一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体拮抗剂作为脓毒血症治疗药物的应用的制作方法

本发明涉及一种融合蛋白的用途，具体涉及一种人sdr5-fc重组融合蛋白在作为制备治疗脓毒血症的药物中的应用。

背景技术：

脓毒血症(sepsis，也叫脓毒症、败血症)是指由微生物入侵机体感染引起的全身炎症反应综合征(systemicinflammatoryresponsesyndrome,sirs)。临床常见于手术、创伤及免疫力低下等状况下，细菌进入血液循环，并在其中生长繁殖、产生毒素而引起的全身性严重感染，表现为发热、严重毒血症状、皮疹瘀点、肝脾肿大和白细胞数增高等。如感染得不到有效控制，可进一步发展为脓毒血症休克(septicshock)和多器官功能衰竭(multipleorgandysfunctionsyndrome,mods)，脓毒血症引起的休克和多器官衰竭一直是科学家和临床医生的挑战，也是住院病人死亡的主要原因之一。据报道，脓毒血症发病率高，全球每年新增数百万脓毒症患者，其中超过1/4的患者死亡。每天新发病例有2000例，每小时约有25人死于严重脓毒血症。脓毒症已成为美国第10位致死原因，每年脓毒症患者花费达140亿美元。近年来，尽管抗感染治疗和器官功能支持技术取得了长足的进步，脓毒血症的死亡率仍高达18％～50％。随着人口的老龄化、肿瘤发病率上升及侵入性医疗手段的增加，脓毒症的发病率在不断上升。目前已建立的脓毒血症模型主要包括三类：①注射外源性内毒素，如lps等；②腹腔或静脉注射外源微生物，如细菌、真菌等；③破坏宿主内源性屏障，造成肠道内源菌丛移位，引发感染，如结肠升段支架性腹膜炎(colonascendensstentperitonitis,casp)或盲肠结扎穿孔模型(cecalligationandpuncture,clp)。内毒素模型或菌血症模型可精确控制感染剂量，稳定性和重复性好，但此类模型多是单菌丛感染，而临床患者大多是由一个或多个感染病灶持续释放细菌或内毒素，从而引起机体代谢、循环和免疫状态的改变，注射单一毒素或者细菌不能很好模拟人类脓毒血症病因和临床反应。huber-lang等在20世纪70年代建立了clp技术，该模型通过穿刺引起肠道内菌丛弥漫性持续释放，近似于临床阑尾炎或憩室炎穿孔诱发的腹膜炎。目前clp技术建立的脓毒血症模型最为接近临床脓毒血症情况，被称为脓毒血症动物模型的“金标准”。

2、脓毒血症发病原因

脓毒血症的发病机制涉及到复杂的全身系统性炎症反应效应、基因多态性、免疫功能障碍、凝血功能异常、组织损伤、线粒体功能障碍、以及宿主对不同感染病原微生物及其产生毒素的异常反应等多个方面，与机体多系统、多器官病理生理改变密切相关，具体的病理生理机理仍需进一步阐明。

3、脓毒血症的现有治疗方法

早期干预：①抗感染治疗。及早清创引流和广谱抗菌药物使用与抗感染的疗效呈正相关，应用抗生素时要做到“及早发现，及时使用”，早期可使用广谱抗生素，一旦明确细菌培养及药敏结果，可再针对性选择用药。初始期“广谱足量”和其后的“针对性选择性治疗”相结合。②容量复苏。一旦有依据被诊断为脓毒血症，应尽量在6h内进行补充体液治疗，确保建立有效的体液循环，以防器官功能受损。

综合治疗：

①抗凝剂。活化蛋白c是一种内源性抗凝物质，主要由肝脏合成，由内皮细胞、角质细胞等产生。活化蛋白c有提高纤容活性，激发特异性受体，通过调节基因的表达起到抗炎的作用，有利于维护内皮细胞的稳定性。在无禁忌症的情况下，推荐对脓毒症患者应用肝素进行深静脉血栓的预防。

②血液净化技术。血液净化可通过清除细胞因子协助体内毒物的排除，维护内皮细胞的稳定，提高机体含氧量，起到保护主要脏器的作用。血液净化技术可纠正休克，减轻多器官功能损害。

③糖皮质激素。据报道，小剂量、长疗程的糖皮质激素治疗，可以有效地防止脓毒血症引起的休克反应，提高生存率。而大剂量、短疗程的治疗方案有可能引起继发感染。

④他汀类药物。炎症因素贯穿于脓毒血症发展的始终，c反应蛋白(crp)作为一种急性炎症反应产物，与脓毒血症的关系密切，阿托伐他汀能够通过降低患者crp水平抑制炎症反应，通过抗炎、抗氧化、免疫调节起到修复细胞内皮功能、提高凝血功能的作用，这在降低脓毒血症患者病死率上都有一定的效果。

⑤胰岛素。脓毒血症患者细胞分解代谢活跃易使血糖升高，而高血糖是脓毒血症患者死亡的独立危险因素，增高患者并发感染、急性肾衰竭的概率，胰岛素能够有效降低血糖而提高患者生存率。胰岛素能够抑制抗细胞凋亡，而且还具有潜在的抑制炎性细胞因子产生炎症介质的作用。

⑥静脉免疫球蛋白治疗【1】。免疫球蛋白作为调理素可以进行抗原识别和清除，抑制超抗原介导的t细胞和单核细胞活化。免疫球蛋白可以降低il-1介导的外周血单核细胞活化。静脉注射免疫球蛋白具有重要的抗炎作用，可以中和促炎症细胞因子，抑制炎症细胞因子和趋化因子的合成。静脉注射免疫球蛋白能减少免疫细胞的凋亡，从而保持在细菌清除中淋巴细胞的关键作用。

由此可见，目前治疗脓毒血症的药物种类较少，疗效有限，亟需开发新的特异而又有效的治疗药物。

4、sdr5、sdr5-fc治疗脓毒血症

trail(tumornecrosisfactorrelatedapoptosisinducingligand，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体)是tnf超家族的一员，能诱导肿瘤细胞凋亡。trail在免疫系统中广泛表达，包括激活的t细胞，b细胞，nk细胞，树突状细胞，中性粒细胞和单核细胞。在人类中已发现5种trail受体，其中2个死亡受体dr4(deathreceptor4)和dr5(deathreceptor5)能够诱导细胞凋亡，dr5是亲和力最高的trail受体。dr4和dr5广泛表达于许多正常组织，例如脾、外周血淋巴细胞和胸腺。trail除了诱导细胞凋亡以外，还能激活很多非凋亡的信号途径，如mapk、akt、pkc和nf-κb途径等，在调节炎症反应中也发挥重要的作用。目前trail在脓毒血症中的作用引起多个研究团队的关注。2010年在criticalcaremedicine杂志katharinacziupka等人报道【2】，trail能提高固有免疫反应，从而提高多种微生物引起的败血症小鼠的存活率。该实验采用casp法诱导小鼠产生败血症，通过静脉给予重组的trail蛋白，能显著延长小鼠生存率。2011年在thejournalofimmunology杂志prajwalgurung等人报道【3】，采用clp法处理的trail敲除鼠和dr5敲除鼠能更好的控制二次细菌的感染。更重要的是，在clp法处理的野生型小鼠中使用阻断型抗trail单克隆抗体能恢复对表达ova单核细胞增多性李斯特氏菌感染的控制能力，并产生和假手术组小鼠中一样的抗原特异性cd8t细胞反应。这些结果暗示在败血症中存在trail依赖的免疫抑制，表明中和trail可能是一个潜在的治疗靶点，从而恢复败血症病人中的细胞免疫。2013年在plosone杂志yetian等人报道【4】，在脓毒性休克病人血浆中低水平可溶性trail与免疫瘫痪和死亡的高风险相关。可溶性trail可能可以作为免疫功能的潜在标志物和预测败血症病人生存率。2014年在plosone杂志katharinabeyer等人报道【5】，在casp法诱导脓毒血症小鼠中，trail能增强脾脏、肝和肺脏中中性粒细胞的凋亡，从而降低器官损伤，提高小鼠生存率。2016年在journalofinflammationresearch杂志katharinabeyer等人报道【6】，trail缺陷能增强在casp法诱导脓毒血症小鼠的存活率，作者认为外源性和内源性的trail在脓毒血症的早期阶段是起保护作用的，而内源性trail在脓毒血症的发展阶段是有害的。

可溶性dr5(solubledr5,sdr5)为dr5不含跨膜区域的可溶性形式，能与trail配体结合，但不能向细胞内传导信号，可阻断trail-drs介导的细胞凋亡或炎症信号。目前，sdr5对于脓毒血症是否存在治疗作用，国内外尚无报道。

技术实现要素：

为了解决上述问题，提供一种治疗或预防脓毒血症的高效低毒的方法，本发明提供了一种人sdr5-fc重组融合蛋白在制备治疗脓毒血症的药物中的应用，所述人sdr5-fc重组融合蛋白序列如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3或seqidno.4所示，或具有与seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3或seqidno.495％以上同源性并具有相同功能的重组融合蛋白。

本发明再一个方面提供了一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体拮抗剂在制备治疗或预防脓毒血症的药物中的应用。

其中，所述肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体拮抗剂选自前述的人sdr5-fc重组融合蛋白。

本发明再一个方面提供了一种治疗或预防脓毒血症的方法，其包括给与受试者一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体拮抗剂，优选地，所述肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体拮抗剂选自前述的人sdr5-fc重组融合蛋白。

本发明再一个方面提供了一种人sdr5-fc重组融合蛋白在制备降低脓毒血症患者血清中tnf-α的药物中的用途。

本发明再一个方面提供了一种降低脓毒血症患者血清中tnf-α的的方法，其包括给与受试者一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体拮抗剂，优选地，所述肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体拮抗剂选自前述的人sdr5-fc重组融合蛋白。

本发明再一个方面提供了一种治疗脓毒血症的药物组合物，其包含sdr5-fc重组融合蛋白序列或编码该蛋白序列的核苷酸序列及其药学上可接受的辅料。

本发明公开上述重组融合蛋白，可以和药学上可以接受的辅料一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂，优选水针或冻干制剂，对于本发明公开的上述重组融合蛋白的水针或冻干制剂，药学上可以接受的辅料包括表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合，其中表面活性剂包括非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温20或80)；triton；十二烷基硫酸钠(sds)；poloxamer(如poloxamer188)；pluronics；月桂硫酸钠；十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸等，其加入量应使重组融合蛋白颗粒化趋势最小，溶液稳定剂可以为糖类，包括还原性糖和非还原性糖，氨基酸类包括谷氨酸单钠或组氨酸，醇类包括丙二醇、聚乙二醇、三元醇、高级糖醇之一或其组合，溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态，等渗调节剂可以为氯化钠、甘露醇之一，缓冲液可以为tris、磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液之一。

本发明再一个方面提供了一种治疗脓毒血症的药物组合物，其包含sdr5-fc重组融合蛋白序列或编码该蛋白序列的核苷酸序列及至少一种治疗或预防脓毒血症的活性成分。

所述治疗或预防脓毒血症的活性成分选自抗凝剂，如活化蛋白c、糖皮质激素、他汀类药物，如阿托伐他汀、胰岛素、免疫球蛋白等。

本发明中sdr5-fc重组融合蛋白在对包括人在内的动物给药时，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。具体而言,静脉注射的剂量是0.01～3000mg/天。

有益效果：

1、sdr5-fc融合蛋白能显著提高脓毒血症患者的生存率。

2、sdr5-fc融合蛋白能显著降低血清炎症因子水平，具有抑制炎症的效果。

3、在脓毒血症中，无论致病病原体是何种，必然最终会导致组织器官的损伤和引起炎症反应，而组织、器官的损伤实质上是由组成组织、器官的细胞死亡所引起。trail-死亡受体通路参与多种病原体导致的脓毒血症，因此sdr5-fc适应范围广泛。

4、sdr5-fc融合蛋白来源于人体自身的蛋白组分，安全性高，毒副作用更小。

5、sdr5-fc蛋白作用机理完全不同于已有治疗药物，能够安全的与其它治疗药物联用，增强疗效，促进康复。

附图说明

图1小鼠生存率比较。使用log-rank(mantel-cox)test，治疗组小鼠生存率显著性高于模型组，p＝0.0082。

图2小鼠血清tnf-α水平比较。使用ttest，治疗组小鼠血清tnf-α水平显著性低于模型组，p＝0.0176。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不局限于此。

实施例1重组sdr5-fc表达序列的设计和重组

发明人经过长期的经验积累，构建融合蛋白，将人sdr5与fc进行多种方式的融合，质谱分析结果显示目的蛋白n端不稳定，会出现多个氨基酸剪切，据此设计并制备多条氨基酸序列seqidno.1～4，其中seqidno.1的蛋白所含氨基酸数目最少，分子最小，且所含剪接异构体比例最低，在37度下为1％，而其它序列所含氨基酸数目均多于seqidno.1，且剪接异构体比例也更高，seqidno.2为31％；seqidno.3为49％；seqidno.4为52％，均显著性高于seqidno.1的剪接异构体比例，因此seqidno.1的蛋白最小，纯度最优，最稳定。

seqidno.1(341个氨基酸)：

sspseglcppghhisedgrdcisckygqdysthwndllfclrctrcdsgevelspctttrntvcqceegtfreedspemcrkcrtgcprgmvkvgdctpwsdiecvhkeepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk；

seqidno.2(370个氨基酸)：

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seqidno.3(359个氨基酸)：

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seqidno.4(348个氨基酸)：：

aapqqkrsspseglcppghhisedgrdcisckygqdysthwndllfclrctrcdsgevelspctttrntvcqceegtfreedspemcrkcrtgcprgmvkvgdctpwsdiecvhkeepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

所述seqidno.1-4融合蛋白的氨基端是人死亡受体5可溶片段；羧基端是人免疫球蛋白1(igg1)的fc片段。

所述的人死亡受体5可溶片段具有如seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7或seqidno.8所示的氨基酸序列，或具有与seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7或seqidno.895％以上同源性并具有相同功能的蛋白。

所述的人免疫球蛋白1(igg1)的fc片段序列如seqidno.9所示。

人死亡受体5可溶片段与人免疫球蛋白1的fc片段之间直接连接。

seqidno.5(109个氨基酸，截短的人dr5胞外区)：

sspseglcppghhisedgrdcisckygqdysthwndllfclrctrcdsgevelspctttrntvcqceegtfreedspemcrkcrtgcprgmvkvgdctpwsdiecvhke；

seqidno.6(138个氨基酸)：

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seqidno.7(127个氨基酸，全长的人dr5胞外区)：

itqqdlapqqraapqqkrsspseglcppghhisedgrdcisckygqdysthwndllfclrctrcdsgevelspctttrntvcqceegtfreedspemcrkcrtgcprgmvkvgdctpwsdiecvhke；

seqidno.8(116个氨基酸，截短的人dr5胞外区)：

aapqqkrsspseglcppghhisedgrdcisckygqdysthwndllfclrctrcdsgevelspctttrntvcqceegtfreedspemcrkcrtgcprgmvkvgdctpwsdiecvhke；

seqidno.9：

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实施例2：人sdr5-fc抗体融合蛋白治疗脓毒血症。

将30只spf级雄性c57bl/6小鼠随机分为模型组和9mg/kgsdr5-fc治疗组(9mg/kg简写为9mpk)，每组15只。使用盲肠结扎穿孔法(clp)造模。术前一天小鼠禁食(24h)，术前先称重，根据所称体重对小鼠进行全身麻醉，按照10％水合氯醛(0.4ml/100g)的剂量无菌腹腔注射，用止血钳钳夹小鼠四肢末端，无伸缩疼痛反应即表示麻醉完全。将小鼠置于手术台上，仰卧位，用细线固定四肢及牙齿。弯剪小心备皮，碘伏消毒两遍，酒精脱碘一遍，铺无菌洞巾。腹部中间腹白线处切开1cm左右小口，找到盲肠，在盲肠中点处避开肠系膜血管，用4#丝线紧紧结扎，18g穿刺针在结扎处与远端盲肠中点贯通穿刺1次，两穿刺孔处各挤出一小滴粪便后将盲肠放回腹中，注意避免污染切口，6#丝线分两层缝合切口，再次碘伏消毒。术后立即尾静脉注射10ml/kg生理盐水(saline)或9mg/kgsdr5-fc(seqidno.1)，另外每只小鼠皮下给予0.8ml预热37℃生理盐水以补充术中所失液体，给予水及食物。观察小鼠生存情况，造模24h后每只小鼠采血分离血清，用bdcytometricbeadarray(cba)mouseth1/th2/th17cytokinekit分析血清中tnf-α水平。

附图1显示，在使用clp方法造模的脓毒血症小鼠中，给予9mg/kgsdr5-fc能显著提高脓毒血症小鼠的生存率。使用log-rank(mantel-cox)test，p＝0.0082。

附图2显示，在使用clp方法造模的脓毒血症小鼠中，给予9mg/kgsdr5-fc能显著降低脓毒血症小鼠血清中tnf-α的水平。已有研究表明，tnf-α具有潜在的细胞毒性并能引起炎症级联反应，在脓毒症早期tnf-α诱导细胞凋亡，晚期诱导中性粒细胞浸润和内皮细胞的活化，在脓毒血症引起器官损伤中发挥重要作用。降低tnf-α水平对治疗脓毒血症器官功能紊乱至关重要。

参考文献

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【6】beyerk,stollhofl,poetschkec,vonbernstorffw,parteckeli,diedrichs,maiers,bm,heideckecd.tnf-relatedapoptosis-inducingliganddeficiencyenhancessurvivalinmurinecolonascendensstentperitonitis.jinflammres.2016jun16；9:103-13.

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130135140

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145150155160

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180185190

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245250255

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275280285

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290295300

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115120125

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<211>127

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202530

tyrglyglnasptyrserthrhistrpasnaspleuleuphecysleu

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<213>人免疫球蛋白

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115120125

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145150155160

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165170175

lysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphepheleutyr

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195200205

sercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlys

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serleuserleuserproglylys

225230