本发明属于生物医用材料领域，特别涉及一种复合型脱细胞真皮基质生物敷料。
背景技术：
脱细胞真皮基质敷料就是一种可以用于全层皮肤缺损的真皮替代物以及用于烧伤等皮肤损伤创面愈合的医用敷料，它是天然皮肤经过一系列处理去除了表皮和真皮中的细胞成分，但保留了真皮细胞外基质成分和其三维空间结构，这样的结构可以为皮肤再生提供“真皮模板”，诱导移植后宿主细胞成分如成纤维细胞、内皮细胞等在支架结构中分化、生长。但传统方法制得的脱细胞真皮基质(adm)敷料存在渗透性差、抗菌性能低、生物相容性差等缺点，在烧伤，糖尿病足溃疡、压疮、下肢静脉溃疡、不愈性手术切口、外伤、慢性伤口、供皮区等各类伤口的治疗中，存在愈合周期长、易疤痕增生、易感染等缺点，严重影响创面愈合效果。
基于此，有必要提供一种能够兼顾促进创面愈合效果、生物相容性好、刺激性小，且机械性能好的复合型脱细胞真皮基质生物敷料。
技术实现要素：
基于此，本发明的目的在于提供一种复合型脱细胞真皮基质生物敷料，能够兼顾促进创面愈合效果、生物相容性好、刺激性小，且机械性能好的效果。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种复合型脱细胞真皮基质生物敷料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将皮肤样品浸泡于脱脂剂中超声处理脱脂，得脱脂皮肤；所述脱脂剂中包括脂肪醇聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚、十二烷基磺酸钠；
(2)脱细胞：将脱脂皮肤反复冻融后，置于复合酶溶液中孵育过夜，得脱细胞皮肤；
(3)将所述脱细胞皮肤浸渍于羧甲基壳聚糖、透明质酸、羟乙基纤维素、氯化钙和硫酸角质素的混合溶液中；滴加氧化海藻酸钠溶液进行交联，即得。
在其中一些实施例中，所述脱脂剂为：18wt％～22wt％脂肪醇聚氧乙烯醚、13wt％～17wt％壬基酚聚氧乙烯醚和4wt％～6wt％十二烷基磺酸钠的混合液。
在其中一些实施例中，所述脱脂剂中：18wt％～22wt％脂肪醇聚氧乙烯醚、13wt％～17wt％壬基酚聚氧乙烯醚和4wt％～6wt％十二烷基磺酸钠以体积比为1:(1～5):(1～3)混合。
在其中一些实施例中，所述将皮肤样品浸泡于脱脂剂中超声处理脱脂的时间为3～5h。
在其中一些实施例中，步骤(3)所述的混合溶液为：4wt％～6wt％羧甲基壳聚糖、10wt％～20wt％透明质酸、5wt％～10wt％羟乙基纤维素、1wt％～5wt％氯化钙、5wt％～7wt％硫酸角质素，和/或
步骤(3)所述的混合溶液4wt％～6wt％羧甲基壳聚糖、10wt％～20wt％透明质酸、5wt％～10wt％羟乙基纤维素、1wt％～5wt％氯化钙、5wt％～7wt％硫酸角质素按体积比1:(2～8)：(2～5)：(1～5):(3～6)的混合。
在其中一些实施例中，步骤(3)所述的滴加氧化海藻酸钠溶液进行交联为：滴加10wt％～25wt％氧化海藻酸钠进行交联，交联20～60min；和/或
步骤(3)所述的滴加的氧化海藻酸钠溶液与所述混合溶液的体积比为(1～3)：50。
在其中一些实施例中，所述脱脂皮肤反复冻融后，置于复合酶溶液中孵育过夜为：从-80℃到37℃反复冻融2～4次后，置于4℃于复合酶溶液中孵育过夜。
在其中一些实施例中，步骤(2)所述复合酶溶液为：2.5wt％～3.5wt％dispase与0.2wt％～0.3wt％trypsin-edta以体积比1:(2～5)混合得到；和/或步骤(2)所述的复合酶溶液中孵育过夜后，还包括以下步骤：
加入含有血清的dmem培养基终止消化；
将脱细胞样品置于抗生素溶液浸泡4～6分钟，pbs浸泡8～12分钟，重复3～5次。
本发明还提供了一种复合型脱细胞真皮基质生物敷料，具体技术方案如下：
一种复合型脱细胞真皮基质生物敷料，由如上所述的制备方法制备得到。
本发明还提供了复合型脱细胞真皮基质生物敷料的应用，具体技术方案如下：
上述复合型脱细胞真皮基质生物敷料在促进皮肤愈合中的应用。
基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
本发明针对敷料的促进创面愈合效果、生物相容性及机械性能之间难以兼顾的问题，通过采用脂肪醇聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚、十二烷基磺酸钠以合适的比例混合，对皮肤进行脱脂后，采用合适比例的dispase与trypsin-edta复合酶对皮肤进行脱细胞处理后，浸泡于羧甲基壳聚糖、透明质酸、羟乙基纤维素、氯化钙和硫酸角质素混合溶液并以氧化海藻酸钠进行交联反应，基于脱脂率高且保持了原有皮肤胶原的含量的特点，并配合羧甲基壳聚糖、透明质酸、羟乙基纤维素、氯化钙和硫酸角质素的联合协效作用，制备得到的复合型脱细胞真皮基质生物敷料，具有良好的抗菌、促愈合的功效，且该敷料能同时兼具良好的机械性能，易于平铺敷于伤口表面，不易破损，应用效果好。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明提供了一种复合型脱细胞真皮基质生物敷料的制备方法，包括以下步骤：(1)将皮肤样品浸泡于脱脂剂中超声处理脱脂，得脱脂皮肤；所述脱脂剂中包括脂肪醇聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚、十二烷基磺酸钠；(2)脱细胞：将脱脂皮肤反复冻融后，置于复合酶溶液中孵育过夜，得脱细胞皮肤；(3)将所述脱细胞皮肤浸渍于羧甲基壳聚糖、透明质酸、羟乙基纤维素、氯化钙和硫酸角质素的混合溶液中；滴加氧化海藻酸钠溶液进行交联，即得。
优选地，所述脱脂剂为：18wt％～22wt％脂肪醇聚氧乙烯醚、13wt％～17wt％壬基酚聚氧乙烯醚和4wt％～6wt％十二烷基磺酸钠的混合液；更优选的，三者以以体积比为1:(1～5):(1～3)混合。进一步优选地，采用20％脂肪醇聚氧乙烯醚、15％壬基酚聚氧乙烯醚和5％十二烷基磺酸钠以1:3:2的合适的比例混合，在其协同作用下，在制备脱细胞真皮基质过程中，能够实现很好的脱脂效果，并且减少皮肤胶原的损失。
优选地，采用上述脱脂剂进行脱脂处理的时间为3～5h，具体地，将皮肤样品浸泡于脱脂剂中超声处理脱脂的时间为3～5h。
进一步地，步骤(3)所述的混合溶液为：4wt％～6wt％羧甲基壳聚糖、10wt％～20wt％透明质酸、5wt％～10wt％羟乙基纤维素、1wt％～5wt％氯化钙、5wt％～7wt％硫酸角质素的混合溶液；优选地，4wt％～6wt％羧甲基壳聚糖、10wt％～20wt％透明质酸、5wt％～10wt％羟乙基纤维素、1wt％～5wt％氯化钙、5wt％～7wt％硫酸角质素的混合溶液按体积比1:(2～8)：(2～5)：(1～5):(3～6)的混合，优选为1:5:3:3:4。
优选地，步骤(3)所述的滴加氧化海藻酸钠溶液进行交联为：滴加10wt％～25wt％氧化海藻酸钠进行交联，交联20～60min。其中一些实施例中，滴加的氧化海藻酸钠溶液与所述混合溶液的体积比为(1～3)：50。基于脱脂率高且保持了原有皮肤胶原的含量的特点，并配合羧甲基壳聚糖、透明质酸、羟乙基纤维素、氯化钙、硫酸角质素的联合协效作用，制备得到的复合型脱细胞真皮基质生物敷料，具有良好的抗菌、促愈合的功效。
可选地，步骤(2)所述的复合酶溶液中孵育过夜后，还包括以下步骤：加入含有血清的dmem培养基终止消化；将脱细胞样品置于抗生素溶液浸泡4～6分钟，pbs浸泡8～12分钟，重复3～5次。
在其中一些实施例中，所述脱脂皮肤反复冻融后，置于复合酶溶液中孵育过夜为：从-80℃到37℃反复冻融2～4次后，置于4℃于复合酶溶液中孵育过夜。其中，所述复合酶溶液为：2.5wt％～3.5wt％dispase与0.2wt％～0.3wt％trypsin-edta以体积比1:(2～5)混合得到，优选地，所述复合酶溶液为：3wt％dispase与0.25wt％trypsin-edta以体积比1:(2～5)混合得到，更优选地，体积比为1:3。
本发明还提供如上所述的复合型脱细胞真皮基质生物敷料在促进皮肤愈合中的应用。优选地，该敷料可以应用于烧伤皮肤。
下面结合具体实施例对本发明进行更全面的说明：
实施例1
本实施例提供了一种复合型脱细胞真皮基质生物敷料的制备方法，具体步骤如下：
(一)所需试剂的制备
脱脂剂：20wt％脂肪醇聚氧乙烯醚、15wt％壬基酚聚氧乙烯醚、5wt％十二烷基磺酸钠以体积比1:3:2混合，配置50ml的混合溶液。
复合酶：3wt％dispase与0.25wt％trypsin-edta以体积比1:3混合配置10ml的混合溶液。
(二)脱细胞工艺
1)取样：选取猪皮上背脊线两侧的皮样，每块裁剪成5cm×5cm大小，并将毛处理干净。
2)脱脂：将上述样品浸泡于100ml脱脂剂中并超声处理3-5h。
3)脱细胞：采用物理和化学结合的方法即反复冻融和酶试剂相结合的方法，具体为：将步骤2)处理过的样品经pbs冲洗数遍，从-80℃到37℃反复冻融2～4次，这个过程完成后，样品置于4℃在复合酶中过夜孵育。
4)用含有血清的dmem对其进行终止消化，之后用pbs冲洗数次，备用。
5)消毒：将脱细胞的样品置于抗生素溶液浸泡5分钟，pbs浸泡10分钟，此过程重复3-5次。
6)无菌环境进行封闭包装。
7)辐照，常温保存。
(三)复合型生物敷料的制备
1)将5wt％羧甲基壳聚糖、15wt％透明质酸、8wt％羟乙基纤维素、4wt％氯化钙、6wt％硫酸角质素，各溶液以体积比1:5:3:3:4混合配置成50ml的混合溶液；其中，羧甲基壳聚糖溶于1％醋酸中制备得到羧甲基壳聚糖溶液。
2)将上述制备好的脱细胞基质样品，浸渍与1)溶液中，滴加2ml的15wt％氧化海藻酸钠进行交联，交联30min；
3)交联好的样品用pbs冲洗三次，每次15min；
4)冷冻干燥，辐照，保存。
实施例2
本实施例提供了一种复合型脱细胞真皮基质生物敷料的制备方法，与实施例1相比，区别为：(一)所需试剂的制备中，脱脂剂为：20wt％脂肪醇聚氧乙烯醚、15wt％壬基酚聚氧乙烯醚、5wt％十二烷基磺酸钠以体积比1:1:1的混合，配置50ml的混合溶液；复合酶为：3wt％dispase与0.25％trypsin-edta以体积比1:2混合配置10ml的混合溶液；(三)复合型生物敷料的制备中，1)将5wt％羧甲基壳聚糖、10wt％透明质酸、5wt％羟乙基纤维素、1wt％氯化钙、6wt％硫酸角质素溶液以体积比1:2:2:5:3混合配置成50ml的混合溶液；2)将上述制备好的脱细胞基质样品，浸渍与1)溶液中，滴加1ml的15wt％氧化海藻酸钠进行交联，交联20min。
其余步骤与实施例1相同。
实施例3
本实施例提供了一种复合型脱细胞真皮基质生物敷料的制备方法，与实施例1相比，区别为：(一)所需试剂的制备中，脱脂剂为：20wt％脂肪醇聚氧乙烯醚、15wt％壬基酚聚氧乙烯醚、5wt％十二烷基磺酸钠以体积比1:5:3混合，配置50ml的混合溶液；复合酶为：3wt％dispase与0.25wt％trypsin-edta以体积比1:5混合配置10ml的混合溶液；(三)复合型生物敷料的制备中，1)将5wt％羧甲基壳聚糖、20wt％透明质酸、10wt％羟乙基纤维素、5wt％氯化钙、6wt％硫酸角质素溶液以体积比1:8:5:1:6混合配置成50ml的混合溶液；2)将上述制备好的脱细胞基质样品，浸渍与1)溶液中，滴加3ml的15wt％氧化海藻酸钠进行交联，交联60min。
其余步骤与实施例1相同。
实施例4
本实施例提供了一种复合型脱细胞真皮基质生物敷料的制备方法，与实施例1相比，区别为：(一)所需试剂的制备中，脱脂剂为：20wt％脂肪醇聚氧乙烯醚、15wt％壬基酚聚氧乙烯醚、5wt％十二烷基磺酸钠以体积比1:3:5混合，配置50ml的混合溶液；复合酶为：3wt％dispase与0.25wt％trypsin-edta以体积比1:5混合配置10ml的混合溶液。
其余步骤与实施例1相同。
实施例5
本实施例提供了一种复合型脱细胞真皮基质生物敷料的制备方法，与实施例1相比，区别为：(三)复合型生物敷料的制备中，1)将5wt％羧甲基壳聚糖、20wt％透明质酸、10wt％羟乙基纤维素、5wt％氯化钙、6wt％硫酸角质素溶液以体积比1:1:1:1:1混合配置成50ml的混合溶液；2)将上述制备好的脱细胞基质样品，浸渍与1)溶液中，滴加3ml的15wt％氧化海藻酸钠进行交联，交联60min。
对比例1
本对比例提供了一种复合型脱细胞真皮基质生物敷料的制备方法，与实施例1相比，本对比例不进行脱脂处理。
其余步骤与实施例1相同。
对比例2
本对比例提供了一种复合型脱细胞真皮基质生物敷料的制备方法，与实施例1相比，本对比例脱脂剂为：20wt％脂肪醇聚氧乙烯醚、5wt％十二烷基磺酸钠以1:2的体积比混合，配置50ml的混合溶液。
其余步骤与实施例1相同。
对比例3
本对比例提供了一种复合型脱细胞真皮基质生物敷料的制备方法，与实施例1相比，本对比例脱脂剂为：50ml的15wt％壬基酚聚氧乙烯醚的溶液。
其余步骤与实施例1相同。
对比例4
本对比例提供了一种复合型脱细胞真皮基质生物敷料的制备方法，与实施例1相比，(三)复合型生物敷料的制备中，1)将5wt％羧甲基壳聚糖、15wt％透明质酸、3wt％氯化钙、6wt％硫酸角质素各溶液以1:5:3:4的体积比混合配置成50ml的混合溶液。
其余步骤与实施例1相同。
对比例5
本对比例提供了一种复合型脱细胞真皮基质生物敷料的制备方法，与实施例1相比，(三)复合型生物敷料的制备中，1)将8wt％羟乙基纤维素、15wt％透明质酸、3wt％氯化钙、6wt％硫酸角质素各溶液以5:3:3:4的体积比混合配置成50ml的混合溶液。
其余步骤与实施例1相同。
对比例6
本对比例提供了一种复合型脱细胞真皮基质生物敷料的制备方法，与实施例1相比，(三)复合型生物敷料的制备中，1)将15wt％透明质酸、3wt％氯化钙、6wt％硫酸角质素各溶液以5:3:4的体积比配置成50ml的混合溶液。
其余步骤与实施例1相同。
对比例7
本对比例提供了一种复合型脱细胞真皮基质生物敷料的制备方法，与实施例1相比，(三)复合型生物敷料的制备中，不进行浸泡于1)中所述的混合溶液中的处理，直接滴加2ml的15wt％氧化海藻酸钠进行交联，交联30min。
其余步骤与实施例1相同。
实验例1脱细胞真皮基质脱脂率和胶原损失率
参照gb/t5009.6-2003，及iso3496:1978(e)检测实施例1～3及对比例1～3中步骤(二)脱细胞后的脱细胞真皮基质脱脂率和胶原损失率。结果如表1所示。
表1脱脂率及胶原损失率检测
由表1结果可知，实施例1～3中脱脂率均大于90％，脱脂效果好，同时具有较低的胶原损失率，胶原损失率在5％以下。可以看到，采用20％脂肪醇聚氧乙烯醚、15％壬基酚聚氧乙烯醚和5％十二烷基磺酸钠溶液以合适的体积比混合，在其协同作用下，在制备脱细胞真皮基质过程中，能够实现很好的脱脂效果，并且减少皮肤胶原的损失。实施例4中脱脂率为89％，胶原损失率为7％也稍高于5％，整体上效果较好，但相对其他实施例稍差，其原因是虽然采用了20％脂肪醇聚氧乙烯醚、15％壬基酚聚氧乙烯醚和5％十二烷基磺酸钠溶液混合，但其混合的体积比不在最佳范围内，效果稍微下降。而对比例1中不采用脱脂剂处理，脱脂率为0，而其在没有脱脂剂中各组分的保护下进行其它处理，胶原会有一定程度损失，但损失率不高。而对比例2和对比例3中的脱脂率偏低、胶原损失率很高，可见，没有实现三种物质的协同配合时，其在在发挥了表面活性剂一定脱脂效果的同时，胶原的损失率也极高，没有三种物质的协同配合，无法实现兼顾高脱脂率和低胶原损失率的效果。因此，采用20％脂肪醇聚氧乙烯醚、15％壬基酚聚氧乙烯醚和5％十二烷基磺酸钠以合适的比例混合，其在一方面对于皮肤起到了很好的脱脂效果，另一方面，在三者的配合下，实现温和脱脂，皮肤胶原不易随脱脂流失，从而实现了较低的胶原损失率。本发明实施例中，实施例1中的脱脂率为100％，胶原损失率为1，效果最佳，可见，20％脂肪醇聚氧乙烯醚、15％壬基酚聚氧乙烯醚、5％十二烷基磺酸钠以1:3:2的比例混合，具有最佳的协同效果。
实验例2复合型脱细胞真皮基质生物敷料促进伤口愈合实验
本实验检测复合型脱细胞真皮基质生物敷料对于新西兰兔伤口愈合情况的影响，具体步骤如下：
1)选取30只健康新西兰兔，耳缘静脉消毒缓慢注射3％戊巴比妥钠溶液，待其完全麻醉后进行实验；
2)用碘伏对新西兰兔的大腿部进行剃毛消毒，然后用手术刀作为1cm×1cm的创面，创面深至真皮层；
3)出血后，先用普通灭菌纱布吸收血液，将实施例1～3及对比例1～7制得的复合型脱细胞真皮基质生物敷料，裁剪至1cm×1cm大小，敷于创面上，纱布包扎；每组各3只新西兰兔，各只新西兰兔单笼饲养；
4)每天观察伤口的变化，观察各伤口的愈合情况，以伤口无炎症反应，伤口愈合完整为判断标准，统计新西兰兔伤口愈合的天数，结果如表2所示。
表2复合型脱细胞真皮基质生物敷料促进伤口愈合情况
可见，实施例1～3中，采用20％脂肪醇聚氧乙烯醚、15％壬基酚聚氧乙烯醚、5％十二烷基磺酸钠以合适的比例混合，对皮肤进行脱脂后，采用合适比例的3％dispase与0.25％trypsin-edta复合酶对皮肤进行脱细胞处理后，浸泡于壳聚糖、透明质酸、羟乙基纤维素、氯化钙、硫酸角质素并以氧化海藻酸钠进行交联反应，基于脱脂率高且保持了原有皮肤胶原的含量的特点，并配合壳聚糖、透明质酸、羟乙基纤维素、氯化钙、硫酸角质素的联合协效作用，制备得到的复合型脱细胞真皮基质生物敷料，具有良好的抗菌、促愈合的功效。
对比例1中不进行脱脂处理，其胶原损失率也较低，其愈合效果与实施例1～3接近，但其未进行脱脂处理，会导致制备得到的复合型脱细胞真皮基质生物敷料用于伤口时具有一定的免疫源性。
对比例2～3与实施例1～3相比，促进伤口愈合所需的时间稍长，主要是因为对比例2～3中在对皮肤进行脱脂处理时，皮肤脱脂率低且胶原损失率高促进伤口愈合的效果没有实施例1～3好。
对比例4～6中与皮肤交联的羧甲基壳聚糖、透明质酸、羟乙基纤维素、氯化钙、硫酸角质素组分间的协效配合作用被打破，其与实施例1～3相比促进伤口愈合的效果也较弱，其中羧甲基壳聚糖一方面具有抗菌效果，另一方面与羟乙基纤维素配合，并加入氯化钙、透明质酸和硫酸角质素混合浸泡脱细胞皮肤并加氧化海藻酸钠交联，显著提升真皮基质敷料的促愈合作用。
对比例7与实施例1～3相比，直接将皮肤加入交联剂氧化海藻酸钠而不与其它组分配合，其不具备抗菌效果，而且促进伤口愈合的作用最弱。上述说明本发明实施例1～3中实现促进皮肤伤口的快速愈合的效果，需要对皮肤样品进行合理的脱脂脱细胞处理，并配合以壳聚糖、透明质酸、羟乙基纤维素、氯化钙、硫酸角质素以合适的比例混合协效，各组分密切配合、共同作用，才得以实现的。
实验例3复合型脱细胞真皮基质生物敷料性能测试
本实验对实施例1～3和对比例1～7所述的复合型脱细胞真皮基质生物敷料的断裂强度(gb/t24218.3-2010)、断裂伸长率(gb/t24218.3-2010)、体外细胞毒性(gb/t16886.5-2003)、迟发型超敏反应(gb/t16886.10-2005)、皮内反应(gb/t16886.10-2005)进行检测。
表1医用敷料中生物支架的性能检测结果
由表1可见，本发明实施例1～5制备的生物支架的检测结果显示，各组均无皮肤刺激性、致敏反应及细胞毒性，对人体无害，实施例1的机械性能最佳。而对比例1中，因其未采用脱脂剂进行脱脂处理，因此其脱脂率极低，具有免疫原性，引起迟发型超敏反应和皮内反应，表现为重度红斑。而对比例2和对比例3中，采用的脱脂剂没有形成三者之间的合理配比，其脱脂率低而且胶原损失率很高，机械性能较差，且也在一定程度上会引起迟发型超敏反应和皮内反应，表现为中度红斑。而对比例4～6敷料的机械性能下降，原因为缺少羧甲基壳聚糖、透明质酸、羟乙基纤维素、氯化钙、硫酸角质素之间的协效作用。其中，羧甲基壳聚糖不仅具有抑菌效果，而且一方面能够与羟乙基纤维素配合实现增强敷料的机械性能从而有利于应用时能够平铺于伤口表面不易破损，另一方面还能起到协效作用，提高促愈合效果。对比例7没有添加壳聚糖、透明质酸、羟乙基纤维素、氯化钙、硫酸角质素，机械性能最差。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。