用于治疗椎间盘突出症的方法和组合物与流程
本发明涉及用于治疗或预防哺乳动物的椎间盘突出症的方法和组合物。根据本发明的组合物包含t-细胞活化的抑制剂，所述抑制剂能够抑制cd28-介导的t-细胞的共刺激。所述t-细胞活化的抑制剂优选为包含ctla-4的细胞外结构域本身或其修饰形式的蛋白质，如阿巴西普(abatacept)、贝拉西普(belatacept)、xpro9523和/或asp2408。
背景技术：
人体脊柱由多个堆叠在彼此顶部的椎骨组成。两个相邻的椎骨通过两个椎间关节(或小关节,facetjoint)和椎间盘而彼此连接，它们一起构成运动节段，允许脊柱的弯曲/伸展、侧向屈曲和旋转。脊柱被许多韧带和肌肉进一步稳定。
椎间盘由称为纤维环的外部纤维结构、称为髓核的内部凝胶状核心和将椎间盘连接到两个相邻椎骨的两个软骨终板组成。髓核具有高水含量，在允许运动和吸收轴向负荷方面对其生物力学性质是至关重要的。在老化时，水浓度通常会降低，这是被称为椎间盘退变的现象的一部分。椎间盘退变的其他迹象包括椎间盘高度的降低和纤维环的恶化[1]。
在椎间盘突出中，纤维环的恶化导致其破裂，常常在例如举重中是由于过度的机械应变。破裂使得髓核背侧移位进入椎管或椎间孔。这会对相邻的神经根造成压力，其与下面进一步讨论的化学因素相结合，会引起放射性疼痛。突出最常见于下腰椎，症状通常表现为下腰痛，紧接着是放射性疼痛。整体发病率为1-2％，最常见于中年男性和女性，但年龄跨度从青少年延伸至老年人。值得一提的是，无症状的突出在中年健康志愿者中非常普遍。通常，椎间盘突出的症状在发病后2-4周内自发改善，并且突出最终被再吸收。然而，对于约10％的患者，疼痛变为慢性。在这些情况下，手术是当今优选的治疗选择，在手术中去除对神经造成压力的椎间盘碎片。
长期以来，椎间盘突出症的坐骨神经痛被认为仅由神经根上的机械压力引起，但在过去的三十年中，这被证明是错误的。研究表明仅有压力可引起感觉异常、感觉迟钝或虚弱，但不会引起疼痛[2]，许多实验研究和临床观察表明，疼痛发作需要化学因子[3]。此外，已发现位于神经根上的自体髓核在无压力情况下可诱导结构和神经生理的损伤[4-6]。首先发现在诱导这些损伤中起主要作用的特定化学因子之一是促炎细胞因子tnfα[7]。各种研究表明tnfα是椎间盘突出和退化的病理生理学中的关键因素，并且还有证据表明其他几种促炎细胞因子，如il-1和il-6也很重要[8,9]。已经使用tnf抑制剂对坐骨神经痛进行了临床试验，结果相互矛盾[10,11]。
虽然增加的促炎细胞因子水平被认为在椎间盘突出中很重要，但仍然不清楚是什么原因导致这种增加。实验研究已经在椎间盘中检测到促炎细胞因子[12]，这导致以下假设，即椎间盘突出物中存在的细胞因子是被移位的椎间盘物质细胞产生的细胞因子。其他人已发现细胞因子的水平在移位进入椎管后会增加[13]，这表明突出后有持续的炎症反应，这导致细胞因子的增加。这个假设得到了其他几项研究的支持[14,15]。
一些研究已经证明适应性免疫系统参与椎间盘突出，表明对髓核的自身免疫反应。这种假设得到了健康髓核的无血管性质的支持，因此只要它包含在椎间盘中心，就不会暴露于免疫系统。1988年，pennington等人。在健康的犬椎间盘的髓核中检测出igg[16]。后来的研究已经在人类的椎间盘突出物和退化椎间盘中检测到自身抗体[17,18]，并且实验研究已表明暴露于髓核可以引起t细胞的活化[19]。最近的一项研究还发现椎间盘突出症患者的促炎细胞因子il-6和il-8的血清水平升高，从而提示全身炎症反应。这些细胞因子的高血清水平与包含症状的严重程度和不良的长期预后之间也存在相关性[20]。因此，认识到在椎间盘突出中发生的炎症反应可由对髓核的自身免疫反应引起，但是这种免疫应答的程度和重要性尚未被完全了解。t细胞在椎间盘突出的病理生理学中的潜在参与仅被简要地提出，并且没有尝试确定它们在例如细胞因子产生方面的重要性、椎间盘突出的形态发展中的重要性、或者与临床症状严重程度的相关性。
人类椎间盘突出症的组织学分析发现，突出物不仅包括椎间盘的成分，如髓核(np)和纤维环，还有肉芽组织[21-23]。肉芽组织通常围绕突出的np并且通常也被巨噬细胞浸润，表明np周围的炎症反应。这些研究中的其他常见组织学和免疫组织化学发现为新血管形成和tnf、基质金属蛋白酶3、碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子的表达。大多数这些发现在脱出和游离(sequestrated)的突出物中特别丰富。这些类型的突出物通常比凸起(bulges)和突起(protrusions)具有更大量的肉芽组织[24]。还观察到肉芽组织在年轻患者中更常见[24,25]。然而，尚未发现这些不同的组织学特征可用于预测临床结果[26]。
已经发表了几项关于腰椎间盘突出症大小进展的后续评估。其结果表明比以前对突出的椎间盘所认为的更动态的进展。例如，jensen等人观察到在绝大部分(75-100％)的宽基座(broad-based)的突起、脱出和游离中有自发消退，但在有症状队列的前瞻性14个月随访研究中病灶突起(35％)和凸起(3％)的自发消退则较少[27]。takida等人在有症状的队列中每3个月进行一次mri检查，发现脱出型和游离型的消退率相似，但突起的消退率则较低[28]。他们还发现形态学消退与有利的临床结果之间存在相关性。其他研究未能将形态发展与临床结果联系起来，因此这种相关性仍然是一个有争议的主题。预测自发消退的其他成像特征包括突出组织中的对比度增强[29]和t2加权序列上的高信号强度[30]。
基于上面讨论的数据，已经证明椎间盘突出症的自发消退与突出中的炎症之间存在相关性。几十年来，这已在文献中得到认可、讨论并部分研究。1998年matsui等人提示mmp-1和mmp-3可导致突出的椎间盘细胞外基质降解，并且这与突出物中的炎症反应有关[23]。2009年genevay等人发表了一篇支持这一假说的文章，同时也提出抑制导致mmp-1和mmp-3增加的炎症机制，特别是tnf，可以抑制椎间盘突出物的自发再吸收[31]。2004年kato等人发表的数据进一步支持了这一假设，他们还提出了一种反应级联，其导致椎间盘突出物的自发再吸收[31](图4)。他们提出由椎间盘软骨和巨噬细胞之间的相互作用诱导的炎症产生炎性环境，且tnf的增加通过增加血管内皮生长因子的表达引起血管化增加，这两者都允许更多的巨噬细胞进入突出的组织并因此增加炎症。然后tnf激活并增加mmp’s的表达，导致细胞外基质的降解并因此导致突出物的自发再吸收。这一假设，即炎症是引起椎间盘突出物消退的机制，在最近的文献中也反复提到，无论是在原始论文[32]还是在综述[33]中。鉴于上述关于自身免疫作为椎间盘突出症炎症的驱动因素的假设，可以合理地认为这种自身免疫反应有助于突出的消退。
尾棘中实验性椎间盘穿刺已成为大鼠椎间盘退变的广泛接受模型
[34-37]，但尚未用于椎间盘突出。然而，已经表明腰椎中椎间盘突出导致椎间盘表面出现突出样结节[38]，如穿刺后三周的宏观分析所注意。组织学分析显示，结节主要由肉芽组织组成，其也可见于人椎间盘突出中。有趣的是，椎间盘造影术，即目前临床使用的某项mri研究(其包括将针插入椎间盘)，已经被发现在经历该过程的患者的随访评估中增加退化和突出的患病率
[39]，表明“椎间盘穿刺”在人体内可引起突出。显示结节的形成是由于椎间盘表面存在髓核而不是椎间盘损伤本身引起的。因此，椎间盘突出可能是由于对椎管内相对少量髓核的自身免疫反应而形成的，而不是广泛接受的概念，即当纤维环破裂时髓核简单地背侧移位。
在一项研究中[40]，两种常见的抗风湿药物，英夫利昔单抗(一种选择性tnf抑制剂)和甲氨蝶呤(一种具有广泛作用机制的抗炎药)，在椎间盘穿刺后被给予大鼠。所施用的两种药物均未显示对椎间盘表面的髓核诱导的椎间盘突出样结节的形成有任何影响，表明tnf对于椎间盘突出的形态学形成不是必需的。
t细胞是适应性免疫系统的关键组成部分，且其活化是激活细胞和体液免疫反应的关键第一步。生产性t细胞活化不仅需要通过与t细胞受体(tcr)结合的抗原呈递细胞(apc)呈递抗原，而且还需要apc和t细胞之间的其他表面受体和配体的共连接。该过程通常被称为共刺激。在没有共刺激信号传导的情况下，无论tcr对抗原的亲和力如何，t细胞都保持无反应(无反应性)[41]。
最受认可的共刺激信号之一是cd28、cd80和cd86之间的相互作用[41,42]。cd80/86在apc的表面上表达，且cd28在t细胞的表面上表达。cd80/86与cd28结合，产生强烈的共刺激信号，从而允许t细胞活化。需要对cd80/86和cd28表达的精细调节以允许对微生物的有效细胞和体液反应，同时仍保持对自身的耐受性和预防自身免疫。调节该共刺激信号的另一种机制是通过细胞毒性t淋巴细胞抗原-4(ctla-4)的表达调节。ctla-4在t细胞表面表达并也与cd80/86结合，但与cd28-cd80/86相反，ctla-4-cd80/86之间的相互作用限制了t-细胞的扩增和增殖。因此，ctla-4的表达可被视为t细胞可通过其限制其自身活化的机制，这对于维持自身耐受性尤其重要。
包含ctla-4细胞外结构域的融合蛋白是本领域已知的，例如，来自wo93/000431和wo01/92337，并且已经以名称阿巴西普(abatacept)和贝拉西普(belatacept)开发，它们是包含分别如seqidno：1和2所示的两种单体的二聚体。它们与cd80/86结合，从而阻止t细胞活化所需的共刺激信号。已经描述了阿巴西普(商品名
在本领域中也已知这些药物的修饰形式，其允许对cd80/86的更高亲和力、对cd80/86的不同亲和力特征和/或延长的半衰期。这些属性可以允许更好的功效、更低和/或更少频率的剂量和更少的副作用。这些药物包括但不限于asp2408[43-45]和xpro9523[46]。此类化合物的其他已知实例包括asp2409、xtend-ctla4、m834以及来自野生型ctla4-ig的突变体。所述变体公开于例如us8883971、us8642557、us8629113、us8496935、us8491899、us8445230、us8329867、us8318176、us8283447、us8268587、us8071095、us7794718、wo2011/113019、wo2009/058564、ep2863936、ep2855533、ep2612868、ep2612867、ep2385065、wo2011/113019和wo2009/058564。
可以抑制cd28介导的t细胞共刺激的另一种机制是通过施用抗cd28化合物拮抗剂，其包括但不限于wo2011/101791中公开的fr104[47-49]。
wo00/75659a1，“antibodiestonucleuspulposusindischerniation,diagnostickit,medicalpreparationsandtreatment”涉及治疗椎间盘突出的方法，其通过中和血清抗体对髓核细胞的作用的多种假设方式。发明人没有公开支持在椎间盘突出症的治疗中中和髓核抗体的任何建议方法的功效的实验数据。而且，重要的是，该申请中公开了预防对髓核的体液应答的影响。这不同于本发明，本发明特异性地靶向细胞免疫(即t细胞，通过抑制cd28介导的t细胞共刺激)。此外，发明人未提及对突出的形态的潜在治疗效果。
wo2015/070840a2，“stimulatingboneformationbyinhibitionofcd28co-stimulation”涉及通过施加cd28介导的t细胞共刺激抑制剂来刺激骨形成的方法。在一个实施方案中，该发明涉及通过全身或局部施用提供对cd28介导的共刺激抑制的分子来改善骨移植的各种方法。此外，在进行脊柱融合的背景下讨论了骨移植。椎间盘突出被认为是脊柱融合的可能适应症。脊柱融合术是一种外科手术，旨在连接两个或多个椎骨，目的是防止融合椎骨之间的任何运动，通常减少运动相关的节段性背痛。它涉及骨移植，即用来自患者、供体的骨移植物或人造骨替代物桥接椎骨。在抽空椎间盘后，骨移植物通常被放置在小关节上和/或椎间隙中。手术后，通过骨移植物形成新骨，在融合椎骨之间形成骨连接，从而消除融合节段中的移动。
重要的是，单独的脊柱融合术不是椎间盘突出症的治疗方法。它偶尔作为传统椎间盘突出手术的补充，用于复发高风险和/或明显背痛的患者。此外，本发明人没有要求保护或讨论抑制cd28介导的共刺激对椎间盘突出的病理生理学的任何潜在功效，也没有保护或讨论对椎间盘组织的任何影响。他们描述了一种将骨移植物放置在通常由椎间盘占据的区域中的方法，其目的是实现椎体终板之间的融合。这不应被理解为对椎间盘组织有任何影响，但是他们也提到这种融合的标准程序涉及椎间盘空间的抽空(evacuation)(椎间盘的移除)。
附图简述
图1：通过阿巴西普研究的mri图像的客观测量确定的结节大小。该图显示平均值，其误差条代表+1sd。星号标记统计学显著性差异(*＝p≤0.05，**＝p≤0.01)。
图2：通过对阿巴西普研究的mri图像的主观估计确定的结节大小。该图显示平均值，其误差条代表+1sd。星号标记统计学显著性差异(*＝p≤0.05，**＝p≤0.01)。
图3：在研究终止(第8周)、阿巴西普研究时通过对安乐死和解剖后的宏观分析确定的结节大小。0＝没有结节，1＝小结节，2＝清楚的结节，3＝明显的结节。该图显示平均值，其误差条代表+1sd。用星号表示显著性差异(*＝p＝0.005，**＝p＝0.001)。
图4：kato等人提出的自发再吸收机制级联。当巨噬细胞与椎间盘组织接触后被激活时，炎症反应开始，引起tnf表达上调。tnf诱导血管内皮生长因子(vegf)和mmp’s。tnf还诱导产生纤维蛋白溶酶的纤溶酶原激活物(pa)，其也激活mmp’s。然后mmp负责突出的椎间盘基质的降解，导致自发再吸收。
技术实现要素：
出人意料地发现对cd28-介导的t-细胞的共刺激的抑制剂可用于治疗和预防哺乳动物的椎间盘突出症。根据本发明，抑制cd28-介导的t-细胞的共刺激防止了椎间盘突出的形成；以及引起了椎间盘突出的尺寸减小，因此缓解了神经根的压力。这与先前认为自身免疫有助于自发再吸收的观点形成鲜明对比。此外，抑制cd28介导的t细胞共刺激可减少炎症并因此减少已知对神经根敏化重要的细胞因子。
因此，在第一方面，本发明提供用于在哺乳动物如人中治疗或预防椎间盘突出症的组合物，所述组合物包含t-细胞共刺激的调节剂，如t-细胞活化的抑制剂。本发明使用的术语“治疗或预防”包括(i)预防疾病，即导致疾病的临床症状不发展；(ii)抑制疾病，即阻止临床症状的发展；和/或(iii)缓解疾病，即引起临床症状的消退、改善或消除。
优选地，所述t-细胞活化的抑制剂为蛋白质，其能够结合至cd80/cd86。术语“cd80/cd86”是指蛋白质分化抗原簇80(也称为b7-1)和分化抗原簇86(也称为b7-2)，它们一起作用以引发t细胞。所述蛋白质存在于抗原呈递细胞(apc)上，并提供t细胞活化和存活所必需的共刺激信号。cd80/cd86是t细胞表面上两种不同蛋白质的配体：cd28(用于自身调节和细胞间结合)和ctla-4(用于调节和细胞分离的减弱)。
更优选地，所述t-细胞活化的抑制剂为包含至少一个ctla-4的细胞外结构域的蛋白质(细胞毒性t-淋巴细胞-相关的蛋白质4；也称为cd152(分化抗原簇152))。具体地，所述蛋白质可包含ctla-4的一个细胞外结构域，或优选地，ctla-4的两个细胞外结构域。ctla-4为蛋白质受体，当结合至抗原呈递细胞表面上的cd80或cd86时其传递抑制信号至t细胞。
所述包含ctla-4的细胞外结构域的蛋白质优选为融合蛋白，其包含融合至ctla-4的细胞外结构域的igg的可结晶的片段(fc)区。所述蛋白质可为单体，或优选地，该融合蛋白的二聚体。所述免疫球蛋白g可选自igg的任何亚类(igg1、igg2、igg3和igg4)。优选地，所述igg为igg1。或者，融合蛋白可包含其它免疫球蛋白的fc区，包括iga1、iga2、igd、ige和igm。
所述ctla-4的细胞外结构域优选选自：
(a)具有以下氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列包含seqidno：3或seqidno：4所示的序列；
(b)具有以下氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与seqidno：3或seqidno：4所示的序列至少90％同一性，优选至少95％、96％、97％、98％或99％同一性；
(c)具有以下氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列基本上由seqidno：3或seqidno：4所示的序列组成；或
(d)具有以下氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列由seqidno：3或seqidno：4所示的序列组成。
优选地，所述融合蛋白为包含两个相同或不同单体的二聚体。所述融合蛋白中的单体各自优选选自：
(a)具有以下氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列包含seqidno：1或seqidno：2所示的序列；
(b)具有以下氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与seqidno：1或seqidno：2所示的序列至少90％同一性，优选至少95％、96％、97％、98％或99％同一性；
(c)具有以下氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列基本上由seqidno：1或seqidno：2所示的序列组成；或
(d)具有以下氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列由seqidno：1或seqidno：2所示的序列组成。
如seqidno：1和2所示的多肽分别代表被称为阿巴西普和贝拉西普的融合蛋白的单体。如seqidno：3和4所示的多肽分别代表阿巴西普和贝拉西普中使用的ctla4的细胞外部分。
或者，所述cd28介导的t细胞共刺激的抑制剂是包含对cd28的亲和力和拮抗特性的蛋白质。更具体地，所述蛋白质可包含cd28的单价聚乙二醇化fab'ab拮抗剂，例如fr104。
其它cd28-介导的t-细胞的共刺激的已知调节剂和/或抑制剂包括ab103、抗cd86单克隆抗体aida、bms931699、ctla4igmedexgen、debio0615；rg2077和shk186。而且，所述cd28-介导的t-细胞共刺激的抑制剂可为包含对cd86的亲和力和拮抗特性的蛋白质，如es210或pg140，或对cd80的亲和力和拮抗特性的蛋白质，如idec114、kn018、kn019、maxy30或rhudex。
在本发明的上下文中，术语“包含”不应理解为仅限于所述氨基酸序列，而应理解为开放式含义“包括”或“含有”。因此，术语“包含”不排除具有另外的未记录的氨基酸序列。
序列与参考序列的“同一性”是指当两个序列被比对以获得残基位置之间的最大对应性时相同的残基百分比。更具体地，以百分比表示的“序列同一性”定义为通过在比较窗口上比较两个最佳比对序列而确定的值，其中比较窗口中序列的部分可包括与参考序列(其不包括添加或删除)相比的添加或删除(即，缺口)以用于两个序列的最佳比对。通过确定在两个序列中出现相同氨基酸残基的位置数量来计算百分比，以得到匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中的位置总数并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。除非另有说明，否则比较窗口是所提及序列的整个长度。在这种情况下，最佳比对是由美国国家生物技术信息中心在线实施的blastp算法产生的比对(参见ncbi手册[互联网]，第16章)，其输入参数如下：字长＝3，矩阵＝blosum62，空缺成本(gapcost)＝11，空缺延伸成本(gapextensioncost)＝1。
术语“基本上由......组成”旨在排除实质上改变本发明的基本和新颖特征的那些。因此，具有基本上由seqidno：1至4所示序列组成的氨基酸序列的多肽包括带有诸如取代、小删除、插入或倒位等修饰的多肽，然而这些多肽基本上具有seqidno：1至4所示多肽的生物学活性。
可以设想，根据本发明，可以单独使用适应性免疫系统的其他组分，或者使其彼此组合，或与如上定义的t细胞抑制剂组合使用。这些组分包括，但不限于，各种白介素抑制剂如阿那白滞素、托珠单抗、巴利昔单抗、优特克单抗、kanakinumab、sekukinumab、司妥昔单抗；tnf-抑制剂如依那西普、英夫利昔单抗、阿非莫单抗、阿达木单抗、戈利木单抗、cetrolizumabpegol；钙调神经磷酸酶抑制剂如环孢素或他克莫司；b-细胞抑制剂如利妥昔单抗；或对适应性免疫系统具有作用的其它免疫调节药物，如免疫球蛋白治疗、糖皮质素、甲氨蝶呤、来氟米特、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、环磷酰胺或多西环素。
如上所述，根据本发明使用的组合物可用于治疗或预防椎间盘突出症。术语“椎间盘突出症”和“椎间盘突出”应理解为本领域已知的，参见例如fardon等人[50]。因此，“突出”被广义地定义为椎间盘物质的局部或局限位移超出椎间盘空间的界限。在整个椎间盘周围延伸超出环骨突边缘的椎间盘组织的存在被称为“凸起(bulging)”。基于移位物质的形状，突出的椎间盘可以被分类为“突起型(protrusion)”或“脱出型(extrusion)”。如果在椎间盘空间外部的椎间盘物质的边缘之间的最大距离小于在椎间盘空间外延伸的椎间盘物质的基部边缘之间的距离，则存在“突起型”。基部被定义为在原始椎间盘空间的外边缘处的椎间盘物质的宽度，其中位于盘空间之外的椎间盘物质与椎间盘空间内的椎间盘物质相连。当在至少一个平面中，超出盘空间的椎间盘物质的边缘之间的任何一个距离大于超出盘空间的椎间盘物质的基部边缘之间的距离，或者当在超出盘空间的椎间盘物质和盘空间内的椎间盘物质之间没有连续性时，存在“脱出型”。如果移位的椎间盘物质与母体椎间盘完全失去连续性，则后一种脱出形式最好进一步指定或细分为“游离型”。有关详细信息，请参阅参考文献[50]和其中的附图。
因此，术语“椎间盘突出症的治疗或预防”应理解为包括至少一种，优选两种、三种、四种或五种以下效果：
(i)减少或预防炎症；
(ii)减少或预防椎间盘突出的形成，包括突起型、脱出型和游离型；和
(iii)减少椎间盘突出的大小，包括突起型、脱出型和游离型；
(iv)减少或预防凸起形成；和
(v)减少椎间盘凸起的大小。
在本发明中，术语“减少”旨在包括部分减少，以及完全抑制或消除所述病症。
如上文背景技术部分所述，已发现人椎间盘突出包括各种类型的组织，包括髓核、纤维环、软骨终板和肉芽组织(瘢痕组织)。已发现年轻患者的肉芽组织的相对量更高。与凸起和突起相比，还发现肉芽组织更多地存在于游离物和脱出物中。根据本发明使用的组合物可用于治疗所有所述形式的椎间盘突出，并且可特别用于治疗具有椎间盘脱出或游离的年轻患者。因此，在一个优选的方面，本发明提供如本发明所公开的组合物，其用于治疗或预防哺乳动物的椎间盘突出，其中所述治疗或预防包括减少或预防肉芽组织的形成，特别是其中所述椎间盘突出包括脱出型和/或游离型。
此外，术语“椎间盘突出症”包括以放射性疼痛和/或背部疼痛为特征的病症，这些病症被医生认为可能由椎间盘突出引起，有或没有放射学确认，例如，mri检查。此外，椎间盘突出症可位于脊柱的不同位置，所有这些都包括在该定义中，包括颈椎间盘、胸椎间盘和腰椎间盘的突出症。
根据本发明使用的组合物可以以各种方式给予患者，例如静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、口服、局部、直肠等。此外，组合物可以通过缓释装置给药，例如植入受试者体内的微渗泵。
例如，当组合物包含融合蛋白如阿巴西普、贝拉西普、asp2408或xpro9523、包括其组合时，可以按照本领域已知的方法给予所述化合物。例如，融合蛋白可以0.1-20mg/kg体重的剂量静脉内输注给药，例如0.5-20、1-20、5-20或5-15mg/kg体重，或更优选约10mg/kg体重。或者，对于体重低于60kg的患者，可以以500mg的剂量给予融合蛋白；对于60至100kg体重的患者为750毫克；或对于体重超过100kg的患者为1000毫克。初次静脉内给药后，可在第一次输注后2周和4周给予静脉输注，之后每4周给予一次静脉输注。
或者，组合物可以通过皮下注射给药，例如，每周一次125mg融合蛋白剂量。可以在有或没有静脉内负荷剂量的情况下开始这种治疗。对于以静脉内负荷剂量开始治疗的患者，可以通过单次静脉内输注开始治疗，然后在静脉输注的一天内施用第一次125mg皮下注射。
此外，可以配制组合物，使得它可以通过局部注射到椎间盘而以治疗有效量给药。
另一方面，本发明提供治疗或预防椎间盘突出症的方法，包括给予有此需要的哺乳动物，例如人，治疗有效剂量的t细胞活化抑制剂。本发明的该第二方面的效果和特征类似于上面关于本发明第一方面所述的那些。特别地，所述t细胞活化抑制剂优选是融合蛋白，例如阿巴西普或贝拉西普，其包含与ctla-4的细胞外结构域融合的免疫球蛋白igg1的fc区。
实施例
实施例1：初步研究，用阿巴西普治疗
将体重约225g的20只雌性sprague-dawley大鼠平均分成两组：椎间盘穿刺(dp，n＝10)和椎间盘穿刺+阿巴西普(dp+abatacept，n＝10)。在环境丰富的笼子中饲养大鼠，其能够自由获取食物和水。所有大鼠都进行与下述相同的外科手术。
通过吸入异氟烷诱导和维持麻醉。在手术前皮下给予单剂量0.05mg/kg丁丙诺啡
在诱导麻醉后，在腰椎和尾椎棘突上方的中线处形成约6cm的皮肤切口。切开腰椎左侧的脊柱肌肉以暴露左侧l4/l5小关节。移除左侧l4/l5小关节以暴露下面的硬膜囊、l4神经根和l4/l5椎间盘。然后使用23g针穿刺椎间盘。将少量空气(0.2-0.3ml)注入椎间盘以促进髓核的渗漏。然后缝合脊柱肌和胸腰筋膜，用金属夹闭合皮肤。
对于dp组，没有给予额外的治疗。对于dp+阿巴西普组，在紧接手术前腹膜内施用10mg/kg阿巴西普。在手术后7天和14天重复这一过程。
为了评估对突出样结节形态的影响，进行了宏观分析。手术21天后，再次通过吸入异氟烷诱导麻醉，然后通过切开心脏进行安乐死，使大鼠迅速流血至死亡。然后通过移除脊柱肌和l4和l5的椎弓来切开腰椎，暴露l4/l5椎间盘。由经验丰富的研究人员通过手术显微镜进行宏观分析。所收集的不同类型数据的描述见表1。
来自宏观分析的数据被认为是有序的。为了测试dp和dp+阿巴西普组之间的统计学显著性，进行mann-whitneyu-检验。显著性定义为p<0.05。
所有大鼠在手术中存活并且在整个研究中显示出良好的一般状况。在dp组中，10只大鼠中有8只显示出清楚或明显的椎间盘结节(表2)。在dp+阿巴西普组中，未发现清楚或明显的结节。结节大小的差异在两组之间是显著的(p＝0.000)。在dp+阿巴西普组中观察到的炎症也明显较少(p＝0.005)。还注意到较少的骨赘的趋势，但这种差异不显著(p＝0.143)。
实施例2：纵向评估结节大小，用阿巴西普治疗
本研究的目的是评估1)大鼠椎间盘穿刺后形成的结节如何随着时间的推移而变化；2)通过给予t细胞抑制剂阿巴西普是否可以抑制结节的形成；和3)通过施用t细胞抑制剂阿巴西普是否可以减少现有结节的大小。
将体重约225g的24只雌性sprague-dawley大鼠(n＝24)平均分成三组：对照组(未治疗，n＝8)；第0天开始的治疗组(n＝8)；和从第14天开始的治疗组(n＝8)。在环境丰富的笼子中饲养大鼠，其能够自由获取食物和水。所有大鼠都进行与下述相同的外科手术。
通过吸入异氟烷诱导和维持麻醉。在手术前皮下给予单剂量0.05mg/kg丁丙诺啡
在诱导麻醉后，在腰椎和尾椎棘突上方的中线处形成约6cm的皮肤切口。切开腰椎左侧的脊柱肌肉以暴露左侧l5/l6小关节。移除左侧l5/l6小关节以暴露下面的硬膜囊、l5神经根和l5/l6椎间盘。然后使用23g针穿刺椎间盘。将少量空气(0.2-0.3ml)注入椎间盘以促进髓核的渗漏。然后缝合脊柱肌和胸腰筋膜，用金属夹闭合皮肤。进行手术的研究人员对治疗组不知情。
所有大鼠在紧接手术前接受腹膜内注射，随后在整个研究期间每周接受一次腹膜内注射。对于不同的组，在不同时间段施用的化合物如表3中所示。
对于剂量计算，在整个研究期间假定所有大鼠的体重为225g。当不给予阿巴西普时，给予盐水用于致盲目的。在每次注射之前通过吸入异氟烷使大鼠短暂麻醉，以允许化合物的安全施用并使动物的疼痛和应激最小化。
为了评估椎间盘穿刺后椎间盘结节的大小，在手术后第1、2、4和8周用7tmri系统(bruker
使用具有150μm的各向同性体素的矢状位t2加权3drare序列。通过手动限定椎间盘强化的感兴趣区域(roi)来测量结节的体积，所述感兴趣区域在每个可以识别椎间盘的图像上相邻椎骨的最背侧面之间的纵向线的背侧。对于每个图像，roi内的体素的数量被评估三次。加上椎间盘每个矢状切面的平均体素数，然后乘以体素体积(0.003375mm3)，得到总结节尺寸，单位为mm3。除此之外，观察者还对每个mri进行结节大小的主观评估。收集数据的研究人员对治疗组不知情。
在研究结束时，除了mri测量之外还进行宏观分析。在手术后8周进行最终mri测量后，通过切开心脏使大鼠安乐死，同时仍然通过吸入异氟烷麻醉，使大鼠快速流血至死亡。通过移除脊柱肌和l5和l6的椎弓来解剖腰椎，暴露l5/l6椎间盘。通过手术显微镜进行结节大小的宏观评估。根据表1中的描述进行结节大小的评估。由于逻辑原因，观察者不对治疗组不知情。
所有大鼠在手术中存活并且在整个研究中显示出良好的一般状况。来自宏观分析的数据和来自mri的主观评估被认为是有序的。来自mri上的体积测量的数据被认为是连续的。进行mann-whitneyu-检验，统计学显著性定义为p<0.05。
mri测量的结果可以在图1和图2中找到。宏观分析的结果可以在图3中找到。在第4周和第8周，在所有类型的评估下，与对照相比，两个治疗组的结节都明显更小。此外，在第2周的“对照(无治疗)”和“第0天治疗开始”之间注意到通过主观评估确定的结节大小的显著差异。
总之，本研究的结果证实，当紧接在椎间盘穿刺前开始治疗时，阿巴西普的给药抑制了突出样结节的形成。此外，当椎间盘穿刺两周后开始用阿巴西普治疗时，两周内形成的突出样结节与对照组相比明显变小，表明阿巴西普也可在已经形成结节后还导致突出样结节缩小。这些结果与普遍接受的假设(即自身免疫和炎症有利于突出的再吸收)相反，而是暗示特异性抑制免疫系统，更具体地说是t细胞，可以引起再吸收并因此导致突出的收缩。
实施例3：结节大小和免疫组织化学的纵向评估，用对cd28介导的t细胞共刺激的特异性抑制剂治疗
本研究的目的是1)重现以前的结果，表明用cd28介导的t细胞共刺激的特异性抑制剂治疗可用于在实施例3所述的修饰动物模型中诱导和/或加速椎间盘突出的再吸收，和2)对由cd28介导的t细胞共刺激的特异性抑制剂治疗引起的突出样结节的特定形态学变化进行更详细的评估。
将体重约225g的48只雌性sprague-dawley大鼠平均分成三组：对照组(对照，n＝16)；低剂量治疗(t-ln＝16)；高剂量治疗(t-h，n＝16)。在环境丰富的笼子中饲养大鼠，其可以自由获取食物和水。所有大鼠经历与下述相同的外科手术。进行手术的研究人员对治疗组不知情。
通过吸入异氟烷诱导和维持麻醉。在手术前皮下给予单剂量0.05mg/kg丁丙诺啡
在诱导麻醉后，在腰椎和尾椎棘突上方的中线处形成约5cm的皮肤切口。从l3-l6水平的胸腰筋膜中切开。切开l4/5水平两侧的脊柱肌以及棘上和棘间韧带，以暴露椎板和l4/5处的层间空间。使用外科微钻在l4的尾部进行小的椎板切开术。然后使用23g针仔细切割暴露的硬膜囊。将针引入马尾，并通过用针探测识别下面的l4/5椎间盘。将椎间盘刺破并将少量空气(0.2ml)注入椎间盘以促进髓核的渗漏。然后取出针，缝合胸腰筋膜，用金属夹闭合皮肤。
通过腹膜内注射每周一次施用治疗化合物。
为了评估椎间盘穿刺后椎间盘结节的大小，使用7tmri系统
使用具有150μm的各向同性体素的矢状位t2加权3drare序列。通过手动限定椎间盘强化的感兴趣区域(roi)来测量结节的体积，所述感兴趣区域在每个可以识别椎间盘的图像上相邻椎骨的最背侧面之间的纵向线的背侧。对于每个图像，roi内的体素的数量被评估三次。加上椎间盘每个矢状切面的平均体素数，然后乘以体素体积(0.003375mm3)，得到总结节尺寸，单位为mm3。除此之外，观察者还对每个mri进行结节大小的主观评估。收集数据的研究人员对治疗组不知情。
在研究结束时，除了mri测量之外还进行宏观分析。在手术后8周进行最终mri测量后，通过切开心脏使大鼠安乐死，同时仍然通过吸入异氟烷麻醉，使大鼠快速流血至死亡。通过移除脊柱肌和l3至l6的椎弓来解剖腰椎，暴露下面的椎间盘。通过手术显微镜进行结节大小的宏观评估。根据表1中的描述进行结节大小的评估。
来自所有组的一些动物在第8周之前的不同时间点终止，以允许收获穿刺的椎间盘用于组织学和免疫组织化学评估。
该研究的结果支持靶向抑制t细胞活化，更具体地抑制cd28介导的共刺激，可通过诱导和/或加速突出的再吸收以及减少突出中的炎症来用于治疗椎间盘突出。
实施例4：用cd28介导的t细胞共刺激抑制剂治疗椎间盘突出症，患者情景
该实施例是虚构病例报告，旨在说明如何使用cd28介导的t细胞共刺激抑制剂治疗，并假设其在临床环境中治疗椎间盘突出症。
一名40岁的女性向初级护理机构提供了下腰痛和左腿坐骨神经痛6周的病史。她以前偶尔经历过背部疼痛，但在其它方面健康，且没有使用任何药物。她现在尝试了物理治疗，其对症状的缓解有限，并且由于症状的严重程度仍然无法工作。初级护理医生进行身体检查，发现患者的左腿对应于s1的皮区的感觉功能降低。左跟腱反射比右侧弱，并且她的左脚踝跖屈的强度降低。注意到左侧阳性laségue迹象，其疼痛分布对应于s1神经根。
初级护理医生怀疑腰椎间盘突出症并伴有左侧s1神经根的神经根病。进行转诊以对腰椎进行mri以确认诊断。患者还接受了对乙酰氨基酚和非甾体抗炎药的处方，以缓解症状。
四周后，患者接受了mri检查并返回初级护理机构进行重新评估。她的症状没有任何改善，每天使用处方镇痛药。mri确认l5/s1左侧椎间盘脱出，且左侧s1神经根变形。现在将转诊发送到脊柱诊所，在那里，患者在三周内接受新的门诊重新评估。
在脊柱诊所，患者确认过去两个月没有改善。通过身体评估和对mr图像的评估，脊柱诊所的医生得出结论，患者具有l5/s1椎间盘脱出，其症状与该发现相对应。由于症状没有自发改善，并且在排除禁忌症后，患者被提供并接受用抑制cd28介导的t细胞共刺激的药物治疗。脊柱诊所的护士向患者展示如何自我施用药物，例如皮下施用。
患者从当地药房拿药并通过根据说明施用药物而在家中开始治疗，例如每一周或两周一次。在开始治疗后2-3周，患者的症状开始改善，并且在6-8周后症状得到极大改善。在例如12周的总治疗时间之后，治疗结束。
在开始治疗后6个月的随访mri中，仍有可见的脱出，但其尺寸明显减小，相邻的神经根不再受影响。患者仍然没有症状。
表1
在宏观分析中收集的变量。
表2
宏观分析的结果。表1中限定的变量。
表3
评估结节尺寸的研究的概述。abat.＝阿巴西普。
参考文献
1.brisby,h.,pathologyandpossiblemechanismsofnervoussystemresponsetodiscdegeneration.jbonejointsurgam,2006.88suppl2:p.68-71。
2.kuslich,s.d.,c.l.ulstrom,andc.j.michael,thetissueoriginoflowbackpainandsciatica:areportofpainresponsetotissuestimulationduringoperationsonthelumbarspineusinglocalanesthesia.orthopclinnortham,1991.22(2):p.181-7。
3.mulleman,d.等人,pathophysiologyofdisk-relatedsciatica.i.--evidencesupportingachemicalcomponent.jointbonespine,2006.73(2):p.151-8。
4.olmarker,k.,b.rydevik和c.nordborg,autologousnucleuspulposusinducesneurophysiologicandhistologicchangesinporcinecaudaequinanerveroots.spine(philapa1976),1993.18(11):p.1425-32。
5.olmarker,k.等人,ultrastructuralchangesinspinalnerverootsinducedbyautologousnucleuspulposus.spine(philapa1976),1996.21(4):p.411-4。
6.byrod,g.等人,earlyeffectsofnucleuspulposusapplicationonspinalnerverootmorphologyandfunction.eurspinej,1998.7(6):p.445-9。
7.olmarker,k.和k.larsson,tumornecrosisfactoralphaandnucleus-pulposus-inducednerverootinjury.spine(philapa1976),1998.23(23):p.2538-44。
8.risbud,m.v.和i.m.shapiro,roleofcytokinesinintervertebraldiscdegeneration:painanddisccontent.natrevrheumatol,2014.10(1):p.44-56。
9.kadow,t.等人,molecularbasisofintervertebraldiscdegenerationandherniations:whataretheimportanttranslationalquestions？clinorthoprelatres,2015.473(6):p.1903-12。
10.korhonen,t.等人,thetreatmentofdisc-herniation-inducedsciaticawithinfliximab:one-yearfollow-upresultsoffirstii,arandomizedcontrolledtrial.spine(philapa1976),2006.31(24):p.2759-66。
11.freeman,b.j.等人,randomized,double-blind,placebo-controlled,trialoftransforaminalepiduraletanerceptforthetreatmentofsymptomaticlumbardischerniation.spine(philapa1976),2013.38(23):p.1986-94。
12.desouzagrava,a.l.,l.f.ferrari和h.l.defino,cytokineinhibitionandtime-relatedinfluenceofinflammatorystimulionthehyperalgesiainducedbythenucleuspulposus.eurspinej,2012.21(3):p.537-45。
13.cuellar,j.m.等人,cytokineexpressionintheepiduralspace:amodelofnoncompressivedischerniation-inducedinflammation.spine(philapa1976),2013.38(1):p.17-23。
14.takahashi,h.等人,inflammatorycytokinesintheherniateddiscofthelumbarspine.spine(philapa1976),1996.21(2):p.218-24。
15.andrade,p.等人,elevatedil-1betaandil-6levelsinlumbarherniateddiscsinpatientswithsciaticpain.eurspinej,2013.22(4):p.714-20.
16.pennington,j.b.,r.f.mccarron和g.s.laros,identificationofigginthecanineintervertebraldisc.spine(philapa1976),1988.13(8):p.909-12。
17.satoh,k.等人,presenceanddistributionofantigen-antibodycomplexesintheherniatednucleuspulposus.spine(philapa1976),1999.24(19):p.1980-4。
18.capossela,s.等人,degeneratedhumanintervertebraldiscscontainautoantibodiesagainstextracellularmatrixproteins.eurcellmater,2014.27:p.251-63；discussion263。
19.geiss,a.等人,autologousnucleuspulposusprimestcellstodevelopintointerleukin-4-producingeffectorcells:anexperimentalstudyontheautoimmunepropertiesofnucleuspulposus.jorthopres,2009.27(1):p.97-103。
20.pedersen,l.m.等人,serumlevelsofthepro-inflammatoryinterleukins6(il-6)and-8(il-8)inpatientswithlumbarradicularpainduetodischerniation:a12-monthprospectivestudy.brainbehavimmun,2015。
21.yasuma,t.,k.arai和y.yamauchi,thehistologyoflumbarintervertebraldischerniation.thesignificanceofsmallbloodvesselsintheextrudedtissue.spine(philapa1976),1993.18(13):p.1761-5。
22.kokubo,y.等人,herniatedandspondyloticintervertebraldiscsofthehumancervicalspine:histologicalandimmunohistologicalfindingsin500enblocsurgicalsamples.laboratoryinvestigation.jneurosurgspine,2008.9(3):p.285-95。
23.matsui,y.等人,theinvolvementofmatrixmetalloproteinasesandinflammationinlumbardischerniation.spine(philapa1976),1998.23(8):p.863-8；discussion868-9。
24.matveeva,n.等人,histologicalcompositionoflumbardischerniationsrelatedtothetypeofherniationandtotheage.bratislleklisty,2012.113(12):p.712-7。
25.lee,j.y.等人,histologicalstudyoflumbarintervertebraldischerniationinadolescents.actaneurochir(wien),2000.142(10):p.1107-10。
26.winkler,d.等人,doeshistologypredicttheclinicaloutcomeafterlumbarintervertebraldischerniation:no.medhypotheses,2013.80(3):p.215-9。
27.jensen,t.s.等人,naturalcourseofdiscmorphologyinpatientswithsciatica:anmristudyusingastandardizedqualitativeclassificationsystem.spine(philapa1976),2006.31(14):p.1605-12；discussion1613。
28.takada,e.,m.takahashi和k.shimada,naturalhistoryoflumbardischerniawithradicularlegpain:spontaneousmrichangesoftheherniatedmassandcorrelationwithclinicaloutcome.jorthopsurg(hongkong),2001.9(1):p.1-7。
29.splendiani,a.等人,spontaneousresolutionoflumbardiskherniation:predictivesignsforprognosticevaluation.neuroradiology,2004.46(11):p.916-22。
30.henmi,t.等人,naturalhistoryofextrudedlumbarintervertebraldischerniation.jmedinvest,2002.49(1-2):p.40-3。
31.genevay,s.等人,influenceofcytokineinhibitorsonconcentrationandactivityofmmp-1andmmp-3indischerniation.arthritisresther,2009.11(6):p.r169。
32.seo,j.y.等人,three-dimensionalanalysisofvolumetricchangesinherniateddiscsofthelumbarspine:doesspontaneousresorptionofherniateddiscsalwaysoccur？eurspinej,2016.25(5):p.1393-402。
33.chiu,c.c.等人,theprobabilityofspontaneousregressionoflumbarherniateddisc:asystematicreview.clinrehabil,2015.29(2):p.184-95。
34.elliott,d.m.等人,theeffectofrelativeneedlediameterinpunctureandshaminjectionanimalmodelsofdegeneration.spine(philapa1976),2008.33(6):p.588-96。
35.keorochana,g.等人,theeffectofneedlesizeinducingdegenerationintheratcaudaldisc:evaluationusingradiograph,magneticresonanceimaging,histology,andimmunohistochemistry.spinej,2010.10(11):p.1014-23。
36.zhang,h.等人,timecourseinvestigationofintervertebraldiscdegenerationproducedbyneedle-stabinjuryoftheratcaudalspine:laboratoryinvestigation.jneurosurgspine,2011.15(4):p.404-13。
37.grunert,p.等人,assessmentofintervertebraldiscdegenerationbasedonquantitativemagneticresonanceimaginganalysis:aninvivostudy.spine(philapa1976),2014.39(6):p.e369-78。
38.olmarker,k.,punctureofadiscandapplicationofnucleuspulposusinducesdischerniation-likechangesandosteophytes.anexperimentalstudyinrats.openorthopj,2011.5:p.154-9。
39.carragee,e.j.等人,2009isslsprizewinner:doesdiscographycauseacceleratedprogressionofdegenerationchangesinthelumbardisc:aten-yearmatchedcohortstudy.spine(philapa1976),2009.34(21):p.2338-45。
40.olmarker,k.,formationofnucleuspulposus-induceddischernia-likenodulesonthediscsurfaceisnotinducedbytnf.theinternetjournalofspinesurgery,2009.5(2):p.1-5。
41.smith-garvin,j.e.,g.a.koretzky,andm.s.jordan,tcellactivation.annurevimmunol,2009.27:p.591-619。
42.sansom,d.m.,cd28,ctla-4andtheirligands:whodoeswhatandtowhom？immunology,2000.101(2):p.169-77。
43.oshima,s.等人,immunosuppressiveeffectofasp2408,anovelcd86-selectivevariantofctla4-ig,inratsandcynomolgusmonkeys.intimmunopharmacol,2016.40:p.310-317。
44.oshima,s.等人,asp2408andasp2409,novelctla4-igvariantswithcd86-selectiveligandbindingactivityandimprovedimmunosuppressivepotency,createdbydirectedevolution.proteinengdessel,2016.29(5):p.159-67。
45.zhu,t.等人,pharmacokinetics,pharmacodynamics,safety,andtolerabilityofasp2408,apotentselectivet-cellcostimulationmodulatoraftersingleandmultipleascendingdosesinhealthyvolunteersandrapatients.clinpharmacoldrugdev,2016.5(5):p.408-25。
46.bernett,m.j.等人,immunesuppressionincynomolgusmonkeysbyxpro9523:animprovedctla4-igfusionwithenhancedbindingtocd80,cd86andneonatalfcreceptorfcrn.mabs,2013.5(3):p.384-96。
47.poirier,n.等人,preclinicalefficacyandimmunologicalsafetyoffr104,anantagonistanti-cd28monovalentfab'antibody.amjtransplant,2012.12(10):p.2630-40。
48.poirier,n.等人,fr104,anantagonistanti-cd28monovalentfab'antibody,preventsalloimmunizationandallowscalcineurininhibitorminimizationinnonhumanprimaterenalallograft.amjtransplant,2015.15(1):p.88-100。
49.poirier,n.等人,first-in-humanstudyinhealthysubjectswithfr104,apegylatedmonoclonalantibodyfragmentantagonistofcd28.jimmunol,2016.197(12):p.4593-4602。
50.fardon,d.f.等人,lumbardiscnomenclature:version2.0:recommendationsofthecombinedtaskforcesofthenorthamericanspinesociety,theamericansocietyofspineradiologyandtheamericansocietyofneuroradiology.spinej,2014.14(11):p.2525-45。
- 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞！