本发明涉及兽医学领域，尤其涉及治疗动物的病毒性疾病，特别是治疗鸟类疾病，例如新城疫病(ndv)等。本发明涉及开发增强对于ndv的免疫应答的疫苗，更确切地，产生了重组新城疫病病毒(recombinantnewcastlediseasevirus，rndv)，该重组新城疫病病毒带有插入的非其基因组原有的转录单位，该转录单位编码合成干扰素γ(interferongamma，ifnγ)或者白细胞介素-6(interleukin-6，il-6)细胞因子型免疫调节蛋白。这些重组病毒提供优异的保护结果并且明显降低了用强毒株“ndv-p05”攻击时分泌在已免疫的鸟体内的病毒载量。两种重组疫苗减少病毒分泌的效果归因于插入rndvs基因组的另外的基因所合成的细胞因子的作用。这是由于两种蛋白质都具有靶定和增强宿主的免疫应答以及促进有效的体液应答和细胞应答的能力，这影响了抗体的同种型和亲合力，最终导致更大量的病毒粒子的中和。最后，除了新城疫病毒之外，本申请的重组病毒赋予了对其他病毒感染的保护。
背景技术：
：：家禽养殖是全世界最发达的人类农业活动之一，因为它发展和履行了非常重要的社会和经济作用。这种经济活动开发周期短，转化率高，能够在相对短的时间提供肉和蛋，所以它在人口膳食上起到了战略性作用，因为家禽产品存在于大部分家庭中，这归因于它们有营养、用途广泛并且保持了相对低的价格(lopezyolvera，2010)。家禽业的主要威胁是发生细菌、寄生虫和病毒引起的疾病，新城疫病毒(ndv)是其中的一种致命的形式(aldous和alexander，2001；alexander等人，2012)。新城疫病是由属于副黏病毒科禽副黏病毒属(avulavirusgenus)的血清型禽副黏病毒1型(1-avianparamixovirus，pmva-1)引起的(king等人，2012；mayo，2002；murphy等人，1995)。这种病毒影响了超过250种禽类物种，其中包括家禽例如肉用仔鸡和蛋鸡(alexander等人，1997；alexander等人，2004；murphy等人，1999；rauw等人，2009)。在感染的家禽中可见的临床病征范围广泛，亚临床形式、中等形式和高死亡率的严重形式，这主要取决于流通株的毒性、宿主的种和年龄、其他病原体的感染、宿主的环境应力和免疫条件(aldous和alexander，2001；alexander等人，2004；dortmans，2011)。在每种情况中，被极致命的病毒感染会引起高而突然的死亡率，而不表现出严重的临床病征(alexander等人，2004)。这种疾病涉及家禽的不同的呼吸、循环、胃肠和神经问题(hines和miller，2012)。这些信号基本上取决于宿主的年龄和免疫条件以及感染株的毒性和趋向性(alexander等人，2012；dortmans，2011；dortmans等人，2011；mcferran和mccracken，1988)。同样，还受其他微生物重叠感染、生物体所经历的环境压力是加剧临床病情的另外因素(aldous和alexander，2008；aldous和alexander，2001；alexander等人，2004)。通常观察到下面的症状：呼吸困难、冠颏青紫、肌肉痉挛、食欲不振、冷漠和冷淡、剧渴、虚弱和嗜睡(aldous和alexander，2008；alexander等人，2004；dortmans，2011)。在消化道水平上，可以观察到嗉囊发炎、咽喉的泡沫状粘液和纤维蛋白分泌物以及腹泻范围从绿色到黄色(aldous和alexander，2008；carter等人，2004；murphy等人，1999)。神经信号表现为翅膀和腿的瘫痪、斜颈、共济失调或者圆运动、阵挛和抽搐。在产蛋家禽中，存在着产蛋量大幅减少，并伴随着蛋壳的褪色和丧失以及清蛋白质量的降低(dortmans，2011；dortmans等人，2011；murphy等人，1999)。新城疫病毒的潜伏期是3-6天，这取决于多种因素，包括受感染宿主的种、对ndv所产生的免疫力和家禽所遭受的毒株的量和种类(和bidin，2008；kapczynski等人，2013)。它是一种高传染性疾病，在头3、4天具有100％的发病率(和bidin，2008；kapczynski和king，2005)。该病毒是通过器皿、被污染的装置、个人、来自于农场的其他家禽或者野生禽传播的，并且在急性期通过飞沫、食物、谷粒或者受污染的水传播(alexander等人，2004；lopez和olvera，2010)。该病毒可以在粪便中发现，并且在低温是活性的，但是它不能持续曝露于日光直射。空气对带有该病毒的粒子起到输送作用，虽然以此方式不可能在远距离传播(lopez和olvera，2010)。为了保持该疾病受控，通常使用活疫苗(轻型毒株)和灭活疫苗(sawant等人，2011；seal等人，2000)，其在减少临床病情和预防死亡率方面提供了良好的结果(miller等人，2007)。不过，值得注意的是预防新城疫病的主要缺点之一是尚未避免病毒分泌(afonso和miller，2013)，不论是病原体病毒剂的病毒分泌，还是用作疫苗的病毒的病毒分泌。家禽体内ndv病毒分泌是在感染后4-5天发生的。这种分泌导致了病毒在群体中传播的更大可能性，因此增加了它在农场中的持续期。因此，需要开发更有效的能够降低病毒传播、减少病毒分泌次数、提高对于感染的免疫应答的疫苗。下一节将描述ndv的主要特征，来更好理解本发明。新城疫病毒的分类血清型禽副黏病毒1型(apmv-1)的不同基因型的在世界的几部分传播，并且虽然全部被承认为新城疫病毒，但是可能会在它们中鉴别出广泛的基因多样性。因此，已经提出了用于对其进行分类的几种方法(absalon等人，2012；czeglédi等人，2006；miller等人，2010；miller等人，2007)。最新的一些方法是基于对该病毒的全基因组的所知和分析(absalon等人，2012)，以及基于限制酶和编码融合蛋白的基因的部分序列或者全序列的分析(aldous等人，2003；ballagi-pordány等人，1996；diel等人，2012；miller等人，2007)。最近，评估血清型禽副黏病毒1型(apmv-1)的基因多样性，diel等人(2012)提出了一种基于客观标准的命名法和统一的分类系统，将ndv分到不同的基因分组中(diel等人，2012)。新城疫病毒株在它们于禽类身上可能引起的症状严重程度上差异很大，虽然这些临床病征可能都不会被认为是特殊的，但是某些症状似乎与一些特定种类的病毒有关。通过参考受感染的鸡体内的主要症状，产生了三种不同的病变型分组(alexander等人，2004；murphy等人，1999；peeters等人，1999)。基于此，ndv株可以是：a)强毒的：疾病的高致病形式，其中主要是肠出血病变，以及神经病征和呼吸病征。这些病毒的特征在于引起高死亡率。b)中等毒性的：引起呼吸病征和神经系统病征的病毒，通常引起低死亡率。c)弱毒的：这些类型的病毒引起温和的呼吸系统感染。病毒基因组的结构和排列新城疫病毒具有副黏病毒的典型结构，它由包围着螺旋形核衣壳的脂蛋白包膜组成，它具有单链不分节段的rna基因组并且具有负极性(等人，1999)，其可以包含15186、15、192或15198个核苷酸(dortmans，2011；dortmans等人，2010；10peeters等人，1999)。这种病毒的基因组(无论它的大小如何)包含6个基因：以3'-5'的顺序为np-p-m-f-hn-l，它们依次编码合成六种主要结构蛋白：病毒核蛋白(nucleoprotein，np)、磷蛋白(phosphoprotein，p)，基质蛋白(matrixprotein，m)，融合蛋白(fusionprotein，f)，凝血素-神经氨酸酶(hemagglutininneuraminidase，hn)和l蛋白或者依赖于rna的rna聚合酶(图1)(dortmans等人，2010；engel-herbert等人，2003)。每个转录单位都具有可读框，在可读框两侧有两个非编码外顺反子序列(utr)，分别在位置3'和5'的被称作“头”和“尾”。所述的区域之后是保守转录控制序列，称作“基因始点”(genestart，gs)和“基因终点”(geneend，ge)，指示病毒聚合酶的每个可读框的终点(ge)和始点(gs)(kim和samal，2010)。这些区域被非编码基因间区“基因间序列”(intergenicsequence，is)隔开，对于基因间区来说，它们的长度已经确定：在np-p之间、p-m之间、m-f之间为1个核苷酸(nucleotide，nt)；在f-hn之间为31个nt；在hn-l之间为47个nt(krishnamurthy和samal，1998)。改变这个长度，增加或者减小，产生了无效的(dimmed)或者潜在不能工作的病毒(yan和samal，2008)。组成ndv基因组、编码六种主要结构蛋白的这6种基因，示意性地表示在图1中，并且描述如下：病毒蛋白质核蛋白(np)ndv的核蛋白(np)是最大的结构蛋白，因为估算它对于每个rna分子都有大约2600个拷贝，它始终以这样的方式结合到rna分子，即，基因组的每六个核苷与np的一个拷贝相互作用(egelman等人，1989)。以此方式，ndv基因组从未被发现为游离rna，而与np蛋白以及p蛋白、l蛋白密切相连在一起，形成核糖核蛋白复合体(mebatsion等人，2002；等人，1999)。该复合体充当了模板，用于引发病毒基因组的转录和复制(dortmans等人，2010)，np蛋白是控制这些过程的一个关键因子，其与p蛋白和l蛋白相互作用，或者与自身相互作用(np-np相互作用)。此外，它还公认的是高免疫原性蛋白，因此它已被用作诊断目的抗原(mebatsion等人，2002)。磷蛋白质(p)。它是核衣壳的第二丰富蛋白质，具有250-300个拷贝/病毒体。它的分子量是53000-56000道尔顿，具有1450个核苷酸，这些核苷酸编码了有395个氨基酸的蛋白质(locke等人，2000)。它的氨基端基充当了保护性结构，防止np蛋白质不受控地封装非病毒rna(curran等人，1995；mebatsion等人，2002)。与在其他副黏病毒中一样，p基因mrna的编辑会在转录过程中通过在484位置添加鸟嘌呤“g”残基而改变，这产生了替代的orf，作为其结果，产生了至少一种另外的病毒蛋白质，称作“蛋白质v”(mebatsion等人，2003；mebatsion等人，2001；等人，1999)，据推测存在着称作“w”的第二蛋白质，(如其他副黏病毒中那样)，但是它的存在对于ndv尚未证实(steward等人，1993)。最近已经研究了v蛋白的功能多样性，显示它参与转录、合成、组装和病毒传播(mebatsion等人，2001；steward等人，1993)。还证实了v蛋白对于病毒复制来说是必不可少的，并且与致病性有关，因为它影响干扰素的应答和被感染的细胞中的细胞凋亡(mebatsion等人，2003；mebatsion等人，2001；peeters等人，1999)。基质蛋白(m)ndv的m基因的长度为1241nt，其编码非糖基化蛋白“m”(或者基质)，基质蛋白的分子量是38-40kd。该蛋白质形成了周围骨架或者基质，内部包覆膜包膜，当与整合膜蛋白的细胞质尾区、脂质双层以及核衣壳相互作用时保持病毒体结构。它在释放受感染细胞的病毒体中起到了关键作用，因为它被认为是病毒形态发生的中心组织者，因为它的自缔合和它与核衣壳相互作用的亲和力是组装病毒粒子的驱动力。膜糖蛋白病毒包膜由来源于宿主细胞质膜的脂蛋白膜组成，并且通过引入下述病毒跨膜蛋白而改变：凝血素-神经氨酸酶(hn)和融合蛋白(f)，二者均在病毒外表面形成凸起(huang等人，2004；li等人，2005)。f作为三同聚体存在于病毒表面上，而蛋白质hn以其四聚体形式存在(lamb等人，2006；li等人，2005；mirza等人，1994)。融合蛋白(f)f蛋白(或者融合蛋白)是1型跨膜糖蛋白(lamb等人，2006)，其最初合成为失活的生物前体，称作f0，由553个氨基酸组成。为了具有生物学功能，f0须在特定切割位点被宿主细胞蛋白酶分开，从而形成称作f1和f2的两个亚基(大致分子量分别是55及12kda)，它们通过二硫桥键保持结合在一起(knipe，2013；li等人，2005)。已经发现f蛋白形成三同聚体，并且引导了病毒膜和宿主细胞的质膜之间的融合(li等人，2005)。作为这种融合的结果，核衣壳可以释放在细胞质中，从而开始了病毒的复制周期。随后，表达在质膜中的融合蛋白会在不同的相邻细胞之间产生融合，形成合胞体或者多核巨细胞，是导致活体内组织坏死的细胞病变作用，是病毒传播的一种可能的机理。凝血素-神经氨酸酶(hn)。hn是ii型跨膜糖蛋白，其n-末端曝露于细胞质，而c-末端位于内膜腔室的内腔中。它是具有血细胞凝集和洗脱活性的一种多功能酶(murphy等人，1999)，负责病毒颗粒与宿主细胞的唾液酸受体的结合(lamb等人，2006)。它还可以作为神经氨酸酶，因为它可以移除这些受体来防止凝集(huang等人，2004)。不同的分离的ndv的hn序列表明，依照这种基因的开放阅读框内的终止密码子的位置，可以产生三种不同的蛋白质凝血素-神经氨酸酶的基因型。因此，在翻译期间，可以合成577或者571个氨基酸的616个蛋白质。长度是不同的ndv毒株毒力的重要因素(等人，2003)。616个氨基酸蛋白质被合成为一种称作hn0的无活性生物前体，其需要蛋白水解加工来激活(garten等人，1980；hironori等人，1987)，而那些具有577或者571个氨基酸的蛋白质不需要通过片段化来进行功能化，其存在于大多数ndv毒株中，包括弱毒型，中等毒性型和强毒性毒株(等人，2003)。但是，重要的是要注意由具有较短orf(571氨基酸)的hn基因合成的蛋白质仅仅在一些强毒性毒株例如miyadera和herts中发现，而无剧毒毒株如queensland，ulster和d26的特征在于具体产生了616氨基酸蛋白质(等人，2003)。l蛋白或者rna依赖性rna聚合酶。基因l，它的长度为6704nt，具有6个高度保守的区域，其被认为对于聚合酶的酶活性是必须的(poch等人，1990)，其是最保守的病毒基因之一，并且最后一个被转录(locke等人，2000；seal等人，2000)。它的产物l蛋白是一种多肽，其分子量为242kda(poch等人，1990)。它是最大的病毒蛋白质，但也不太丰富，并且与蛋白质p结合，构成活性病毒聚合酶(dortmans等人，2010；locke等人，2000；wise等人，2004)。细胞感染周期感染周期开始于病毒与宿主细胞表面的结合。这种结合是由于细胞表面上特定受体的识别而发生的，其特征在于曝露唾液酸部分，其与hn蛋白相互作用(dortmans，2011；huang等人，2004；lamb等人，2006)。感染的第二步是通过蛋白质f介导的，其负责通过诱导病毒和细胞膜之间的融合而使得病毒透过(li等人，2005；white等人，2008)。与hn配体的结合触发了构象变化，其进而引起f蛋白的打开并触发了肽融合。因此，f和hn共同作为蛋白质组装体，在精确的时间和地点引导融合(white等人，2008)。在ndv中，已经提出hn结合到配体上是导致触发它的两个二聚体之间的重排的一个原因，其中曝露了与唾液酸结合的第二位点，没有唾液酸活性，这是在蛋白质结晶学分析后发现的(white等人，2008)。该新形式延伸了二聚体之间的表面，表明其与hn的结合释放f，因此能够触发融合。第二hn受体位点保持所述膜具有足够的邻近度，因为存在于第一位置中的神经氨酸酶活性不存在于第二位置中，其能够释放受体蛋白并从空间上避免了一层膜与另一层膜的分离(white等人，2008)。作为这种融合的结果，该核衣壳可以在细胞质中释放并启动病毒复制周期，这种机理与ph无关，虽然已经观察到它可能在融合过程通过细胞内吞途径进行时变得依赖，如使用其他副黏病毒那样，其中该ph是关键，以便促进所述融合(cantín等人，2007；sanromán等人，1999)。在两种膜之间的这种融合过程之后，含有np包封的rna基因组和与包含p和l蛋白的聚合酶复合物相连的核衣壳(等人，1999)进入细胞质并开始转录来产生合成病毒蛋白质所必需的mrnas。聚合酶络合物结合到核衣壳是通过蛋白质p介导的，而催化活性是蛋白质l的功能(dortmans，2011)。在这个整个过程中，rna保持与np蛋白结合，并且仅仅mrnas(其编码了病毒的蛋白质)保持游离，而不结合到病毒蛋白质上。病毒基因组的复制仅仅在合成的蛋白质的量足够时发生，然后病毒粒子的全部组分被转运到质膜，在这里它们在m蛋白引导下组装。在组装后，病毒通过出芽过程从细胞释放。hn蛋白的神经氨酸酶促进了病毒从细胞上脱离并消除了唾液酸废物以避免自聚集(dortmans，2011)。接种疫苗作为用于新城疫病(nd)的控制策略接种疫苗是全球许多国家的预防措施，并且通过严格的生物安全性测试已经被证实，这是控制nd的最有效方法。对这种疾病进行疫苗接种的原则是众所周知的，以此方式，它寻求刺激免疫应答，其为宿主提供了保护，而没有表现出该疾病的攻击性或者致命性后果(lopez和olvera，2010)。“hitchner”b1(hb1)和“lasota”是世界上最常用的疫苗株，并且虽然自它们开始使用已经过去了50多年，但是仍能保证它们在接种疫苗的禽类的血清中引起高水平的iga，igg，igm和igy，从而提供了针对死亡和更严重的临床症状的保护(borland和allan，1980；russell和ezeifeka，1995；seal等人，2000)。尽管如此，ndv仍然是肉用仔鸡和产蛋鸡群潜在的风险(perozo等人，2006)，因为虽然有密集的疫苗接种程序，但是禽类仍然容易遭受严重的疾病，引起产量的急剧下降(absalon等人，2012；miller等人，2007；rue等人，2011)。众所周知，目前的接种疫苗方案中所用的疫苗的效率受限于全球不同地方的ndv所遵循的进化动力学(diel等人，2012；kim等人，2007；miller等人，2010)。它们必须明显减少病毒的复制和分泌的困难引起了人们对开发疫苗的关注，这些疫苗与野外传播的毒株具有同源的基因型(hu等人，2009b；miller等人，2013)，因为在许多情况中，已经显示出异源基因型疫苗病毒在防止攻击病毒的复制和分泌中是不太有效的(miller等人，2009；miller等人，2007)。由于这样的原因，已经开发了与野外的强毒性基因型同源的疫苗，并且成功地用于因ndv而遭受了严重的经济损失的国家(hu等人，2009a；iasa-investigaciónaplicadas.a.dec.v.)。先天的和特异性免疫应答个体保持不受感染的能力取决于它的天然力量或者先天性免疫以及其在生命中可以形成或者获得的力量(rojas-espinosa，2006)。当生物体接触外部抗原时，免疫系统立即以非特异性方式应答。每个被识别为非该生物体的元素会引起噬菌细胞(中性粒细胞，单核细胞，巨噬细胞)的迁移以捕获所述抗原，将它引入细胞内的隔室并消灭它(rojas-espinosa，2006；wigley和kaiser，2003)。这种机制用于控制生物体所面临的大部分的外部因子。这些非特异性破坏机制的正确运行主要确保了机体的健康。仅当这种非特异性免疫性不足以控制感染过程时，该生物体才将寻求激活特异性防御机制，即那些由细胞介导并识别抗原并对其特异性应答的机制：t和b淋巴细胞(ecco等人，2011；kaiser，2010；wigley和kaiser，2003)。该非特异性和特异性机制在它们之间通过空间和时间共同作用通过细胞之间的直接接触以及通过释放循环介质：两种类型的免疫应答的细胞因子，主要介质和调节剂(ecco等人，2011)。细胞因子细胞因子是具有丰富蛋白质来源和多效性的基团。即，它们是通过多种淋巴细胞和非淋巴细胞来产生的，并且对许多细胞也有一些影响(kaiser，2010；rojas-espinosa，2006；wigley和kaiser，2003)。细胞因子的细胞来源包括单核细胞/巨噬细胞和树突细胞，此外还有t细胞，b细胞，成纤维细胞，中性粒细胞，内皮细胞，引物细胞等。不同的细胞因子的“细胞靶”包括单核细胞和巨噬细胞，t细胞，b细胞，中性粒细胞，淋巴和骨髓系列的造血细胞，纤维原细胞，引物细胞和嗜酸性粒细胞等(rojas-espinosa，2006)。细胞因子效应物包括“靶细胞”的分化，增殖和激活，用于许多配体的细胞受体表达，和多种其他介质的诱导和分泌，包括前列腺素，细胞因子，(生长和分化因子，群落形成-刺激因子)，免疫球蛋白等，以及相同的可溶性受体的释放(rojas-espinosa，2006)。细胞因子作为疫苗佐剂细胞因子已经基于它们的活性和相应的作用产生的细胞而分为若干组。这些组包括白细胞介素(il)，干扰素(ifn)，肿瘤坏死因子(tnf)，转化生长因子(tgf)，抑制迁移因子和趋化因子(kaiser，2010；wigley和kaiser，2003)。整体上，细胞因子参与了免疫应答的诱导，表达，免疫反应的调节和炎症反应的发展和调控。它们在哺乳动物中的作用是公知的，并且大量的公开文献描述了细胞因子的结构和它们在健康和疾病中的作用。虽然鸟类细胞因子开始时在结构和功能二者方面定义不清(kaiser，2010)。但是，近年来，鸟类免疫学和遗传学的进步已经导致发现了鸡，火鸡和其他鸟类物种中的一系列的细胞因子(wigley和kaiser.，2003)。这已经为确定鸟类疾病中细胞因子的水平开辟了广泛的可能性，这允许更好地理解其发病机制和免疫机制(ecco等人，2011)，以及它们作为疫苗佐剂或者免疫调节剂的潜在用途，这激活了所述免疫系统，以使其产生有效和持久的保护(wigley和kaiser，2003)。已经使用免疫调节剂作为疫苗佐剂进行了几个实验研究。一种特别有效的方法是通过重组疫苗；其中将编码相关细胞因子的基因插入病毒表达载体中。其然后被用作疫苗种子(kaiser，2010a；karaca等人，1998；)(wigley和kaiser.，2003)。鸟类细胞因子作为疫苗佐剂的知识和用途提供了对于禽类的免疫应答更好地理解，其允许计划针对影响这些生物的疾病的更有效的控制策略(kaiser，2010a；wigley和kaiser.，2003)。重组疫苗开发具有更好的免疫性和安全特性的疫苗是禽类研究领域的基础重要内容(alexander等人，2004；sawant等人，2011)。在这种情况下，使用构造削弱的强毒株的活疫苗的目的是以可控的方式再现感染和获得类似于自然感染所产生的免疫性。但是，它们的使用可信度受限于免疫缺陷禽类中产生疾病的可能性，或者因为最终削弱的病毒可能恢复它们的剧毒态(rojas-espinosa，2006)。虽然如此，这已经显示了当它接种了一种在系统发育上接近于攻击病毒的毒株接种时，保护作用是增强的(hu等人，2009a；hu等人，2011；iasa-investigaciónaplicadas.a.dec.v.等人)，因为所产生的体液和细胞应答比灭活病毒的疫苗所提供的更强和持续时间更长(absalon等人，2012；cornax等人，2012；miller等人，2007；rue等人，2011)。目前，由于使用重组dna技术，增强疫苗免疫性的可能性已经成为可能，其允许分离一种或多种这样的基因，其用于编码合成一种或多种抗原蛋白。将相关的基因通过分子生物技术插入载体病毒的基因组中。由此得到重组疫苗(lópez等人，2003)。用这些重组病毒接种禽类，导致感染的细胞表达或者合成免疫抗原，并且导致免疫应答(体液和细胞)，该免疫应答类似于针对载体病毒和免疫合成抗原的减毒活病毒的免疫应答(p24,line15-20)(lópez等人，2003)。以此方式，可能的是将表达细胞因子的基因插入病毒基因组(其充当了表达载体)，其作为免疫应答的调节剂起到了非常重要的作用(ecco等人，2011；kaiser，2010；rojas-espinosa，2006；wigley和kaiser，2003)。用疫苗佐剂优化重组疫苗改善接种疫苗刺激的免疫应答的一个策略是诱导和激活所获得的免疫应答的过程中起到基础作用的蛋白质的共同表达(使用疫苗载体)，例如细胞因子(karaca等人，1998；lewis等人，1997)。所述蛋白质加速和刺激了辅助细胞的补充和激活以及诱导免疫应答共刺激剂，加速其开始并使其更快，更强和更持久(alvarado等人，2006.；manrique，2005)。这些蛋白质充当了以不同水平作用的有力的免疫调节剂，这归因于需要开发这样的试剂，其能够选择性抑制或者强化细胞群或亚群，用于免疫应答，例如：淋巴细胞，巨噬细胞，中性粒细胞，nk杀伤细胞和细胞毒性细胞(manrique，2005)。存在着宽范围的细胞因子列表，其已经被用作不同生物体中的疫苗佐剂来增强免疫应答，其中我们可以发现：粒细胞和巨噬细胞刺激因子(gm-csf)，其帮助恢复树突细胞和增强t细胞和b细胞应答。同样，已经使用了许多th1和th2类型的白细胞介素，例如il-12，ifn-γ，il-15和il-18，il-4，il-10和il-13(lewis等人，1997)。具体地，治疗鸟类疾病中所用的免疫调节剂列于表1中，此表重点强调了在产生抗新城疫病毒疫苗中，i型和ii-ifn型和几种白细胞介素的使用(wigley和kaiser.，2003)。该报告表明它们参与了b淋巴细胞和t淋巴细胞的分化和激活以及巨噬细胞的刺激，以及它们在nvd清除之前在调节免疫应答中的作用(ecco等人，2011)。表1：摘自并修改自(kaiser，2003)，其显示了细胞因子作为对抗不同的鸟类疾病的疫苗佐剂的用途；它重点强调了使用ifnα和ifnγ作为抗ndv的分子佐剂的用途。ifnγ在抗ndv的免疫应答中的作用ifnγ是主要的抗病毒的可溶性保护介体之一，因为它几乎在感染开始时(即，在抗体出现前)就从感染的细胞中释放。干扰素抗病毒作用机制尚不完全清楚，但是已经报告了它在不同水平上直接限制了病毒的复制，这归因于它的渗透，剥离，rnam合成，蛋白质合成和病毒颗粒组装(rojas-espinosa，2006)。“生物体外”和“活体内”实验将它引证为一种面临ndv感染时的有力的巨噬细胞诱导体和激活体，这通过调节mhc-ii分子的表达实现的，其改进了特异性抗所述病原体的免疫性(ecco等人，2011)。当该巨噬细胞强力激活时，它们会通过释放溶酶体酶，氧和一氧化氮反应性物质而损坏宿主的正常组织。这些化合物是有效的抗菌剂，其导致病毒复制的抑制(反应性过氧化亚硝酸盐基团)，但是，它们在“me”和侵入的抗原之间不产生任何差别。因此，如果这些产物进入细胞外基质中，它们能够引起组织损坏(ecco等人，2011；rue等人，2011)。同样，已经描述了当刺激尚未感染的细胞中抗病毒蛋白质2'5'-寡腺苷酸合酶和pkr(双链rna依赖性蛋白激酶)的合成时，ifnγ间接防止了病毒复制。该2'5'-寡腺苷酸合酶是合成2'5'-寡腺苷酸的酶，其连接到核糖核酸酶l(rnase-l)上并激活它。该激活的rnase-l降解了病毒rna信使。另一方面，pkr(它的水平因病毒感染的作用增加)干扰了病毒基因组和任何新的感染病毒的复制(rojas-espinosa，2006；rue等人，2011)。il-6在抗ndv的免疫应答中的作用如同ifnγ那样，il-6被认为是抗ndv的免疫应答调节中所包括的主细胞因子之一(ecco等人，2011；)rue等人，2011)。最初时，il-6被确定为t淋巴细胞和b淋巴细胞的分化因子，在其主要功能中，刺激产生抗体是突出的。它的存在目前在局部组织位置中是已知的，释放到循环中面临着几乎全部的稳态干扰情形，其典型地包括内毒血症，外伤和病原体诱导的细胞内慢性急性感染(wegenka等人，1994)。它在先天的免疫应答的初始阶段是特别重要的，补充和激活白细胞，并且为应对病毒感染而采取适当行动做好准备。它通常与其他促炎细胞因子如tnf和il-1一起诱导，这些细胞因子是引起肝脏中急性阶段反应所必需的；其包括发烧，肾上腺酮释放和肝脏产生蛋白酶抑制剂-蛋白质，其起到了抗病原体的保护作用(wegenka等人，1994)。此外，它已经被描述为是一种有力的巨噬细胞、成纤维细胞细胞和内皮细胞激活剂。它改进了脉管通透性并刺激了炎症细胞聚集到所影响的位置(ecco等人，2011；)wegenka等人，1994；wigley和kaiser.，2003)。在这个意义上说，在接种疫苗过程中将细胞因子作为佐剂给药的结果好于单独使用疫苗的效果。发明目的因此，本申请的一个目的是设计和构造重组新城疫病毒疫苗(recombinantnewcastlediseasevirusvaccines，rndvs)，其具有插入的非其基因组的转录单位，该转录单位编码细胞因子类型的免疫调节蛋白(ifnγ或者il-6)的合成。另一目的是证明本发明的rndvs在施用了该相应的重组病毒的禽类体内诱导细胞因子例如ifnγ或者il-6的表达。本发明的另一目的是证明这些重组病毒增加了对禽类的保护。本发明的另一目的是证明rndv疫苗明显降低了已免疫的禽类在被强毒株“ndv-p05”攻击时分泌在体内的病毒载量。两种重组疫苗降低病毒分泌的效果归因于插入rndvs基因组中的另外的基因所合成的细胞因子的作用。这是由于两种蛋白质都具有靶定和增强宿主免疫应答以及促进有效的体液应答和细胞应答的能力，这影响了抗体的同种型和亲合力，最终导致更大量的病毒粒子的中和。本发明的另一目的是减少接种疫苗/感染过程之后的病毒分泌。理想的是病毒在其死亡后不分泌，但是，这种过程是在疾病缓解后6天中发生的，为此，本发明能够减少疫苗病毒和病原体病毒的分泌，以及减少动物曝露于分泌病毒的时间，来减少动物的感染过程——由于曝露于病原体或者疫苗剂的时间较短，这将解决健康动物问题和将降低由于损失动物带来的经济成本。本发明的另一目的是将重组新城疫病毒疫苗施用于禽类以在接种疫苗几周后提供保护以对抗除了新城疫病毒之外的其他病毒感染，这些感染可以由例如禽流感病毒引起。这样的保护是通过增加了接种疫苗后几周内禽类体内的干扰素和/或白细胞介素-6的水平建立起来的，甚至不存在重组病毒时也是如此。本发明的另一目的是，即使在重组病毒分泌后，依然在接种疫苗后6周内增加细胞因子的水平。本发明的另一目的是通过rt-pcr(reversetranscriptionpolymerasechainreaction，反转录聚合酶链反应)识别具有特异性寡核苷酸的重组病毒，以确定禽类群是否含诱重组病毒或者天然病毒并且因此诊断可能的疾病或者排除假阳性。技术实现要素：为了实现本发明的目的，构造重组新城疫病毒(rndv)来用作从质粒载体表达免疫调节剂(细胞因子)的病毒载体，其将允许将异源基因(细胞因子)插入病毒的p基因和m基因之间，因为已经报道了在p基因和m基因之间引入的异源基因具有高水平的表达(nakaya等人，2001；zhao等人，2014)。该构建过程是基于命名为poltv5的低拷贝数转录载体进行的，其中通过叠加先前逆转录-聚合酶链反应(rt-pcr)产生的亚基因组片段克隆了两个毒株(独立构建体)的全长cdna。。本文公开的重组病毒源自低毒的天然毒株“lasota”，并且另一种源自重组毒株precp05，precp05经过遗传修饰以在f蛋白切割位点改变氨基酸序列，这使得用precp05构建的病毒成为减毒低毒的病毒。分别构建表达免疫调节蛋白干扰素γ(infγ)和白细胞介素6(il-6)的重组病毒，将其施用于禽类，因产生了干扰素γ或者白细胞介素-6，引起了对体液免疫应答和细胞免疫应答的刺激，还增强了先天免疫应答和特异性免疫应答。这样的病毒对应于nvd-ls+ifn和nvd-p05+ifn。此外，这些重组病毒在面临用野生株的攻击时对抗死亡率提供了100％的保护。另一方面，发明人证明了用本发明的病毒对禽类接种疫苗达到了有效降低分泌到环境中的攻击病毒的粒子量的效果。量化了攻击病毒的分泌病毒载量的对比研究显示“lasota”以及rndv都是通过泄殖腔分泌至第5d.p.v(post-vaccinationday，接种疫苗后天数)以及通过空气分泌到第3天，但是重组株使之达到了一个较小的程度。降低病毒分泌的效果归因于通过rndv合成的ifnγ。这归因于ifnγ靶定和增强宿主免疫应答的能力，以及促进有效和持久的体液应答和细胞应答的能力，最后影响更大量的病毒粒子的中和。此外，发明人证明了用本发明的病毒接种禽类实现了强化禽类的免疫系统，提高了禽类的对其他病原体例如禽流感病毒的免疫应答，这是在接种疫苗后长时间内提高了干扰素γ或者白细胞介素-6的水平的结果，甚至在不存在这些重组病毒时，在接种疫苗后数周依然具有提高的ifnγ水平。另外，发明人已经设计和开发了特异性寡核苷酸体外或者离体识别本发明的异源重组病毒，因为它们使用rt-pcr选择性放大了包含异源基因插入位点的侧翼序列，以确定是否禽类群体包含本发明的重组病毒或者是否包含一些天然病毒，来确定是否该禽类群体已经进行了免疫。附图说明图1.新城疫病毒方案，其表示了作为其结构的一部分的蛋白质。图2.重组质粒图，其含有“lasota”株(pndvls)的全基因组的dnac。图3.pbnandvii质粒图，其中可以看到通过限制性内切酶nrui所识别的新位点，其是通过pcr定点突变产生的。图4.paendv2chifnγ质粒图，从其开始进行实验工作，这包括具有区域基因端的序列，基因间序列和基因开始(分别为ge，igs，gs)，其侧接所述基因，这合成了免疫调节蛋白ifnγ(干扰素γ)。全部相关区域是通过swai限制位点策略性界定的，这允许它提取，最后将它在表达载体中克隆。图5.重组质粒图，其含有“ndv-p05”株(precp05)的全基因组的dnac。图6.在df-1细胞中的ifn-γ表达。df-1细胞上清液的蛋白质免疫印迹，其中检测了ifn-γ的表达。泳道1，分子量标记剂。泳道2，未感染的df-1细胞。泳道3，用ndv-p05+ifn病毒感染的df-1细胞。ifn-γ蛋白质的分子量是大约17kda。图7.在vero细胞中的ifn-γ表达。vero1细胞上清液的蛋白质免疫印迹，其中检测了ifn-γ的表达。泳道1，未感染的细胞(对照)。泳道2，lasota病毒感染的vero细胞(moi0.1)。泳道3，用ndv-ls+ifn-γ感染的vero细胞(moi0.1)。泳道4，用ndv-ls+ifn-γ感染的vero细胞(moi1.0)。17-kda蛋白质处于矩形框中。图8.通过酶联免疫吸附测定(elisa)在接种禽类血清(a和b组)和未接种(c组)中的ifnγ量化。该图显示了用重组ndv-ls-ifn疫苗免疫的禽类中ifnγ的逐渐增加，而用lasota病毒免疫的禽类和没有免疫的那些在6周的监控中表现出最小的ifnγ水平。图9.接种疫苗后3天内脏中大的损伤的对比分析。a：用重组ndv-ls+ifn疫苗免疫的禽类。b：用lasota疫苗免疫的禽类。c：对照组，没有免疫的禽类。图10.接种疫苗后5天内脏中大的损伤的对比分析。a：用重组ndv-ls+ifnγ疫苗免疫的禽类。b：用lasota疫苗免疫的禽类。c：对照组，没有免疫的禽类。图11.接种疫苗后7天内脏中大的损伤的对比分析。a：用重组ndv-ls+ifnγ疫苗免疫的禽类。b：用lasota疫苗免疫的禽类。c：对照组，没有免疫的禽类。图12a和12b：使用新城疫病毒基因型v进行攻击的存活率评价。所述禽类是用两种不同的病毒ndv-ls+ifnγ病毒和lasota病毒(图12a)和ndv-p05-ifnγ和lasota病毒(图12b)接种的，在两个图中，所述禽类是用异源基因型v病毒进行攻击的。所述禽类是在接种疫苗后三周用致命的新城疫病毒进行攻击的，并且在14天内监控其存活率。图13a和13b.接种禽类的攻击病毒分泌。所述禽类是用ndv-ls+ifn病毒或者lasota病毒接种的，并且具有未接种的对照组。在免疫后3周，将它们用异源新城疫病毒，基因型v进行攻击。在攻击后3，5和7天样品用气管(图13a)和泄殖腔拭子(图13b)进行取样。攻击病毒的滴度是通过实时pcr进行的。图14.使用新城疫病毒基因型v的攻击的存活率评价。所述禽类是用两种不同的病毒ndv-p05+ifn病毒和lasota病毒接种的，并且用基因型v病毒进行攻击。所述禽类是在接种疫苗后三周进行攻击的，并且在14天内监控其存活率。图15a和15b.接种禽类的攻击病毒分泌。所述禽类是用ndv-ls+ifn病毒或者lasota病毒接种的，并且具有未接种的对照组。在免疫后3周，将它们用异源新城疫病毒，基因型v进行攻击。在攻击后3，5和7天样品用气管(图15a)和泄殖腔拭子(图15b)进行取样。攻击病毒的滴度是通过实时定量pcr进行测定的。图16.在下面的组中，在接种疫苗之前(接种疫苗前)和攻击之前(攻击前)，抗禽流感病毒h7n3的特定抗体滴度：组1(ndv-ls+ifn)；组2(emulsiónh7n3)；组3(ndv-ls+ifn+h7n3乳剂)和组4(对照)。图17.用强毒a型流感病毒进行攻击的禽类存活率的评价。禽类是用不同的疫苗接种的：ndv-ls+ifn，用ndv-ls+ifn+h7乳剂双接种，h7乳剂和未接种的对照组。禽类在接种疫苗后3周用流感病毒进行攻击，并且在14天内监控其存活率。图18a和18b.接种的禽类中攻击病毒的分泌。所述禽类是用ndv-ls+ifn病毒+h7n3乳剂、h7n3乳剂、ndv-ls+ifn接种的，并且具有未接种的对照组。在免疫后3周，将它们用异源新城疫病毒，基因型v进行攻击。在攻击后第3、5、7天样品用气管(图18a)和泄殖腔拭子(图18b)进行取样。攻击病毒的滴度是通过实时定量pcr进行的。具体实施方式本发明包括不同的新城疫病毒，这些新城疫病毒是通过反向遗传学和分子生物技术构造的，具有表达原鸡种的干扰素γ基因(ifn-γ)和白细胞介素-6基因的能力。本文所述的重组病毒包含分子信号，这些分子信号允许通过新城疫病毒的依赖于rna的rna聚合酶转录ifn-γ基因的信使rna。另外，它包含分子信号，该分子信号允许它在真核细胞中翻译成完整而活性的ifn-γ蛋白。该重组病毒包含这样的序列，其编码新城疫病毒的np、p、m、f、hn和l蛋白中的一种或多种，其可用于开发活疫苗并且还可以作为载体引入其他类型的异源病毒的蛋白质(wo99/66045)。实例1.基于lasota株构建表达ifn-γ的重组病毒(ndv-ls-ifn)基于lasota株的重组病毒的构建是通过反向遗传学方法来进行的(peeters等人，1999)。为此，通过rt-pcr使用lasota株的克隆的重叠寡核苷酸扩增了8个片段。这8个片段被克隆岛自主复制质粒中，并且随后使用限制酶和分子克隆酶来键合，直到获得病毒的完整基因组(图2)。同时，构建了这样的质粒，其含有lasota株ndv基因组的apai-noti片段，该片段称作pndvapa-not。使用这种质粒作为模板，使用phusionsite-directedmutagenesiskit(phusion定点突变试剂盒)系统(thermoscientific(赛默科技))进行了定点突变以在ndv的p基因的非编码区5'(ncr)产生nrui酶的限制酶切位点，该p基因在病毒基因组的负链中编码。用nrui限制位点所获得的新质粒称作pndvanii(图3)。另一方面，构建了这样的质粒，其含有用于ndv的rna聚合酶的转录始点(gs)和终点信号，被充当基因间序列(ig)的核苷酸分开。此外，这种质粒包括限制酶的识别位点，允许在病毒基因组的负链的5'ncr区域中克隆基因。所有这些合成序列通过nrui酶的两个限制位点键合。含有合成序列ge-ig-gs的质粒称作paendvii。使用质粒paendvii，克隆了编码鸡干扰素γ(ifn-γ)(原鸡)的基因，获得了paendvifn(图4)。随后，paendvifn质粒的nrui片段克隆在质粒pndvanii的限制位点，以形成pndvanifn。最后，质粒pndvanifn用apai-noti以双酶切消解，并且克隆到质粒pndvls。所获得的重组病毒的核苷酸序列对应于seqidno.2，所述病毒的长度是15780个碱基，并且包含编码用于原鸡种的ifnγ(chiifn-γ)的异源基因。为了拯救病毒将质粒pndvifnγ、pnp、pp和pl的转染在事先用痘苗病毒mva-t7安卡拉感染的细胞系hep2中。在转染后，将细胞在加入了5％胎牛血清的mem培养基中维持72小时，并且在37℃/5％的co2下培养，直至分析。72小时后，使用该转染的细胞的上清液来接种9日龄的无特定病原体(specificpagthogenfree，spf)鸡胚胎。4天后，收集尿囊液，并且用5％鸡红血球进行血凝试验(hemagglutinationassay，ha)分析来确认病毒的存在。实例2.基于基因型vndv病毒构建表达ifn-γ的重组病毒(ndv-p05-ifn)基于属于ii类并且特别是基因型v和亚子基因型vb的ndv骨架，设计了表达编码ifn-γ蛋白质的基因的第二种重组病毒。这种重组病毒是使用病毒序列apmv1/chicken/mexico/p05/2005作为模板100％通过化学合成构建的。称作a/synthetic/recp05-ifn/2013(简称p05-ifn)的重组病毒骨架获自3个大约5-6kb化学合成的双链dna的片段，这三个片段被克隆在质粒中，产生了precp05-h1、precp05-h2和p05-h3。互补dna形式的合成病毒的骨架可被用作载体，用于将同源或者异源基因插入ndv。合成重组病毒的构建如图5所示是通过使用限制酶和结合酶组装三个合成片段来达到的。这种重组病毒的核苷酸序列对应于seqidno.1，所述病毒的长度是15780个碱基，并且包含编码原鸡种的ifnγ(chiifn-γ)的异源基因。该病毒的回收根据实施例1的方案进行。实例3.评估重组病毒ndv-ls-ifn和ndv-p05-ifn中的ifn-γ的表达一旦在鸡胚胎中获得了两种重组病毒，则我们接下来证明两种病毒都具有表达编码在病毒基因组的干扰素-γ(ifn-γ)基因的能力。为此目，使用df-1细胞培养基和vero细胞(非洲绿猴肾细胞)培养物进行了蛋白质免疫印迹(westernblot)试验。df-1细胞是鸡胚胎纤维原细胞，不表达ifn-γ。vero细胞是绿猴肾上皮细胞，不表达鸡ifn-γ基因。两种细胞系都容易被新城病毒感染。将df-1细胞曝露于两种处理下，第一烧瓶用ndv-p05+ifn病毒感染，而另一烧瓶没有感染，以验证所用df-1细胞不表达chifn-γ。将该细胞培养60小时，以允许蛋白质的表达，并且取样上清液。我们的结果证实了只有用疫苗病毒ndv-p05+ifn感染的烧瓶中的样品表达了ifn-γ。鉴定出大约17kda的蛋白质，如可在图6所示的蛋白质免疫印迹中看到的。在第二实验中使用了vero细胞。将该vero细胞曝露于三种处理下，第一烧瓶用ndv-p05+ifn病毒感染，第二烧瓶仅用单独的lasota病毒感染，并且另一烧瓶没有感染，以验证所用的vero细胞不表达ifn。将该细胞培养40小时，并且取样上清液。将vero细胞上清液的样品进行蛋白质免疫印迹试验来鉴别上清液所含的chifn-γ，如图7所示。所获得的结果证实了用疫苗病毒ndv-ls+ifn(moi1.0)感染的烧瓶中的样品表达了chifn-γ，如可在图7的泳道4中看到的。这种蛋白质确定为大约17kda的蛋白质。另外，每种处理的样品都通过实时rt-pcr使用相应的寡核苷酸来评价chifn-γ信使rna的量。我们的结果说明未感染的vero细胞对于新城以及chifn-γ均为阴性。另一方面，用lasota病毒感染的烧瓶仅仅对于新城疫病毒是阳性的(滴度1.234×109拷贝数/ml)。最后，用ndv-ls+ifn病毒感染的烧瓶对于新城(滴度1294×109拷贝数/ml)和chifn-γ(滴度1.754×108拷贝数/ml)都是阳性的。这些结果示在表2中。这些实验证实了所述基因存在，即，存在到17kda蛋白质的转录和翻译，这是通过抗chifn-γ抗体确认的。表2.在未感染的、用lasota病毒感染的以及用ndv-ls+ifn病毒感染的vero细胞样品中通过实时rt-pcr测量的chifn-γ信使rna的滴度。根据图6、7的免疫印迹所示的结果，这些结果总的说明了，在ndvlasota株和p05株中引入的编码chifn-γ的异源基因编码了对应于鸡干扰素γ的大约17kda的蛋白质。另一方面，这些结果标明用所述的重组病毒转染的细胞将相当大量的鸡干扰素γ分泌到细胞外培养基中，这示于图7中获自vero细胞上清液的结果。另外，该实例在无组成型表达鸡干扰素γ的细胞模型中证实了“体外”chifn-γ表达是ndv-ls-ifn、ndv-p05-ifn重组异源病毒感染的结果。实例4.评估接种疫苗的禽类体内ifnγ的存在在这个实例中，我们接下来测定在原鸡体内ifn-γ的“活体内”表达。为此，我们使用了40只3周龄的无特定病原体(spf)轻型禽类。分生了3组。组1是未接种的(阴性对照)，组2是用lasota株病毒接种以确定ifn-γ是由这种疫苗株诱导的，组3是用重组病毒ndv-ls+ifn接种的。在接种疫苗后进行了6周的监控，并且使用elisa测试来量化接种的禽类的血清中ifn的量。图8的结果说明含有重组病毒ndv-ls+ifn的疫苗引起了宿主体内ifn-γ的增加，接种疫苗后第二周出现重大增加。用ndv-ls+ifn接种的禽类在6周的实验过程中表现出ifn-γ浓度的增加。在第2周，记录到用ndv-ls+ifn接种的禽类体内ifn-γ浓度的明显增加。这种增加在6周的监控过程中持续很高，虽然在第4周记录了一次下降。但是，明显的是，从第2周开始，用ndv-ls+ifn病毒接种的禽类的ifn-γ浓度高于用lasota病毒接种的禽类和未接种的禽类。在用lasota病毒接种禽类的情况中，ifn-γ表达存在着不规律的表现，在4周后有一个峰值，这个峰值仍然低于用ndv-ls-ifn病毒接种的禽类的ifn-γ值。在未接种禽类的情况中，ifn-γ的产生是逐步下降的，直到在接种疫苗的6周后达到接近0的值。这清楚显示在图8中。从这些结果可以推断出，用重组病毒ndv-ls-ifn接种疫苗的禽类干扰素γ水平持续升高至少6周，而用lasota病毒接种的禽类或者未接种的禽类则不是这种情况。重要的是要记住出现了病毒的分泌——无论重组的还是病原体的——到接种疫苗后或者感染后第7天出现最大值，所以在本发明的重组病毒的情况中，应当会预期ifn-γ的表达应当在感染后第6天减少。但是，从图8所示的实验中可以推断出在这个实验的后几周(接种疫苗后4-6周)，在禽类血清样品中ifn-γ的存在不是因为病毒的存在，因为攻击病毒的分泌是发生在感染后3-7天内(如下面将在实例5、6、7中看到的)；这个结果是出人意料且新颖的，因为不是inf-γ水平因重组病毒水平的下降而下降，我们发现禽类体内inf-γ组成型表达增加，这种增加直到这个实验结束还保持不变。在用lasota病毒接种的禽类体内是不存在该效果的，虽然疫苗病毒真的诱导了禽类体内的inf-γ表达，但是在第4周这种细胞因子的量显著降低到未接种的禽类的水平上。这毋庸置疑的表明，出人意料地，重组病毒ndv-ls+ifnγ能够诱导禽类体内ifn-γ的组成型表达。这意味着在肉用仔鸡的情况中，inf-γ的表达维持在该禽类的整个生命中，其将在该禽类留在农场中的整个生命区间中诱导免疫保护，因为肉用仔鸡的平均寿命是5-6周，因此，可以推断出该禽类于它们在农场的整个生存期间维持了inf-γ形式的细胞免疫应答。实例5.评估lasota重组疫苗(ndv-ls+ifn)在本发明的另一实例中，ndv-ls-ifn病毒——其构建如实例1所述——用作形成“活”冻干疫苗的种子，并且评价了其在新城疫病毒的高毒性株的攻击下的保护力。该冻干疫苗配制为最终浓度是1x106病毒粒子/剂。这个实验使用了3组禽类，每组包含22只。组a是用ndv-ls-ifn病毒接种的，组c是用lasota株接种的，组d是未接种的。这些禽类中，每组有9只在接种疫苗的第3、5、7天(每天3只)被宰杀以评估疫苗病毒导致的淋巴器官和气管的损害。另外，每组有另外3只在攻击后的第5天被宰杀以评价攻击病毒引起的内脏损害。每组其余10只用于测量攻击后的存活率。评价禽类接种疫苗后的效果为了评估疫苗病毒引起的病变，在接种疫苗后第3、5、7天取样禽类的淋巴器官和气管(图9，10和11)。这个实验使用了3组禽类，每组含有9只。组a是用ndv-ls-ifn病毒接种的，组b是用lasota株接种的，组c是未接种的。图9中的图像显示，与对照禽类(未接种的)和用lasota病毒接种的禽类相比，免疫后3天，在接种的禽类体内没有检测到病变。唯一值得注意的差异是用ndv-ls+ifn病毒接种的禽类通常表现出胸腺扩大；这可能归因于重组病毒本身产生的高干扰素-γ浓度。表3示出了代表图9、10、11的数据的汇总，其中病变发现于分别应用了处理a、b和c，ndv-ls+ifn-γ疫苗、lasota病毒和未免疫的禽类的体内。表3.在接种疫苗后第3、5、7天内脏器官中宏观病变(macroscopiclesion)的对比分析。a(ndv-ls+ifn-γ疫苗)，b(lasota病毒)和c(未免疫的禽类)。符号(+)表示在所评估的组织中存在一些损害。汇总图9、10、11。这些结果表明重组病毒ifn-ls-ndv在接种后没有引起宏观病变，所以该病毒是安全的，因为它没有在接种的禽类体内引起任何病变。实例6.评估ndv-ls+ifn疫苗对于使用强毒新城病毒的攻击的保护力在这个实例中，发明人证明了疫苗病毒ndv-ls+ifn产生保护对抗新城异源病毒攻击的能力，该新城异源病毒是基因型v、高度致病的。为此目的，评估了受攻击的禽类的存活率和病毒的分泌(图12和表4)。这种实验的包括评估3组，每组10只禽类。组a是用ndv-ls-ifn病毒接种的，组b是用lasota株接种的，组c是未接种的。滴度1x107-1x108diep/ml的两种冻干疫苗施用到几日龄的禽类体内。该禽类在免疫后3周受到攻击。攻击病毒是新城疫病毒强毒株，基因型v，滴度是在30微升中10^6.0diep/ml。该攻击是通过眼途径进行的。图12a和12b显示了禽类对致命新城疫病毒攻击的存活率，观察到用任何疫苗免疫的禽类都在100％的禽类中产生了保护。另一方面，关于病毒分泌，在攻击后第3、5、7天进行了气管拭子和泄殖腔拭子取样。我们的结果表明与用lasota病毒接种相比，当用ndv+ls+ifn接种时，分泌攻击病毒的禽类更少。这在气管拭子以及泄殖腔拭子中都能看到(图13a和13b)。在攻击后第5天，可以看到100％的未接种的禽类和用lasota病毒接种的禽类都分泌了攻击病毒。但是，用ndv-ls+ifn接种的禽累仅有80％分泌了所述的病毒；即，20％受攻击禽类没有分泌该攻击病毒。这是出人意料且非常重要的效果，因为这种重组病毒的优点是降低对于其他禽类的传播。在攻击后第7天，用ndv-ls+ifn接种的禽类仅有70％通过呼吸道分泌病毒，而当它们用lasota病毒接种时80％的禽类分泌攻击病毒；即，我们的疫苗将通过呼吸道分泌病毒的禽类的数量减少了10％。此外，病毒经由泄殖腔的分泌也与在先发现一致，在这种情况下，80％的用ndv-ls+ifn病毒接种的禽类仍然分泌攻击病毒，比用lasota病毒接种的禽类的数量(80％)少了10％。表4显示了在不同的取样日禽类分泌攻击病毒的结果。表4.在第3、5、7天分泌攻击病毒的禽类的数量。从气管和泄殖腔取样。nr＝未进行除了降低分泌攻击病毒的禽类数量之外，ndv-ls+ifn疫苗还降低了分泌的病毒的量，是通过实时rt-pcr使用寡核苷酸seqidno.3和4的寡核苷酸测量的。虽然两种疫苗都相对于未接种的对照组来说降低了病毒的分泌，但是ndv-ls+ifn疫苗减少比lasota疫苗减少得更多。这显示在图13中，从攻击后第3天到第7天，在气管样品和泄殖腔样品中都可以看到。这种降低在攻击后第7天的样品中是统计上明显的。如可以看到的，出人意料地，这些结果证明了用ndv-ls+ifn病毒接种的禽类产生了更好的保护，减少了分泌攻击病毒的禽类的数量和所释放的粒子的数量，因此避免了病毒传播。实例7.评估ndv-ls+ifn疫苗针对强毒新城病毒的保护力在这个实例中，发明人证明了疫苗病毒ndv-p05+ifn(其构建如实例2所述)产生保护的能力以对抗基因型v新城病毒的攻击。为此，评估了受攻击的禽类的存活率和病毒的分泌。该实验设计包括评价3组，每组10只禽类。组a是用ndv-p05-ifn病毒接种的，组b是用lasota株接种的，组c是未接种的。将滴度1x107和1x108diep/ml的两种冻干疫苗施用到几日龄的禽类体内。该禽类在免疫后3周受攻击。攻击病毒是新城疫病毒强毒株，基因型v，滴度为在30微升中10^6.0diep/ml。该攻击是通过眼途径进行的。图14示出了用致命的新城疫病毒攻击的禽类的存活率，该图显示了用任何疫苗免疫的禽类都在100％的禽类中产生了保护。如预期的，未接种的鸟在攻击后第3天到第6天之间死亡。关于病毒分泌，3个评价组中均在攻击后第3、5、7天评价了攻击病毒的分泌。对照禽类是在攻击后第3天和第5天监控的，因为在第7天前产生了100％的死亡率。在用ndv-p05+ifn病毒接种的禽类体内，在攻击后第3天和第5天没有气管分泌或者泄殖腔分泌，在第7天，10只禽类中仅有4只通过气管和泄殖腔途径分泌病毒。此外，用lasota病毒接种的禽类确实是在第三天的取样中内通过气管以及泄殖腔途径都分泌了攻击病毒。用ndv-p05+ifn疫苗接种的禽类比用lasota病毒接种的那些分泌的病毒少。这种减少在攻击后第7天在泄殖腔样品中是统计上明显的，如在图15a和15b中可见的。这个结果可以部分地得到解释，因为疫苗病毒ndv-p05-ifn对于攻击病毒是同源的；即，二者都是基因型v。表5.在第3、5、7天分泌攻击病毒的禽类的数量。从气管和泄殖腔取样。nr＝未进行除了降低分泌攻击病毒的禽类的数量之外，ndv-ls+ifn疫苗还降低了分泌的病毒的量，是通过实时rt-pcr使用seqidno.5和6的寡核苷酸，在攻击后第7天的泄殖腔取样中测量的，并且与通过lasota病毒获得的滴度进行了比较(表5)。这些结果总体上，出人意料地证明了用ndv-p05+ifn病毒接种的禽类比用天然病毒接种的禽类具有额外的保护，并且还防止了攻击病毒传播。实例8.评估ndv-ls+ifn疫苗针对用高致病禽流感病毒h7n3(h7)进行的攻击的保护力在另一实例中，ndv-ls+ifn病毒(其构建如实施例1所述)用作制作“活”冻干疫苗的种子。该冻干ndv-ls+ifn病毒疫苗配制为最终浓度2x105病毒粒子/剂。这个实例证明了面对用禽流感病毒亚型h7n3的强毒株攻击的保护力。该实验设计包括评价4组，每组10个7周龄的禽类。一组是用ndv-ls+ifn病毒接种的，经由眼途径施加一滴。第二组是用配制为30％抗原量的乳化的h7n3疫苗接种的，经由皮下途径施加0.5ml。第三组接受双接种疫苗，一滴ndv-ls+ifn病毒和0.5ml的30％抗原量的乳化h7疫苗是经由皮下途径施用的。第四组未接种而被认为是对照组。在免疫之前，已经使用hi技术确认了这些禽类不具有任何抗流禽感h7n3的抗体(define)。禽类在接种疫苗后观察3周，在这个时间结束时，取血样来评估抗体的存在。随后，全部禽类都经由眼途径用一滴高致病流感病毒亚型h7n3进行攻击，所述病毒调节为107.5diep/ml。在攻击后2周内观察这些鸟，通过实时rt-pcr来测定攻击病毒(禽流感h7n3)的存活和分泌。接种疫苗诱导的血清应答图16和表6示出了在接种疫苗之前和攻击之前禽类血清的结果。该评估是使用禽流感病毒h7n3的hi测试进行的。可以看到的，仅第2、3组(使用了乳化的h7疫苗免疫的)在针对h7n3流感的抗体滴度增加了，而用活ndv-ls+ifn疫苗接种的组保持了与对照组相同的抗体水平。虽然乳化的h7疫苗在激活体液免疫应答中是有效的，但是当它与活ndv-ls+ifn疫苗一起施用时(第3组)这种应答增加了；即，它从log27.8增加到log28.8(表6)，这意味着由于双接种疫苗接使得抗体加倍。这个结果表明活性疫苗增强了乳化疫苗诱导的体液应答，这非常有可能是因为干扰素的生物活性。1滴度以log2的单位表6.对接种疫苗和攻击针对h7n3禽流感病毒的特异性抗体的滴度值。后者是在图16的曲线图和表6的数据中是很清楚的，相对于仅接受活h7n3病毒乳化疫苗的那些禽类，用全h7n3病毒乳化疫苗接种，并在同一天还用“活”ndvp05+ifn病毒进行第二次接种疫苗的禽类体内的抗h7n3病毒的特异性抗体有2倍高。另一方面，已经报道了ifn的功能之一是通过th2途径激活辅助性t淋巴细胞介导的应答。辅助性t淋巴细胞(thelperlymphocytes或者th)在th2途径中的主要功能之一是刺激b淋巴细胞，b细胞负责产生特异性中和抗体。这些细胞(th淋巴细胞)对抗原刺激和对来源于apc(antigenpresentingcell，抗原呈递细胞)的信号做出应答，增殖和产生新的细胞因子，在其中有il-4、il-5、il-6、il-10和il-13白细胞介素。然后，后者也共同刺激对b淋巴细胞的激活来产生抗体。另外，一些细胞因子，例如il-4、il-5、il-6、tgfβ和ifnγ本身，进一步调节了apc所产生的抗体的种类或者同种型(il-4：igg1/ige；il-5/il-4：ige；tgfβ：igg2b/iga：il-6/il-4、ige；ifnγ：igg3/igg2a)，促进了对体液免疫应答(抗体)的刺激(binjawadagi等人，2009；rajput等人，2007；rojas-espinosa，2006；samuel，2001)。评估使用强毒、高致病流感h7n3病毒攻击的存活率禽类的存活结果示出在图17中。最佳处理是双接种疫苗(第3组)，ndv-ls+ifn和h7乳剂，对攻击获得了100％的保护。第二名是h7乳剂组，其中记录了禽类的死亡，从而我们获得了90％的保护(禽类在攻击后第8天死亡)。第三名是ndv-ls+ifn疫苗，在攻击后第7天达到100％的死亡率。最后，对照组在攻击后第6天达到100％的死亡率。在这个实验中，可以了解未接种的对照禽类的死亡率，它们是在攻击后第3天到第6天之间死亡的，而用ndv-ls+ifn病毒接种的禽类是在第3天刀第7天之间死亡的，这表明与对照组相比，用ndv-ls+ifn病毒接种的禽类的死亡率延迟了一天。这显示了干扰素对于高致病h7n3禽流感病毒复制的效果。此外，相比于仅用乳化疫苗处理的禽类，接受双接种疫苗的禽类的10％的保护力差异可以归因于ndv-ls+ifn病毒存在所诱导的抗体浓度的增加，也可能特别是归因于ifn的存在。这些出人意料的发现表明，与应用特异性疾病——例如禽流感——的疫苗相比，用异源ndv-ls+ifn病毒与h7n3乳剂联合接种疫苗的有点是更有效地保护禽类以对抗那些不是由新城疫病毒引起的感染。上述表明本发明的重组病毒可有效保护禽类对抗不同的疾病，提高了动物面对不同类型的病原体时的存活率。病毒分泌减少攻击病毒分泌是接种疫苗时的期望品质。在这个实例中，提出量化分泌攻击病毒(h7n3)的禽类数量以及泄殖腔和气管分泌的病毒粒子的数量。在攻击后第3、5、7天取样。表7示出了气管及泄殖腔二者分泌攻击病毒的禽类的数量。可以观察到，4组禽类，主要通过呼吸道(气管拭子)分泌攻击病毒。表7.在禽类的泄殖腔和气管中攻击病毒的分泌：组1(ndv-ls+ifn)，组2(h7n3乳剂)，组3(ndv-ls+ifn+h7n3乳剂)，组4(对照)。主要的区别体现在泄殖腔拭子样品中，其中分泌病毒最少的禽类是接受了双接种疫苗——ndv-ls+ifn和h7乳剂(第3组)——的组内的那些。这些结果是通过实时rt-pcr技术量化病毒滴度来证实的。这些结果如所预期的，对照组那些未接种的禽类的气管分泌中，在攻击后第3和第5天都具有更高的攻击病毒分泌滴度，在第7天没有数据，因为这些禽类已经死了。用ndv-ls+ifn疫苗接种的禽类(第1组)比未接种的禽类分泌的攻击病毒少。用h7n3乳剂接种的禽类(第2组)比用活ndv-ls+ifn疫苗接种的禽类分泌的病毒少。最后，在攻击后第5天和第7天的样品中，用两种疫苗ndv-ls+ifn和h7乳剂接种的禽类组(第3组)分泌的攻击病毒的滴度都更少。与用乳化的h7n3疫苗所获得的分泌值相比，大约降低了1个对数(log10)，与对照组禽类的分泌相比，大约降低了2-4个对数。这个结果说明了两种疫苗之间的协同效应。这些结果示出在图18a中。另一方面，从泄殖腔拭子样品测量的病毒分泌具有下面的行为。在攻击后第3天，对照禽类比接种疫苗的禽类分泌的病毒多，用ndv-ls+ifn疫苗接种的禽类分泌的病毒较少，滴度分别是6比4.6。在攻击后第5天，接种疫苗禽类的病毒分泌类似于对照组，分泌平均估计是6.8-7.4。在攻击后第7天，可以看到接种了活疫苗ndv-ls+ifn的禽类分泌的病毒粒子少于其他两个接种疫苗的组；比接种了h7乳化疫苗和双接种疫苗(ndv-ls+ifn和h7乳液)的禽类(第3组)分别少1.4和1.3个对数。从图18b呈现的泄殖腔分泌结果，没有观察到活ndv-ls+ifn疫苗与h7n3乳剂之间的协同效应。令人惊讶和出人意料地，观察到与乳化的疫苗相比，单独的活ndv-ls+ifn疫苗进一步降低了攻击病毒的分泌。虽然干扰素抗病毒作用机理不是完全已知的，但是已经报道了它直接限制了病毒在不同水平的复制，因为它渗入与剥离mrna合成、蛋白质合成和粒子组装。此外，已经描述了干扰素通过刺激抗病毒蛋白的合成(甚至在未感染细胞中也是如此)，而间接防止病毒复制。这些蛋白质之一是2',5'-寡腺苷酸合成酶，是一种合成2′,5′-寡腺苷酸的酶，其键合到核糖核酸酶-l(ribonuclease-l，rnase-l)引起它的二聚。活化的rnase-l引起病毒和细胞mrna的大量降解，由此抑制了感染细胞中蛋白质的合成及其凋亡，导致了显著的抗病毒能力。其他蛋白质，例如pkr(doublestrandedrna-dependentproteinkinase，依赖双链rna的蛋白激酶)，其水平通过病毒感染作用而增加，干扰了病毒基因组的复制——无论用任何新感染病毒(samuel2001；rojas-espinoza，2006；binjawadagi等人，2009)。再一次地，证明了本发明的异源病毒有效降低了用不同于新城疫的病原体攻击中所用病毒的分泌时间。这个优点是极其重要的，因为它降低了这些动物感染的可能性，甚至是来自于不同于新城疫的疾病的感染。同样，本发明的异源病毒疫苗不仅可以在新城疫病上保护禽类，而且可以在有着不同的病原体的其他疾病病例如禽流感上保护禽类。本文提及的所有公开文献和专利作为参考引入本发明。从本发明的范围和主旨出发，本领域技术人员能够想到关于本发明所描述的疫苗、病毒和方法的其它调整和变化。虽然已经参考几个具体实施例描述了本发明，但是应当理解要求保护的发明不应当不适当地限于这样的实施例。实际上，对于本领域和相关领域的技术人员来说是显而易见的对本发明所述实施例的改变是处于所附权利要求的范围之内的。参考文献absalon,a.e.,mariano-matias,a.,vasquez-marquez,a.,morales-garzon,a.,cortes-espinosa,d.v.,ortega-garcia,r.,lucio-decanini,e.,2012.completegenomesequenceofavelogenicnewcastlediseasevirusisolatedinmexico.virusgenes45,304-310.afonso,c.,miller,p.,2013.newcastledisease：progressandgapsinthedevelopmentofvaccinesanddiagnostictools.vaccinesanddiagnosticsfortransboundaryanimaldiseases,94.aldous,e.,alexander,d.,2008.newcastlediseaseinpheasants(phasianuscolchicus)：areview.theveterinaryjournal175,181-185.aldous,e.,mynn,j.,banks,j.,alexander,d.,2003.amolecularepidemiologicalstudyofavianparamyxovirustype1(newcastlediseasevirus)isolatesbyphylogeneticanalysisofapartialnucleotidesequenceofthefusionproteingene.avianpathology32,239-257.aldous,e.w.,alexander,d.j.,2001.detectionanddifferentiationofnewcastlediseasevirus(avianparamyxovirustype1).avianpathology30,117-128.alexander,d.,manvell,r.,lowings,j.,frost,k.,collins,m.,russell,p.,smith,j.,1997.antigenicdiversityandsimilaritiesdetectedinavianparamyxovirustype1(newcastlediseasevirus)isolatesusingmonoclonalantibodies.avianpathology26,399-418.alexander,d.j.,aldous,e.w.,fuller,c.m.,2012.thelongview：aselectivereviewof40yearsofnewcastlediseaseresearch.avianpathology：journalofthew.v.p.a41,329-335.alexander,d.j.,bell,j.g.,alders,r.g.,2004.atechnologyreview：newcastledisease,withspecialemphasisonitseffectonvillagechickens.food&agricultureorg.alvarado,a.i.,v.r.tenorio.,a.s.aguilar.,sandoval,a.h.,2006.promesasylimitacionesdelasvacunasgénicas.rev.mex.decienciasfarmacéuticas.37,26-37.ballagi-pordány,a.,wehmann,e.,herczeg,j.,belák,s.,lomniczi,b.,1996.identificationandgroupingofnewcastlediseasevirusstrainsbyrestrictionsiteanalysisofaregionfromthefgene.archvirol141,243-261.z.,bidin,z.,2008.diseasesofpoultry.veterinarskifakultetuzagrebu(facultyofveterinarymedicine,universityofzagreb).binjawadagi,b.,babu,y.h.,sreekumar,e.,2009.immunomodulatoryeffectofrecombinantchickeninterferon-gamma(rchifn-)onspecificandnon-specificimmuneresponsesinchickenvaccinatedagainstnewcastlediseasevirus(ndv).internationaljournalofpoultryscience8,122-127.borland,l.,allan,w.,1980.laboratorytestsforcomparinglivelentogenicnewcastlediseasevaccines.avianpathology9,45-59.cantín,c.,holguera,j.,ferreira,l.,villar,e.,-barroso,i.,2007.newcastlediseasevirusmayentercellsbycaveolae-mediatedendocytosis.jgenvirol88,559-569.carter,g.r.,wise,d.j.,flores,e.f.,2004.aconcisereviewofveterinaryvirology.ivis.cornax,i.,miller,p.j.,afonso,c.l.,2012.characterizationoflivelasotavaccinestrain-inducedprotectioninchickensuponearlychallengewithavirulentnewcastlediseasevirusofheterologousgenotype.aviandiseases56,464-470.curran,j.,marq,j.-b.,kolakofsky,d.,1995.ann-terminaldomainofthesendaiparamyxoviruspproteinactsasachaperoneforthenpproteinduringthenascentchainassemblystepofgenomereplication.jvirol69,849-855.czeglédi,a.,ujvári,d.,somogyi,e.,wehmann,e.,werner,o.,lomniczi,b.,2006.thirdgenomesizecategoryofavianparamyxovirusserotype1(newcastlediseasevirus)andevolutionaryimplications.virusresearch120,36-48.diel,d.g.,dasilva,l.h.a.,liu,h.,wang,z.,miller,p.j.,afonso,c.l.,2012.geneticdiversityofavianparamyxovirustype1：proposalforaunifiednomenclatureandclassificationsystemofnewcastlediseasevirusgenotypes.infection,geneticsandevolution12,1770-1779.dortmans,j.,2011.virulencedeterminantsofnewcastlediseasevirus.dortmans,j.,rottier,p.,koch,g.,peeters,b.,2010.theviralreplicationcomplexisassociatedwiththevirulenceofnewcastlediseasevirus.jvirol84,10113-10120.dortmans,j.c.,koch,g.,rottier,p.j.,peeters,b.p.,2011.virulenceofnewcastlediseasevirus：whatisknownsofar？veterinaryresearch42,1-11.ecco,r.,brown,c.,susta,l.,cagle,c.,cornax,i.,pantin-jackw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