纳米金探针在制备肾脏损伤的早期诊断试剂中的用途的制作方法

本发明属诊断药理学技术领域，涉及纳米金探针在制备肾脏损伤的早期诊断试剂中的用途，所述的肾脏损伤尤其是对肾小球滤过孔径有影响的肾脏疾病。

背景技术：

流行病学研究表明，目前中末期肾病患者的数量在全球有10万以上,而且肾病患者的数量的年增长率为10％的。全球肾病患者总数的10％在中国.而且一些基础疾病如高血压、糖尿病等疾病的发病率逐年上升,这些原因所导致的肾病患者也日益增多。肾脏疾病不仅会极大的损坏患者的生活质量而且治疗费用巨大，在60岁及以上人群中，肾病患者的医疗消耗是所有消耗的20％。肾脏病的临床表现较多,不同的肾脏疾病表现也不尽相同,但亦有一些共同之处:腰酸、晨起眼睑浮肿、下肢浮肿、夜尿增多、血尿、泡沫尿、尿急、尿痛、乏力、晨起恶心呕吐、血压增高等。但是肾损害的发生是隐蔽的，临床上最重要的标志是出现蛋白尿，以往常根据持续性蛋白尿诊断，目前常用的肾功能检查为尿蛋白、尿素氮(bun)和肌酐(cr)，这些指标难以发现早期肾损伤，一旦肾功能检测结果异常，多数病人进入不可逆蛋白尿阶段。因此，肾病的早期诊断尤为重要。随着医学的发展，有蛋白尿症状的患者的寿命不断延长，然而这些患者的死亡率依然很高，而且有些肾病患者还有其他的并发症比如高血压高血脂等。有研究表明40％的糖尿病患者同时患有慢性肾病，其中不到10％的患者又会恶化为终末期肾衰。尽管糖尿病是肾病的主要基础疾病，但是还是有至少30％的肾病患者的病因不是因为血糖过高。目前常见的基础疾病高血压也是主要的引起肾脏损伤的原因。高血压会引起肾小球血流动力学改变，促使白蛋白穿过基膜形成白蛋白尿。高血压肾病患者由于肾小球毛细血管压力增高，肾小球毛细血管基底膜通透性增加，导致肾小管对滤过的白蛋白重吸收减少，这也会导致蛋白尿的形成。众所周知，肾小球通透性增大是绝大部分肾病的主要特征，基于这个病理特征，本申请的发明人拟设计一个大小可控的探针来进行肾脏疾病的早期诊断。如果解决肾脏疾病的早期诊断，就可以明显的改善病人的生活质量并降低他们的医疗费用。

在临床实践中，现有的评价肾小球损伤和肾功能的方法包括了血液生化指标的检测和影像学成像技术的使用。用于评价的生化指标包括了血清肌酐(scr)，血尿素氮(bun)，尿蛋白和肌酐比值以及估计的肾小球滤过率(egfr)。然而这些方法都受限于病人的个体差异，如在临床上医生经常遇到所谓的无蛋白尿肾损伤病人。举例说，高滤过的状态，肌肉含量和饮食改变均能影响基于肌酐计算的肾小球滤过率。由于应用肾小球滤过率和尿蛋白于肾脏损伤的早期诊断上有着很多的限制，人们在努力寻找着例如cystatinc，neutrophilgelatinase-associatedlipocalin，n-acetyl-β-d-glu-co-aminidase等等的新的疾病诊断标志物，然而这些新的标志物相较于传统的优势仍然需要更深入的研究。除了通过内源性的物质诊断外，还有其他通过外源性物质诊断肾小球滤过率的方法，包括诊断菊糖滤过率，放射性物质和金属铬等。然而病人的依存性限制了这些方法的有效应用，例如糖尿病患者不能耐受菊糖的高用量，而其他的方法又具有各种各样潜在的肾毒性，这些方法基本都不适用于身体虚弱的病人。而从影像学方法上看，有各种方法被应用于临床诊断肾脏的早期损伤，包括ct,核磁共振，放射核影像。然而这些方法也有很多应用上的限制。例如ct，核磁共振和pet-ct都因为价格过高不能普遍使用，而超声和x光又因分辨率过低不能达到良好的诊断效果。

上述的这些所有的不足都限制了肾小球滤过率和内源性标志物应用于肾脏损伤的早期诊断中与目前的影像技术相比，光声成像是一项新兴技术，是超声技术和光学显影的融合体。其机理是通过光能量的吸收，产生热胀反应产生超声波。光声成像有更高的穿透率和可探测性。而且由于超声波在组织中的传播能力较弱而且没有放射性物质的参与，光声成像也比ct以及其他基于放射性物质成像的方法更加安全。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供纳米金探针在制备肾脏损伤的早期诊断试剂中的新的用途。

与本发明有关的参考文献有：

1.jana,n.r.；gearheart,l.；murphy,c.j.seedinggrowthforsizecontrolof5-40nmdiametergoldnanoparticles.langmuir2001,17(22),6782-6786.

2.warner,m.g.；reed,s.m.；hutchison,j.e.small,water-soluble,ligand-stabilizedgoldnanoparticlessynthesizedbyinterfacialligandexchangereactions.chemistryofmaterials2000,12(11),3316-3320.

3.connor,e.e.；mwamuka,j.；gole,a.；murphy,c.j.；wyatt,m.d.goldnanoparticlesaretakenupbyhumancellsbutdonotcauseacutecytotoxicity.small2005,1(3),325-7.。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术的缺陷，提出纳米金探针在制备肾脏损伤的早期诊断试剂中的新的用途。本发明经试验证实应用纳米金探针可以比用传统的生化和组织切片方法有快速准确的诊断出肾脏的损伤。

基于上文所述，肾小球滤过率的提高是多数肾脏疾病的病理学变化，本发明设计了两种基于这种变化的光声纳米探针来检测肾脏的早期损伤，本发明经试验显示，5.5nm的探针可判断出由单侧输尿管阻塞96小时后放开所造成的肾脏损伤，这种方法在检测速度以及准确率方面均超过了传统方法；并且，本发明显示了光声光谱学信号分子和纳米金核连接时产生的光谱的蓝移现象。本发明的纳米金探针可用于制备肾脏损伤的早期诊断试剂。

本发明所述的探针拥有金内核和外部的保护层，各种不同粒径的合成方法已经成熟，而且纳米金可以通过某些特定的药物难以通过的生物屏障，并且可以较容易地通过配体置换反应构建具有靶向性的外壳；

本发明的纳米金通过种子生长法合成，包括，首先合成3.5nm的纳米金种子，接着通过生长液合成5.5nm的纳米金，3.5nm和5.5nm的纳米金均通过超速离心管进行提纯和浓缩，接着纳米金先和信号分子cy7-lip混合搅拌30分钟，然后加入谷胱甘肽继续搅拌30分钟，将最终探针通过超速离心管进行进一步浓缩。

本发明的探针合成后，应用透射电镜测量具体粒径，结果显示两种探针的粒径平均为3.5纳米和5.5纳米，具体数值如图1b所示；应用粒度分析仪测量水合粒径两种探针的水合粒径分别为4.4纳米和8.2纳米，结果如图1c所示；表面电荷分别为-22.9mv和-33.6mv；应用紫外分光光度计测量吸收光谱；体外测量探针光声光谱，结果显示，探针载体纳米金颗粒在链接信号分子后，有一个明显的光谱蓝移的过程；而且光声的信号强度与探针的浓度呈线性关系。

本发明进行了纳米金探针用于动物试验：其包括：

(1)小鼠单侧输尿管阻塞并解除手术；

(2)应用纳米金探针在动物上并应用光声和ct进行检测；

(3)检测生化指标；

(4)离体细胞研究；

(5)纳米探针的离体表征；

(6)免疫组化；

(7)数据分析。

结果显示，

(1)应用光声成像纳米金探针诊断模型动物的肾脏损伤情况

通过尾静脉注射的方法将探针注射入模型和控制组老鼠体内，定时间点应用活体光声探测仪观测实验动物的肾脏和膀胱的信号强度，实验证明，3.5纳米探针在正常组动物体内可以通过肾脏排出到达膀胱，5.5纳米的探针在膀胱的信号几乎检测不到。而在模型组动物体内，能在膀胱检测到5.5纳米的探针，证明由于肾脏的损伤所述的探针通过肾脏排出到膀胱，间接证明可以通过膀胱的信号来推测肾脏的损伤。

(2)应用ct成像纳米金探针诊断模型动物的肾脏损伤情况

通过尾静脉注射的方法将探针注射入模型和控制组老鼠体内，定时间点应用小动物ct观测实验动物的肾脏和膀胱的信号强度，实验证明，3.5纳米探针在正常组动物体内可以通过肾脏排出到达膀胱，5.5纳米的探针在膀胱的信号几乎检测不到，而在模型组动物体内，能在膀胱检测到5.5纳米的探针，证明由于肾脏的损伤，所述的探针通过肾脏排出到膀胱，间接证明可以通过膀胱的信号来推测肾脏的损伤，通过ct得出的结果与光声是相同的。

(3)应用电镜探究纳米金探针诊断肾脏损伤的具体机制

取出肾脏按照电镜采样要求采集样本，做固定，切片，染色，应用透射电镜观察探针是如何通过肾小球虑过屏障，结果显示，在正常组动物的肾小球虑过屏障外侧只有3.5纳米的探针，而在模型组，3.5纳米和5.5纳米探针都有存在，结果再次与光声和ct的结果相互印证。

(4)应用生化指标和组织切片方法诊断肾脏损伤

在模型组动物和正常组动物试验后，取肾脏和血液，做组织染色，和血生化检查，应用传统的检测肾脏损伤的方法检验模型组肾脏损伤，结果显示，he染色和masson染色均没有显示明显的组织损伤，而且血生化结果显示血肌酐和尿素氮的含量也在正常范围内。

(5)体外细胞实验检测纳米金探针的安全性

选取人源肾小管上皮细胞(hk-2)，应用两种探针与其共培养24小时，后应用流式细胞仪检测细胞活力，同时应用cck-8试剂盒检测细胞增殖能力，结果显示，两种探针均对hk-2细胞活性无明显影响。

本发明经试验，结果显示，制得的纳米金探针的各项具体数据和光声光谱学信息显示合成出符合预期的纳米探针；透射电镜粒径结果显示两种探针的粒径平均为3.5纳米和5.5纳米具体数值如图1b所示；应用粒度分析仪测量水合粒径两种探针的水合粒径分别为4.4纳米和8.2纳米，结果如图1c所示；表面电荷分别为-22.9mv和-33.6mv具体结果如图1所示；应用紫外分光光度计测量吸收光谱；体外测量探针光声光谱，显示探针载体纳米金颗粒在链接信号分子后，有一个明显的光谱蓝移的过程；而且光声的信号强度与探针的浓度呈线性关系。

应用光声成像和ct成像检测纳米金探针诊断模型动物的肾脏损伤情况。通过尾静脉注射的方法将探针注射入模型和控制组老鼠体内，定时间点应用活体光声探测仪观测实验动物的肾脏和膀胱的信号强度，实验证明，3.5纳米探针在正常组动物体内可以通过肾脏排出到达膀胱，5.5纳米的探针在膀胱的信号几乎检测不到，而在模型组动物体内，能在膀胱检测到5.5纳米的探针，证明由于肾脏的损伤所述的探针通过肾脏排出到膀胱，间接证明可以通过膀胱的信号来推测肾脏的损伤。

为了进一步验证之前的设想，在成像结束后，取出肾脏并按照电镜采样要求采集样本，做固定，切片，染色，应用透射电镜观察探针是如何通过肾小球虑过屏障的，结果显示，在正常组动物的肾小球虑过屏障外侧只有3.5纳米的探针，而在模型组，3.5纳米和5.5纳米探针都有存在，这个结果再次与光声和ct的结果相互印证。

为了与传统的检测肾脏损伤的方法比较，本发明选取了经典的生化指标和组织切片方法诊断肾脏损伤，在模型组动物和正常组动物试验后，取肾脏和血液，做组织染色，和血生化检查，应用传统的检测肾脏损伤的方法来检验模型组肾脏损伤，结果显示，he染色和masson染色均没有显示明显的组织损伤，而且血生化结果显示血肌酐和尿素氮的含量也在正常范围内，这表示在传统方法上，模型组的动物的肾脏还没有损伤，间接证明了传统检测方法的局限性。

为了验证探针的细胞毒性，本发明选取人源肾小管上皮细胞(hk-2)，应用两种探针与其共培养24小时，后应用流式细胞仪检测细胞活力，同时应用cck-8试剂盒检测细胞增殖能力，结果显示，两种探针均对hk-2细胞活性无明显影响。

本发明的优点在于：

1、制得的纳米金探针可用于制备肾脏损伤的早期诊断试剂中。

2、光声信号分子和纳米金核连接时产生的光谱的蓝移现象及其；而且光声的信号强度与探针的浓度呈线性关系。

3、所述纳米金探针通过粒径不同实现对不同病理环境肾脏损伤的诊断，以及实现的光谱学特征。

4、5.5纳米的探针可以在肾脏损伤早期通过肾小球虑过并在膀胱被检测出来。

5、纳米金探针的检测方法为光声和ct。

上述的优势使得本发明的纳米金探针为诊断肾脏损伤的新方法提供了有意义的参考数据和支持。

附图说明

图1两种纳米探针的合成过程和表征结果。

图2两种纳米探针的光声光谱结果。

图3应用光声检测探针在正常组和模型组动物体内的行为。

图4应用ct检测探针在正常组和模型组动物体内的行为以及应用探针在组织中的微观行为。

图5应用生化指标和组织切片方法检测肾脏损伤情况。

图6应用cck-8检测纳米探针的细胞毒性.

具体实施方式

本发明的实施方式中材料和方法：

除非特殊告知所有化学试剂均从阿拉丁化学试剂有限公司(中国)购买。cy7-lip由实验室自行合成。1640培养基，胰酶，青霉素和链霉素均购买自生命科技有限公司；胎牛血清购买自geminii(ca,usa)。凋亡和坏死检测试剂盒购自碧云天。

主要仪器和设备：

1.超净工作台苏州净化装备有限公司

2.c02细胞培养箱thermo，usa

3.冷冻离心机t11ernlo，usa

4.培养皿coming，usa

5.millipore水纯化系统millipore，usa

6.载玻片nalgenuncintemational，naperville，il

7.超滤离心管miliporeusa

8.荧光显微镜axiovert40cfl，zeiss

9.紫外分光光度计uv-2550japan

10.透射电子显微镜tecnaig2f20s-twin,fei

11.光散射仪zetasizer3000；malverninstruments

12.光声成像系统fujifilmvisualsonicsinc.,toronto

13.倒置显微镜laica，dmil，wetzlar，germany

14.酶标仪tecansystemsinc，switzerland

15.高压灭菌锅thermo，usa

16.微型ct仪quantumfxmicroct；perkinelmer,usa。

实施例1

(1)建立uuo-r动物模型

所有实验经过复旦大学上海医学院动物关爱和使用委员会核准。本发明采用雄性成年balb/c小鼠(上海斯莱克实验动物有限公司提供，上海，中国)。

雄性的balb/c小鼠20只，体重20左右，小鼠称重后用2％的戊巴比妥腹腔注射(50mg/kg)麻醉，将小鼠仰卧固定于鼠板上，备皮，消毒，在左侧腹部切口，暴露并分离左侧输尿管，用丝线在靠左。肾处双重结扎输尿管，检查手术视野内无持续出血后手术缝合伤口，96小时后，再次重复上述操作，并去除结扎。

组织取材：用2％的戊巴比妥腹腔注射(50mg/kg)麻醉，迅速取出左肾，切开后，一部分置于4％的多聚甲醛中，一部分做常规石蜡包埋、切片，供病理和免疫组化检查，另一部分肾置于.80℃冰箱中备用，一部分按照电镜取材方法，放置在固定液里，留后使用。

(2)合成纳米金

纳米金通过种子生长法合成；包括，首先合成3.5nm的纳米金种子，接着通过生长液合成5.5nm的纳米金，3.5nm和5.5nm的纳米金均通过超速离心管进行提纯和浓缩，接着纳米金先和信号分子cy7-lip混合搅拌30分钟，然后加入谷胱甘肽继续搅拌30分钟，将最终探针通过超速离心管进行进一步浓缩。

(3)细胞培养实验

将1640培养基加入10％的胎牛血清，100u/ml的青霉素和100ug/ml的链霉素，混合并在37摄氏度孵育，当细胞密度到达85％左右时用胰酶消化并将细胞一分为三于新培养皿中。

(4)细胞活力试验

细胞活力的检测依照cck8试剂盒附带的生产商说明书指使；细胞种植在96平板中于37摄氏度培养23小时，然后将3.5nm和5.5nm的探针分别和细胞共孵育24小时，每孔加入10ul细胞增殖试剂，在37摄氏度下继续孵育两小时，最后用酶标仪在波长为450nm处测吸光度。

(5)细胞凋亡和坏死分析

将细胞种植在24孔板内与两种探针共孵育24小时，然后用胰酶消化细胞并收集于离心管内，并用100ul的染色缓冲液吹旋，之后加入0.5ul的hoechst33342和0.5ul的pi，将细胞悬液在4摄氏度孵育20分钟，然后用流式细胞仪进行分析。

(6)体内和体外光声影像学实验

通过21mhz的超声探测器和发射波长为680nm到970nm的激光发射器进行光声显影。纳米金放置于塑料管中来获得体外的光声光谱学数据，麻醉后的动物放置在加热的实验操作平台上，尾静脉注射纳米探针，在实验前10分钟和注射后10,20,30，60,120分钟后进行实验动物的膀胱显影。

(7)体内和体外ct影像学实验

纳米金放置于1.5ml的离心管中获取不同浓度时的ct信号，。麻醉后的动物放置在仪器中并在实验前10分钟和静脉注射后5,10，20,30,60,120分钟后进行ct显影，每个进行显影的时刻，显影范围均包括两个肾脏和膀胱。

(8)血肌酐和尿素氮的测定

收集血液，4℃13000rpm离心30分钟；收集上清液，加入测定液用分光光度计(thermobiomate3s,thermoscientific,美国)在给定波长测量其光密度值；采用标准品制作标准曲线，按标准曲线计算出光密度值对应的出血量。

(9)数据分析

数据用平均值±sd表示，采用单因素方差分析后经boneferroni多组比较进行统计分析；采用kruskal–wallistest分析后经dunn多组比较进行行为学数据的统计分析；两组比较时，采用未配对双尾studentt检验。p<0.05视为有统计学差异。

本发明实验显示，传统肾功能指标无明显改变，而本发明的实验结果却明确指出了肾脏的损伤，说明所述的纳米探针可作为肾损伤早期诊断的敏感检测方法，尤其是5,5纳米的探针可以安全有效并且比传统方法更加高效敏感的诊断肾脏损伤。