施例6一种制备用于组织移植的脂肪组织的方法，包括实施例4所述各步骤，其中步骤s2的具体方法如下：s2.1：将步骤s1得到的细胞与所述生物支架按106～107个细胞/g生物支架的比例混合；s2.2：配置诱导培养基，并在25℃、40hz条件下超声振荡10min，超声结束后立即添加10ml所述诱导培养基至步骤s2.1得到的混合体系中，轻轻振荡混匀1min；所述诱导培养基为添加有20mg/l的吲哚美辛、20mg/l的维生素c以及20mg/l的β-甘油磷酸钠的dmem-f12培养液；s2.3：将步骤s2.2得到的混合体系加入微重力旋转发生器中，静置30min，旋转10min后再静置30min，重复3次，以15r/min的转速开始旋转培养1～2周，每2天排空在旋转培养过程中产生的气泡，每3～4天更换一次培养基。实施例7一种制备用于组织移植的脂肪组织的方法，包括实施例5所述各步骤，其中步骤s2的具体方法如下：s2.1：将步骤s1得到的细胞与所述生物支架按106～107个细胞/g生物支架的比例混合；s2.2：配置诱导培养基，并在25℃、100hz条件下超声振荡5min，超声结束后立即添加10ml所述诱导培养基至步骤s2.1得到的混合体系中，轻轻振荡混匀3min；所述诱导培养基为添加有10mg/l的吲哚美辛、50mg/l的维生素c以及10mg/l的β-甘油磷酸钠的dmem-f12培养液；s2.3：将步骤s2.2得到的混合体系加入微重力旋转发生器中，静置45min，旋转5min后再静置45min，重复4次，以15r/min的转速开始旋转培养1～2周，每2天排空在旋转培养过程中产生的气泡，每3～4天更换一次培养基。实施例8一种制备用于组织移植的脂肪组织的方法，包括实施例6所述各步骤，其中步骤s3中添加细胞生长促进物质的方法如下：将细胞生长促进物质按2％的比例添加到植物源重组人血清白蛋白中混合均匀，在25℃、40hz条件下超声振荡10min，超声结束后立即添加10ml至步骤s2得到的培养物中，轻轻振荡混匀1min。实施例9一种制备用于组织移植的脂肪组织的方法，包括实施例7所述各步骤，其中步骤s3中添加细胞生长促进物质的方法如下：将细胞生长促进物质按8％的比例添加到植物源重组人血清白蛋白中混合均匀，在25℃、100hz条件下超声振荡5min，超声结束后立即添加2ml至步骤s2得到的培养物中，轻轻振荡混匀3min。对照例1一种制备用于组织移植的脂肪组织的方法，包括实施例4所述各步骤，其中步骤s2的具体方法如下：s2.1：将步骤s1得到的细胞与所述生物支架按106～107个细胞/g生物支架的比例混合；s2.2：配置诱导培养基，向步骤s2.1得到的混合体系中添加10ml所述诱导培养基，轻轻振荡混匀1min；所述诱导培养基为添加有30mg/l的吲哚美辛以及30mg/l的β-甘油磷酸钠的dmem-f12培养液；s2.3：将步骤s2.2得到的混合体系加入微重力旋转发生器中，静置30min，旋转10min后再静置30min，重复3次，以15r/min的转速开始旋转培养1～2周，每2天排空在旋转培养过程中产生的气泡，每3～4天更换一次培养基。对照例2一种制备用于组织移植的脂肪组织的方法，包括实施例7所述各步骤，其中步骤s3中添加细胞生长促进物质的方法如下：将细胞生长促进物质按1％的比例添加到牛血清白蛋白中混合均匀，取2ml添加至步骤s2得到的培养物中，轻轻振荡混匀3min。实验例1成脂肪分化性能实验分别以实施例4、6、8提供的方法为实验组1～3，以对照例1～2提供的方法分别作为对照组1～2，利用同一来源的间充质干细胞分别制备脂肪组织，制备完成后用油红染色鉴定脂肪滴形成。旋转培养3天后，细胞形态即发生改变，由纺锤形逐渐收缩变短，90％以上细胞成为立方形或多角形；旋转培养1周后，镜下可见细胞内有微小脂肪滴出现，并且脂肪滴随着培养时间的延长逐渐扩大、融合；培养2周后，可见融合成团的脂肪滴充满整个细胞。油红染色可见细胞内产生的脂肪被特异性染成红色。表明采用本发明提供的制备方法可以有效促进间充质干细胞的成脂分化。实验例2脂肪组织移植实验分别以实施例5、7、9提供的方法为实验组1～3，以对照例1～2提供的方法分别作为对照组1～2，利用同一来源的间充质干细胞分别制备脂肪组织，并分别注射移植至大鼠乳头下方，注射平面位于乳腺与胸肌之间，同时将adscs-col凝胶注射入右上侧乳腺作为空白对照，每组注射10例。注射后定期观测大鼠乳腺皮肤情况。8周后，麻醉并解剖大鼠，观测有无新生组织形成、测量新生组织湿重，同时对组织切片进行油红染色。注射后，可见乳腺区域局部隆起。观察期间未见大鼠乳腺出现皮肤明显红肿或感染等炎症表现。解剖后，实验组1～3和对照组1～2均可见乳腺与胸肌之间有脂肪样新生组织形成，实验组注射处脂肪组织平均湿重为(138±23)mg，对照组1～2注射处脂肪组织平均湿重为(94±17)；空白对照照组未见明显新生组织形成，注射处脂肪组织大小平均湿重为(19±7)mg。实验组注射处脂肪组织平均湿重显著高于其他组。油红染色可见细胞内产生的脂肪被特异性染成红色，说明新生组织为成熟脂肪组织。以上结果表明利用本发明提供的制备方法得到的脂肪组织在移植入体内后可以迅速形成新的组织、促进移植受体的组织更新和伤口愈合。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12